专利名称：水稻抗逆性相关的OsHMGB3基因及编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及一种新的水稻抗逆相关基因 0sHMGB3及其编码蛋白与应用，利用此基因可培育抗旱能力增强的转基因植物。
背景技术：
干旱缺水是影响农作物产量的主要因素之一，而水稻作为主要的粮食作物之一， 其生产消耗水量非常大，这与近年来全球范围内日益严重的水资源短缺形成了尖锐的矛盾。利用基因工程技术，将抗逆基因转入到当前广泛应用的优良作物品种中，培育既抗逆又高产优质的农作物新品种是应对水资源短缺、保障粮食安全的有效途径之一。深入发掘并研究植物节水抗旱基因，是解析植物抗旱机制的基础工作，为培育节水抗旱作物提供理论依据和基因资源。细胞核中，基因组DNA由组蛋白以及其它一些蛋白共同组成了核蛋白复合物，也就是常说的染色质。染色质的结构是高度动态的，并且能够被与其相关的一些蛋白所调控。 在这些蛋白中，高迁移率族蛋白(HMG-high mobility group)蛋白是仅次于组蛋白的第二大含量丰富的蛋白(Reeves, 1982 ;Bustin et al. , 996 ；Thomas et al. , 2001)。HMG 蛋白分为三个家族，第一家族是HMGB，第二家族是HMGN，第三家族是HMGA。至今已从各种植物中克隆出编码HMGB蛋白的基因，包括水稻(Wu et al.，2003)，玉米(Grasser et al. ,1991), 大豆(Laux et al. ,1991),刀豆(Yamamoto et al. ,1998),香豆(Grasser et al. ,1993), 豌豆(Webster et al. , 1997),牵牛花(Zheng et al. , 1993)。高等植物中的各种高迁移率族蛋白(HMGB)的不同之处在于染色质结合位点(Lichota et al.，2001)、DNA相互作用 (Stemmer et al. , 2002)以及表达模式的不同(Stemmer et al. , 1999)。植物中存在各种各样的高迁移率族蛋白(HMGB)，预示着它们将在细胞核中执行多种功能。水稻中已有高迁移率族蛋白I(HMGBl)和高迁移率族蛋白2 (HMGB2)的研究报道， 高迁移率族蛋白I(HMGBl)能够识别特定的DNA结构，如它更容易结合一些小环状的DNA， 而不易结合线状DNA(Wu et al. ,2003);高迁移率族蛋白2 (HMGB2)能够调节细胞的增殖 (Yoshida et al.，2006)。但有关水稻高迁移率族蛋白(HMGB)蛋白和抗逆性的关系至今未见报道。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明目的在于提供一种新的水稻抗逆相关0sHMGB3基因，是从水稻中分离克隆的一段完整编码区段的DNA片段，对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明，它具有植物特有HMGB家族的保守结构域，因此命名为0sHMGB3。具有该家族典型的结构域，属高迁移率族蛋白(HMGB)类型，可响应逆境胁迫。本发明的另一目的是提供利用水稻基因0sHMGB3培育抗逆能力增强的转基因植物的方法及其应用。分离和应用一种包含0sHMGB3基因的DNA片段，该基因能响应高温、低温、盐、外源ABA和PEG胁迫处理，发生表达变化。
本发明的技术方案是，所述0sHMGB3基因DNA序列为序列表SEQ ID N0:1所示，或者与SEQ ID NO :1至少90%同源的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO :1所示序列的亚片段。较佳的是，所述的0sHMGB3基因为SEQ ID NO 2中所示的DNA序列，或与SEQID NO 2同源性达90%的DNA序列。本发明的另一种技术方案是，所述0sHMGB3基因编码的蛋白为下列之一其氨基酸序列为序列表SEQ ID NO :3所示；或与SEQ ID NO :3序列的同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体或诱导突变体；或是在高或低的严谨条件下能与权利要求I或2所述的0sHMGB3基因的DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明的另一种技术方案是，提供了包含0sHMGB3基因的重组载体。所述重组载体所选用的载体可为引导外源基因在植物中表达的载体。优选的技术方案是，重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。本发明的另一种技术方案是，一种具有所述0sHMGB3基因编码的转化体，所述转化体的宿主为植物，所述植物为括水稻在内的多种植物。优选的技术方案是，将所述基因导入植物细胞、组织或器官，再将所述植物细胞、 组织或器官培育成植株，得到抗逆性增强的转基因植物。较佳的是，本发明通过对水稻基因分离克隆及其对逆境胁迫的响应分析，提供了一种包含大小为399bp的0sHMGB3基因的水稻DNA片断。0sHMGB3基因含有HMG基因家族保守结构域，为该基因家族HMGB类型成员。该基因受干旱、盐及外源ABA诱导表达，与水稻抗逆性相关。实现上述技术方案的操作办法是
