专利名称：计算机辅助β-1,4-内切木聚糖酶(Aus Xyn11A)热稳定性的定向改造的制作方法
技术领域：
本发明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的常温木聚糖酶 (Aus XynllA)基因进行热稳定性的定向改造，杂合木聚糖酶工程菌的构建及重组杂合木聚糖酶的高效表达的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
β-1,4-内切木聚糖酶(endo-^-l,4-xylanase, EC 3. 2. 1.8)，它能从木聚糖主链的内部随机切割木糖苷键，将其降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖，是木聚糖降解酶中最关键的酶。近几年，由于木聚糖酶在饲料工业、食品加工及能源等行业具有潜在的工业应用和经济价值，尤其是在造纸工业上的应用，减少因漂白产生的环境污染，受到了越来越多的关注。然而在工业应用中经常遇到的极端环境，如纺织、造纸工业中的高温条件，已成为木聚糖酶发展的瓶颈。因此对木聚糖酶耐热性的研究也引起了国内外研究者的高度重视。 开发耐热性木聚糖酶的研究主要包括筛选产耐热木聚糖酶的微生物菌株和利用基因工程对酶分子进行定向改造，相对于筛菌技术的盲目性，后者具有更强的针对性。根据对催化区的保守氨基酸和疏水簇的分析，木聚糖酶属于糖苷水解酶(GH)第 5、第7、第8、第10、第11和第43家族，其中大部分属于第10和第11家族。由于G/11家族的木聚糖酶分子的分子量较小，并且结构相对简单，比较适合作为理论研究的分子模型，以及用于极端条件下木聚糖酶催化模式系统及蛋白质分子折叠机理等的研究。基因工程技术和生物信息学以及计算机科学的快速发展，为分子生物学的研究开辟了新的前景。我们可以运用大规模高性能的计算机及其相关软件，利用计算机模拟试验对酶分子进行定向改造提高其热稳定性，然后使用基因工程的手段对木聚糖酶的进行改造，以加速木聚糖酶在各种领域中的应用过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用计算机技术与生物信息学相结合的方法对常温的木聚糖酶进行理性设计，并运用基因工程的方法构建产耐热杂合木聚糖酶的工程菌。已从 A.usamii发酵曲中分离纯化了一种11家族木聚糖酶蛋白(Aus XynllA)，并对酶基因(Aus xynllA)进行了克隆和表达(Genbank :DQ302412)。Aus XynllA最适作用温度50°C，且催化活性较高，如若提高其热稳定性，则该酶有较大的工业化生产和潜力以及较高的经济价值。本发明的技术方案通过以耐热木聚糖酶为模板，对常温木聚糖酶Aus XynllA进行定向改造，得到耐热杂合木聚糖酶EvAus XynllA,其mRNA序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO :2。A. usamii EOOl菌株由江南大学筛选和保藏，已于2005年在《食品与发酵工业》杂志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。所述的重组木聚糖酶的活性测定方法
于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4. 6、柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制的质量浓度为0.5%的桦木木聚糖(Sigma，USA)溶液2. 4mL，50°C预热lOmin，在A管中加入0. ImL 适当稀释的酶液，50°C准确反应15min;立即各加入2. 5mL 3' ,5' - 二硝基水杨酸(DNS) 试剂，在B管中再补加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷却后各加去离子水5mL，摇勻； 540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖 (以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义在本测定条件下，以每分钟产生 1 μ mol还原糖所需的酶量定义为1个木聚糖酶活性单位(IU)。耐热杂合木聚糖酶基因的设计、克隆及表达(1)同源建模模拟Aus XynllA的空间结构登录蛋白质结构数据库ftOtein data bank (http //rcsb. org),经BLAST比对，找到与Aus XynllA具有高度同源的耐热木聚糖酶序列。本实验选择具有非常高的热稳定性的木聚糖酶EvXynATS(Protein Data Bank登录号为2VUL，本实验室已经合成这段基因序列)为模板，并且两者的同源性为63. 21%，运用 SWISS-MODEL服务器在线全自动为Aus XynllA构建空间结构。运用软件Verify_3D对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性较高的空间结构模型。其中，由于Aus XynllA 存在一段长度为37个氨基酸的信号肽，因此在同源建模过程中去掉这一段序列，为了保证后续分子动力学研究的准确性，需要充分评估建模获得的三级结构的可靠性。(2)利用分子动力学(Molecular Dynamics,MD)模拟的方法理性设计耐热杂合基因使用GR0MACS4. 0软件对由(1)得到的Aus XynllA空间结构和耐热型EvXynATS分别进行分子动力学模拟。采用的力场是GR0M0S96力场，该力场中蛋白的立场参数数据均给予实验值拟合。模拟温度为300K，溶剂采用TIP3P水模型。对于每个模拟体系，均在溶质外围加上1.5nm的水分子层。MD模拟之前，对体系分别进行了两次能量优化，首先约束溶质，用最陡下降法优化800步，再用共轭梯度法优化1200步。然后去约束后再进行800步最陡下降法优化，1200步共轭梯度法优化。