专利名称：一种便于实现蛋白质天然n端表达的毕赤酵母表达载体的构建和使用方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种便于实现蛋白质天然N端表达的毕赤酵母表达载体的构建方法及应用示范。
背景技术：
随着分子生物学及基因工程技术的快速发展，目前外源蛋白已经能够成功的在大肠杆菌、昆虫细胞甚至哺乳类细胞中进行表达，虽然这些表达系统已经被广泛的研究和应用，但依然存在着许多缺点和不足。与之相比，毕赤酵母生长周期较短，遗传操作简单，具备真核细胞蛋白合成通路，能够对蛋白质进行真核修饰(蛋白质加工、折叠、翻译后修饰等)， 同时，毕赤酵母能在简单培养基上进行高密度生长，即使在大规模发酵中，其包含的重组元件遗传能够稳定遗传，并且表达后的蛋白质易于纯化，因此近年来毕赤酵母已成为外源蛋白表达的优选系统之一。由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。典型的毕赤酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括 5' AOXl启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记 (His4或kocin)、3 ‘ AOXl基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分PBR322质粒或COLEl序列。如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插入了分泌作用的信号肽序列。在这个分泌信号的引导下， 外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。pPIC9K是一种分泌性毕赤酵母表达载体，包含5' AOXl启动子片段、多克隆位点 (MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4)、3' AOXl基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还含有PBR322序列。该质粒在多克隆位点的前面包含有能够起到分泌作用的信号肽序列。在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。 Kex2和Stel3酶在信号肽切割过程中起到主要作用，Kex2能够Lys-Arg序列后进行切割， Stel3则能够在Glu-Ala序列后进行切割。由于的切割效率不高以及酶切位点选择的原因，使得加工后的蛋白质N端常会带有6-8个额外的氨基酸序列，由于这些额外的氨基酸可能会对某些酶的活性(如抗菌肽)产生影响，因此为实现蛋白质的天然N端表达，通常会选用信号肽中的》ιο I作为目的序列的连接位点。但由于pPIC9K中含有两处B10 I酶切位点，因此使得在蛋白质天然N端表达质粒的构建过程较为繁琐。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定、高效的毕赤酵母表达载体，该载体能够简化蛋白质天然N端表达质粒的构建过程。为实现上述目的，本发明的技术方案提供了一种毕赤酵母表达载体pPIC9KM，所述表达载体能够便于实现蛋白质天然N端表达，其特征在于，所述表达载体是基于同尾酶原理由载体PPIC9K改造而来，并仅含有单一的Β ο I酶切位点，pPIC9KM结构如图1所示。本发明公开了 pPIC9KM的构建方法(图2)，具体包括以下步骤1)引物设计及基因扩增a.根据pPIC9K中卡那抗性基因处Β ο I及Sph I中间的序列设计一对正反向引物 KanF 和 KanR，KanF 5' -GTCGACCAAGACGTTTCCC-3‘ (SEQ ID NO 1)；KanR 5' -GTGCATGCAAGGAGATGGC-3‘ (SEQ ID NO 2)；其中KanF的5'端包含一个Ml I酶切位点(下划线所示)，KanR的5'端包含一个Sph I酶切位点(下划线所示)，为构建质粒提供连接端。b.在KanF和KanR的作用下，以pPIC9K质粒为模板扩增出KanXS片段并连至 pUCm-T载体上，新载体命名为pUCm-T-KanXS。2)pPIC9K 质粒的 Xho I 和 Sph I 酶切a.对PPIC9K载体进行限时酶切，纯化酶切后的大片段并使用Sph I进行充分酶切。琼脂糖凝胶电泳获得质粒的大片段。b.对pUCm-T-KanXS载体使用Ml I和Sph I进行双酶切，并回收约为320bp的片段。c.使用T4DNA连接酶对以上两步获得的片段进行连接，得到新载体pPIC9KM。3)使用B10 I对改造后的载体pPIC9KM进行单酶切验证。本发明还公开了 pPIC9KM质粒的使用方法。具体包括以下步骤1)引物设计及目的基因的扩增a.为实现蛋白质的天然N端表达，我们合成一段寡聚核苷酸序列 CTCGAGAAAAGA(SEQ ID NO :3)添加至目的基因的正向引物前，该序列包含一个Bio I酶切位点(下划线所示)。此外根据目的基因的序列设计反向引物，并在该引物后引入EcoR I、 AvrII或者Not I限制性内切酶酶切位点，为构建质粒提供连接端。b.使用设计好的正反向引物以目的基因为模板进行PCR，并连接至pUCm-T载体中。2)天然N端表达载体的构建a.对包含目的基因的pUCm-T载体及pPIC9KM使用Xho I及能识别反向引物酶切位点的限制性内切酶进行双酶切，分别回收目的基因及线性化的pPIC9KM质粒片段，并使用 T4 DNA连接酶进行连接。b.对包含目的基因的pPIC9KM进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子；按照手册上的标准流程进行诱导表达获得为天然N端的目的蛋白。