可以采用已克隆的0sHMGB3基因为探针，从cDNA文库和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。也可以米用PCR(polymerase chain reaction)技术,从基因组，mRNA 和cDNA中扩增得到本发明的0sHMGB3基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段 DNA。采用以上技术，可以分离得到包含0sHMGB3基因序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得抗逆能力提高的转基因植株。携带本发明0sHMGB3基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA 转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。本发明的技术效果是
本发明的水稻基因对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性。本发明0sHMGB3基因克隆自水稻第4染色体的抗旱QTL区段，与该家族的其它成员比对结果表明，该基因具有该家族典型的结构域，属高迁移率族蛋白(HMGB)类型。在干旱、盐、高温、低温、外源ABA处理下的基因表达谱分析表明，该基因可响应逆境胁迫表达。 而且，超表达该基因的转基因水稻表现出显著增强的抵抗渗透胁迫的能力。本发明的技术效果是对于培育抗逆性增强的植物新品种具有重要的意义和应用价值。
图I为本发明的0sHMGB3基因在各组织器官的表达；
图2为本发明的0sHMGB3基因在苗期冷、热、盐、PEG和外源ABA处理下的表达水平；
图3为本发明利用ClustalW2软件将0sHMGB3基因预测的蛋白序列与同源蛋白序列进行比对的结果；
图4为本发明的0sHMGB3基因超表达载体转化水稻植株的Southern blot检测；
图5为本发明的0sHMGB3基因超表达载体转化水稻植株的表达水平检测；
图6为本发明的0sHMGB3基因的超表达转基因水稻的苗期甘露醇处理分析。
具体实施例方式下述实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如萨姆布鲁克 (Sambrook)等分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I
水稻0sHMGB3基因的克隆 I.幼苗培育
将水稻置于30°C萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备抽取 DNA 或 RNA。2. RNA提取与第一链cDNA合成
RNA的提取所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有Iml TRNzol-A+试剂的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加O. 2ml氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置 3min ;后于4 , 12000rpm离心IOmin后,上清液移至新的2mL EP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加100 μ I RNase-free ddH20溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。反转录之前需用DNaseI消化所提取样品，反应体系如下
权利要求
1.一种与水稻抗逆性相关的0SHMGB3基因，其特征在于，所述基因具有下列核苷酸序列之一SEQ ID NO 1中所示的DNA序列；与SEQ ID NO 1至少90%同源的DNA序列；功能相当于SEQ ID NO :1所示序列的亚片段。
2.根据权利要求I所述的0sHMGB3基因，其特征在于，所述基因为SEQID NO :2中所示的DNA序列，或与SEQ ID NO 2同源性达90%的DNA序列。
3.一种包含权利要求I或2所述的0sHMGB3基因编码的蛋白，其特征在于，所述 0sHMGB3基因编码的蛋白为下列之一其氨基酸序列为序列表SEQ ID NO :3所示；SEQ ID NO :3序列的同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体或诱导突变体; 在高或低的严谨条件下能与权利要求I或2所述的0sHMGB3基因的DNA杂交的DNA所编码的蛋白。
4.根据权利要求3所述的0sHMGB3基因编码的蛋白，其特征在于，包含所述0sHMGB3基因编码蛋白的重组载体，所述重组载体所选用的载体可为引导外源基因在植物中表达的载体。
5.根据权利要求4所述的0sHMGB3基因编码的蛋白，其特征在于，重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。
6.根据权利要求I或2所述的0sHMGB3基因，其特征在于，一种具有所述0sHMGB3基因编码的转化体，所述转化体的宿主为植物，所述植物为水稻。
7.一种包含权利要求I或2所述基因在提高水稻抗逆性中的应用，其特征在于，将所述基因导入植物细胞、组织或器官，再将所述植物细胞、组织或器官培育成植株，得到抗逆性增强的转基因植物。
全文摘要
本发明提供一种从水稻DNA片断中分离克隆与水稻抗逆性相关的OsHMGB3基因。该基因含有HMG基因家族保守结构域，为该基因家族HMGB类型成员。OsHMGB3基因受(聚乙二醇)PEG、高盐、低温、高温以及脱落酸(ABA)诱导表达，超表达OsHMGB3可提高水稻苗期抵抗渗透胁迫的能力，与水稻抗逆性相关。本发明的水稻基因对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性。
文档编号C12N15/29GK102586270SQ20111041004
公开日2012年7月18日 申请日期2012年4月11日 优先权日2012年4月11日
发明者刘鸿艳, 徐凯, 罗利军, 陈守俊 申请人:上海市农业生物基因中心