MD模拟分为两步首先进行20ps的约束溶质分子的MD 模拟；而且温度从OK逐步升高到300K，接着进行500ps的无约束恒温MD模拟。最后得到其总体能量，RMSD值及Aus XynllA各个氨基酸的B_factor值。(3)杂合基因EvAus xynllA及其表达质粒的构建根据GenBank上EvXynATS基因序列(登录号为EU591743)及AusxynlIA设计引物XynllAsc-F 5' -GAATTCAACGCTCAAACTTGTCTTACC-3‘，含 EcoR I 酶切位点XynllAsc-Rl 5' -TCCACTGCCTGGTGGACGCCAACTACC-3’，含公共序列XynllAsc-Fl 5' -CGTCCACCAGGCAGTGGAGGCACATAC-3’，含公共序列XynllAsc-R 5' -GCGGCCGCTTACTGAACAGTGATGGACG-3‘，含 Not I 酶切位点以本实验保存的 pUCm-T-EvXynATS 为模板，以 Xynl IAsc-F 和 Xynl IAsc-Rl 为引物进行第一轮PCR ；以pUCm-T-Aus xynllA(实验室保藏)为模板，以XynllAsc-Fl和 XynllAsc-R为引物进行第二轮PCR;将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，纯化后混合、在无引物的情况进行第三轮PCR;以第三轮PCR反应液为模板，以XynllAsc-F和 XynllAsc-R为引物进行第四轮PCR(图1)。将第四轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析， 割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-EvAus xynllA)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序结果正确的pUCm-T-EvAus xynllA与pPIC9K质粒均用EcoR I和NotI进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒 pPIC9K-EvAus xynllA(图2)，并对重组表达质粒进行序列测定。(4)GS115/EvAusxynllA重组子的构建、表达及酶活的测定用Sal I对 pPIC9K-EvAus xynllA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/EvAUSXynllA ；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定重组木聚糖酶活性。
图1 获取杂合EvAus xynllA基因序列的流程2 重组质粒pPIC9K_EvAus xynllA的构建示意图
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例1同源建模模拟Aus XynllA及其杂合蛋白的空间结构登录蛋白质结构数据库ftOteindata bank(http//rcsb. org),经BLAST 比对，找到与Aus XynllA具有高度同源序列。本实验选择具有非常高的热稳定的EvXynWProtein Data Bank登录号为2VUL)为模板，并且两者的同源性为63. 21%，运用SWISS-MODEL服务器在线全自动为Aus XynllA构建空间结构。运用软件Verify_3D对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性较高的空间结构模型。实施例2利用分子动力学模拟的方法理性设计耐热杂合基因分别对通过同源建模获得的野生型Aus XynllA的晶体结构和耐热型EvXynATS进行分子动力学模拟。主要包括以下几步首先我们对空间结构进行预处理，使用GR0MACS中的pdb2gmx命令添加所有缺失的氢原子，并输出一个包含所有原子信息的.gro文件。该命令的格式为pdb2gmx-f llbs.pdb-o libs, gro-p libs, top-ignh-ter第二步利用GR0MACS中的editconf和genbox命令为Aus XynllA空间结构添加适当的水溶液来模拟Aus XynlIA在水溶液中的运动。其中溶剂采用TIP3P水模型，对于模拟的体系，在溶质外围加上1. 5nm的水分子层。其具体过程是首先使用editconf 命令定义盒子的大小，然后用genbox命令读入GR0MACS的结构文件，并读入水盒子的大小，输出文件包含分子文件和水盒子。同时genbox更改原来的top文件，使其含有水分子。该命令的格式为Editconf-f libs. gro_o llbs_box. gro-bt cubic-d 1. 5Genbox-cp llbs_box. gro-cs-p libs, top-o llbs_water. gro第三步用金属离子平衡体系的电荷，命令格式为grompp-f em. mdp-c llbs_water_ion. gro-p libs, top-o minimize—water, tprgenion-s minimize—water. tpr_o llbs_water_ion. gro-p libs.top-pname Na+_np 10-random-gtrp—ion· loggenion-s minimize—water. tpr~o libs—water—ion. gro-p libs, top-nname CL-