图1 质粒pPIC9KM的结构示意图
图2 质粒pPIC9KM的构建流程图
具体实施例方式本发明中所涉及的生物材料均为已公开或商品化的材料，具体可通过以下方式获得载体pPIC9K 购于 Novagen 公司；载体pUCm-T 购自上海生工生物工程公司；以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例1质粒pPIC9KM的构建质粒pPIC9KM的构建流程如图2，具体步骤如下1)根据pPIC9K中卡那抗性基因处Bio I及Sph I中间的序列设计一对正反向引物 KanF 和 KanR，KanF 5' -GTCGACCAAGACGTTTCCC-3‘ (SEQ ID NO. 1)；KanR 5' -GTGCATGCAAGGAGATGGC-3‘ (SEQ ID NO. 2)；其中KanF的5 ‘端包含一个Ml I酶切位点(下划线所示)，KanR的5 ‘端包含一个Sph I酶切位点(下划线所示)。在KanF和KanR的作用下，以pPIC9K质粒为模板扩通过 PCR 增出 KanXS 片段(94°C 3min ；30 个循环，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin)。将 PCR产物用0. 7 %琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-KanXS)，转化大肠杆菌JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。2)对pPIC9K载体进行10min、20min、30min及40min的限时酶切过程，使用0. 7% 琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果并回收大小约为9. 3kb的大片段。其后对所获得的大片段并使用Sph I酶切4h，使用0.7%琼脂糖凝胶电泳回收大小约为9. 01Λ的大片段。对 pUCm-T-KanXS载体使用Ml I和Sph I进行双酶切，使用0. 7%琼脂糖凝胶电泳并回收大小约为320bp的小片段。使用T4DNA连接酶对以上两步获得的片段进行连接，转化大肠杆菌DH5 α。使用B10 I对改造后的载体pPIC9KM进行单酶切验证。实施例2宇佐美曲霉第10家族木聚糖酶天然N端表达质粒的构建及异源表达1)合成引物 XynCF2 5 ‘ -CTCGAGAAAAGACAGGCTTCAGTGAGTATTGA-3 ‘、XynCR2 5 ‘ -GCGGCCGCCTAGAGAGCATTTGCGATAG-3 ‘，下划线所示分别为Β ο I和Not I酶切位点。以载体pUCm-T-AusxynlOA质粒为模板，PCR获得木聚糖酶基因AusxynlOA(94°C 3min ；30个循环，94°C 30s, 56°C 30s，72°C Imin ；72°C IOmin)将 PCR 产物用 0. 7%琼脂糖凝胶电泳分析， 回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-AusxynlOA')，转化大肠杆菌JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。2)将测序正确的 pUCm-T-AusxynlOA ‘与 pPIC9KM 质粒均用 Xho I 和 Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒 pPIC9KM-AusxynlOA'，并对重组表达质粒进行序列测定。3)用Ml I对pPIC9KM-AUSXynlOA'进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/XynlOA。该工程菌用2. 0%甲醇诱导96h， DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达190IU/mL。离心上清液为重组木聚糖酶粗酶液，经截留分子量为IOkDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-kpharose Fast Flow离子交换层析和 Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组木聚糖酶分子量为39. 8kDa。这与我们前期报道的《一种新型木聚糖酶(XynlOA)基因的克隆、 表达和纯化》(专利
发明者唐存多, 张慧敏, 李剑芳, 汪俊卿, 邬敏辰, 陈伟 申请人:江南大学