6-nn l-random-gtrp_ion. log并且需要手动对得到的llbs_Water_i0n. gro与libs, top文件中的原子数目进行修改，与添加的金属离子相匹配。第四步分别利用grompp和mdrim两个命令进行能量最小化处理。首先约束溶质， 用最陡下降法优化800步，再用共轭梯度法优化1200步。然后去约束后再进行800步最陡下降法优化，1200步共轭梯度法优化。命令格式为grompp-f emstl. mdp-c 1lbs_water_ion. gro-ρ libs.top-o minimize—water, tprmdrun _s minimize—water, tpr _o minimize—water, trr _c minimize— water, gro —eminimize—water, edr-g minimize—water, loggrompp-f emst. mdp-c minimize—water· gro_p libs, top-o minimize—water· tprmdrun _s minimize—water, tpr _o minimize—water, trr _c minimize— water2. gro —eminimize—water, edr -g minimize—water, log第五步分子动力学模拟分为两步，首先进行20ps的约束溶质的MD模拟；而且模拟温度从OK逐步升高到300K然后进行500ps的无约束恒温MD模拟。命令格式为grompp-f pr. mdp-c minimize—water2. gro_p libs, top-o minimize—waterL tprmdrun-s minimize—waterL tpr_o minimize—water 1. trr_c minimize—waterL gro—eminimize—waterL edr-g minimize—waterL loggrompp-f full, mdp _c minimize—waterL gro_p libs, top-o minimize—water2. tprmdrun _s minimize—water2. tpr_o minimize—water2. trr _c minimize—water3. gro—eminimize—water2. edr-g minimize—water2. log最后得到其总体能量，RMSD值及Aus XynllA各个氨基酸的B_factor值。命令格式为g_rms-s minimize—waterL tpr-f minimize—waterL trr_o rms. xvgxmgrace-nxy rms. xvgg_rmsf-s minimize_water2. tpr-f minimize_water2. trr~b 400_e 600~o rmsf. xvg-oq 1. pdbxmgrace-nxy rmsf. xvgg—energy-f minimize—water2_o energy, xvgxmgrace-nxy energy, xvg我们分别将MD得到的Aus XynllA和已知的EvXynATS各个氨基酸的B-factor 值导入到PDB文件中，使用B-FITTER软件导出各个氨基酸的B-factor值，由图可以看出 EvXynATS序列中各氨基酸的柔性较小，波动幅度较为平均，而Aus XynllA序列尤其是N端较为不稳定，可通过N端序列替换方法进行分子改造。我们分别随机的将Aus XynllA的N 端分别用EvXynATS相应的序列进行替换改造，然后我们以EvXynATS为模板，分别对杂合木聚糖酶进行同源建模，运用分子动力学模拟方法分别对杂合蛋白进行总体能量及RMSD值的计算。由结果我们得出将Aus XynllA的N端96个氨基酸由EvXynATS&N端102个氨基酸替换时，其总体能量和RMSD值最小，即热稳定性最好。
实施例3杂合基因EvAus xynllA及其表达质粒的构建采用重叠PCR技术构造融合基因EvAus xynllA，主要分为四步以XynllAsc-F和 XynllAsc-Rl 为引物进行第一轮 PCR(94°C 2min ；30 个循环，94°C 30s, 54°C 30s, 72°C 30s ； 72°C IOmin)；以 XynllAsc-Fl 和 XynllAsc-R 为引物进行第二轮 PCR(94°C 2min ；30 个循环， 940C 30s,54°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin)；将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带，分别纯化后混勻，在无引物的条件下进行第三轮PCR(94°C 2min ；10个循环，94°C 30s, 50°C 30s,72°C 45s ；72°C IOmin)；以第三轮 PCR 反应液为模板，以 XynlIAsc-F 和 Xyn 1 IAsc-R 为引物进行第四轮 PCR(94°C 2min ；30 个循环，94°C 30s，54°C 30s, 72°C 45s ； 72°C IOmin)。将第四轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T 连接(pUCm-T-EvAus xynllA)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序正确的pUCm-T-EvAus xynllA与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-EvAus xynllA,并对重组表达质粒进行序列测定。实施例4 GS115/EvAus xynllA重组子的构建、表达及酶活的测定用Ml I对pPIC9K-EvAus xynllA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/EvAUSXynllA。该工程菌用1.0%甲醇诱导 96h,DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达5IU/mL。酶学性质分析结果表明该重组木聚糖酶最适作用温度60°C。
权利要求
1.一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的木聚糖酶(Aus XynllA)与耐热木聚糖酶EvXynATS的耐热杂合木聚糖酶EvAus Xynl 1A，其核苷酸序列对应于序列表中的 SEQ ID NO 1。
2.由权利要求1所述的耐热杂合木聚糖酶基因(EvAusxynllA)编码的耐热木聚糖酶 (EvAus XynllA)，其完整的氨基酸序列对应于序列表中的SEQ ID NO :2。
3.理性设计耐热杂合基因使用GR0MACS4. 0软件分别对通过同源建模获得的野生型Aus XynllA的晶体结构和耐热型EvXynATS进行分子动力学模拟，主要包括以下几步采用的力场是GR0M0S96力场，该力场中蛋白的立场参数数据均给予实验值拟合，模拟温度为300K，溶剂采用TIP3P水模型；对于每个模拟体系，均在溶质外围加上1. 5nm的水分子层；MD模拟之前，对体系分别进行了两次能量优化，首先约束溶质，用最陡下降法优化800步，再用共轭梯度法优化1200步；然后去约束后再进行800步最陡下降法优化，1200步共轭梯度法优化；MD模拟分为两步首先进行20ps的约束溶质分子的MD模拟；而且温度从OK逐步升高到300K，接着进行500ps的无约束恒温MD模拟；最后得到其总体能量，RMSD值及Aus XynllA各个氨基酸的B_factor 值；分别将MD得到的Aus XynllA和已知的EvXynATS各个氨基酸的B_factor值导入到PDB 文件中，使用B-FITTER软件导出各个氨基酸的B-factor值，由图可以看出EvXynATS序列中各氨基酸的柔性较小，波动幅度较为平均，而Aus XynllA序列尤其是N端较为不稳定，可通过N端序列替换方法进行分子改造；分别随机的将Aus XynllA的N端分别用EvXynATS相应的序列进行替换改造，然后我们以EvXynATS为模板，分别对杂合木聚糖酶进行同源建模， 运用分子动力学模拟方法分别对杂合蛋白进行总体能量及RMSD值的计算；由结果我们得出将Aus XynllA的N端96个氨基酸由EvXynATS的N端102个氨基酸替换时，其总体能量和RMSD值最小，即热稳定性最好。
4.融合基因EvAusxynllA序列的获取方法根据GenBank上EvXynATS基因序列(登录号为ETO91743)及Aus xynllA设计引物Xyn IlAsc-F 5' -GAATTCAACGCTCAAACTTGTCTTACC-3‘，含 EcoR I 酶切位点Xyn IlAsc-Rl 5' TCCACTGCCTGGTGGACGCCAACTACC-3’，含公共序列Xyn IlAsc-Fl 5' -CGTCCACCAGGCAGTGGAGGCACATAC-3’，含公共序列Xyn IlAsc-R 5' -GCGGCCGCTTACTGAACAGTGATGGACG-3‘，含 Not I 酶切位点采用重叠PCR技术构造融合基因EvAus xynllA，主要分为四步以XynlIAsc-F和 XynllAsc-Rl 为引物进行第一轮 PCR(94°C 2min ；30 个循环，94°C 30s, 54°C 30s, 72°C 30s ； 72°C IOmin)；以 XynllAsc-Fl 和 XynllAsc-R 为引物进行第二轮 PCR(94°C 2min ；30 个循环， 940C 30s,54°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin)；将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带，分别纯化后混勻，在无引物的条件下进行第三轮PCR(94°C 2min ；10个循环，94°C 30s, 50°C 30s,72°C 45s ；72°C IOmin)；以第三轮 PCR 反应液为模板，以 XynlIAsc-F 和 Xyn 1 IAsc-R 为引物进行第四轮 PCR(94°C 2min ；30 个循环，94°C 30s，54°C 30s, 72°C 45s ； 72°C IOmin)；将第四轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，目的条带经克隆、测序，得到融合基因EvAus xynllA序列。
5.EvAus XynllA工程菌的构建和表达方法(1)含EvAusxynllA基因的表达质粒的构建将测序正确的PUCm-T-EvAus xynllA与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切， 回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-EvAus xynllA, 并对重组表达质粒进行序列测定；(2)GS115/EvAusxynllA 的构建、表达及活性测定用 Sal I 对 pPIC9K_EvAus xynllA 进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子 GS115/EvAus xynllA ；该工程菌用1. 0%甲醇诱导96h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达5IU/mL ；该重组木聚糖酶最适作用温度60°C。
全文摘要
本发明提出了一种通过计算机技术与生物信息学相结合的手段获得耐热杂合木聚糖酶EvAus Xyn11A的方法，其核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。本发明公开了利用分子动力学模拟理性设计耐热杂合基因的方法，并通过重叠PCR获得了这一杂合基因EvAus xyn11A；此外本发明还公开了EvAus Xyn11A工程菌的构建以及重组EvAus Xyn11A异源表达的方法，制备的重组EvAus Xyn11A的最适作用温度60℃，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
文档编号C12N1/19GK102492676SQ20111041049
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者张慧敏, 李剑芳, 殷欣, 汪俊卿, 邬敏辰 申请人:江南大学