专利名称：一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法
技术领域：
本发明涉及一种油脂含量测定方法，尤其是涉及一种利用RGB三原色原理的微藻胞内油脂含量的快速测定方法。
背景技术：
生物柴油(脂肪酸甲酯)是一种已经得到证明的燃料，以其为可再生性的环保燃料能源而得到世界的广泛关注。生物柴油的主要成分是脂肪酸甲酯(FAME)，是以可再生资源(如油菜籽油、大豆油、玉米油、棉籽油、花生油、葵花子油、棕榈油、椰子油、回收烹饪油、 动物油以及微生物油脂等)为原料而制成，具备与石油柴油相近的性能。生产和使用生物柴油的技术已经存在了 50余年。与石油柴油相比，生物柴油的性能更加优良。
面对植物原料生产生物柴油的诸多问题，利用微藻产油具有不与农业争地的明显优势，而且可用海水作为天然培养基进行大量繁殖。跟植物一样，微藻也是利用光照产油， 但却比植物作物的效率高很多。大多数微藻的产油量远远超过了最好的油料作物。不像其他油料作物，微藻生长极为迅速，而且含有极其丰富的油脂。藻类光合作用转化效率可达 10%以上，含油量达30%。微藻的生物柴油产量是最好的油料作物的8 M倍。
小球藻是属于绿藻门绿藻目卵囊藻科小球藻属普生性单细胞绿藻，它是一种球形单细胞淡水藻类，直径3 8μ m，是地球上最早的生命之一，出现在20多亿年前，基因始终没有变化，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广。小球藻的光合作用色素是叶绿素，几种叶黄素，类胡萝卜素有胡萝卜素，可能不含同属绿藻门的团藻目-红球藻科-红球藻属中的虾青素。其贮藏的食物主要是淀粉。它是单细胞藻类，常单生，也常有多数细胞聚于一起；细胞多为球形、椭圆形；每个细胞内有1个周生、杯状或片状的叶绿体，具有1个蛋白核或缺如，1个细胞核；细胞壁通常很薄；每个细胞可以产生2、4、8或16 个似亲孢子，进行无性繁殖。
1978年，美国能源部可再生能源国家实验室开始养殖微藻生产生物燃料项目 (AquaticSpices Program,简称ASP项目)的研究，研究内容从微藻筛选、微藻生化机理分析、工程微藻制备到中试。该项目持续到1996年，在实验室研究的基础上，研究人员在美国加利福尼亚州、夏威夷州、新墨西哥州等地进行了中试放大。中试装置运行了一年，可获得高达0.05kg/(m2 · d)的工程微藻，微藻含油量达到40% 60%。1978-1996年累计投入科研经费2505万美元。该研究室是迄今对微藻研究最全面和权威的机构。由于油价上涨，2007年底美国能源部又将这个中断了 11年之久的项目重新启动。美国SappHire公司 2008年9月宣布投资1亿美元开展养殖海藻生产生物燃料的研究，SappHire公司有两个引人注目的投资商比尔盖茨私人名下的一家投资公司(Cascade in-vestments)和为洛克菲勒家族服务的投资合作商(VenrockPartner)。SappHire公司宣称通过一种用太阳光、 二氧化碳和光合海藻的工艺研制出了辛烷值达91的“绿色”汽油，而且生产的“绿色”燃料与现有的从炼油厂到加油站的销售网络设施完全兼容，显示了微藻汽油与第一代生物乙醇相比的优势所在。美国生物技术公司Solazyme于2008年7月9日生产出第一批海藻基可再生生物柴油，并已通过美国材料试验协会(ASTM)D-975规格的认证。美国国际能源公司(International Energy)于2007年11月初宣布启动“海藻变油”研发计划，将从基于海藻的光合成来生产可再生柴油和喷气燃料。美国GreenFuel技术公司开发的海藻技术于 2005年在Arizona的APS电厂完成了中试。选用高生长率的海藻，置于装有水的大型试管内，并曝置于直接的阳光照射下。这项技术计划2008年开始商业化生产。美国Algenol公司2008年7月宣布在美国Maryland投运了世界上最大的海藻库场，目标是在美国沿海地区建设海藻制乙醇工厂。该公司估算可从lacre (约为4046. 9m2) 土地生产6000gal (1 gal =3. 785L)乙醇。按照估计，如果美国所需乙醇全部从海藻制取，则仅需使用谷物制取乙醇需用土地的3%。美国可再生能源集团(REG)于2008年8月21日宣布，该公司已拥有规模化的商业化技术，可炼制和生产大量高质量的海藻生物柴油，柴油质量超过ASTM D6751和 EN 14214M标准。REG公司计划采用专有预处理技术对粗海藻油进行净化和精制。然后采用与目前商业规模生物柴油生产过程相似的系统，使之转化为生物柴油。美国Valencent 产品公司和全球绿色解决方案公司合作开发的Vertigro工艺正处于工业应用准备阶段， 包括海藻生长、海藻收集和萃取海藻油用于生物柴油3个步骤。工艺的核心是连续闭环生物反应器。在25-30d之后就可收集海藻，海藻的含油量约为50%。Vertigro工艺的生物柴油产量要比用常规农作物生产的生物柴油增加20倍，用水量只有5%。
石油公司也加入了养殖海藻生产生物柴油的研究开发。Shell公司与美国从事海藻生物燃料业务的HR生物石油公司(HR Biopetroleum)于2007年12月组建合资企业 Cellena公司，在夏威夷用面积2. 5hm2的实验基地作为海藻养殖场，建设利用海藻生产植物油再转化为生物燃料的中试装置，进行为期2年的生物柴油生产实验。Chevron公司也与美国可再生能源国家实验室、Solazyme公司签署了协议，共同开展研究工作。
任何颜色都可以用红、绿、蓝这3种颜色按不同的比例混合而成，这就是三原色原理。三原色的原理可解释如下(1)自然界的任何颜色都可以由3种颜色按不同的比例混合而成；而每种颜色都可以分解成3种基本颜色；(2)三原色之间是相互独立的，任何一种颜色都不能由其余的两种颜色来组成；C3)混合色的饱和度由3种颜色的比例来决定。混合色的亮度为3种颜色的亮度之和。用以上的相加混色三基色所表示的颜色模式称为RGB 模式，而用相减混色三基色原理所表示的颜色模式称为CMYK模式，它们广泛运用于绘画和印刷领域。RGB是一种依赖于设备的颜色空间不同设备对特定RGB值的检测和重现都不一样，因为颜色物质(荧光剂或者染料)和它们对红、绿和蓝的单独响应水平随着制造商的不同而不同，甚至是同样的设备不同的时间也不同。RGB颜色模型的主要目的是在电子系统中检测，表示和显示图像，比如电视和电脑，但是在传统摄影中也有应用。在电子时代之前， 基于人类对颜色的感知，RGB颜色模型已经有了坚实的理论支撑。
近年来，虽然有很多关于微藻胞内油脂含量的测定方法报道，缪晓玲(太阳能学报，2007，Vol.28, No. 2)报道了先将藻粉于钵体中研磨，然后用正己烷抽提，最后称重测量油脂含量；胡小文(中国油脂，2011，Vol.36，No. 2)报道了利用尼罗红染色法荧光光谱检测微藻中油脂的方法。总得来说，目前研究中检测油脂的方法主要分两种，一种是利用各种手段把油脂分离提取出来称重；另一种是利用油脂荧光染色的特性，用荧光检测手段定量检测油脂含量。但是这两种手段要么操作起来很麻烦，需要的样品量很大，要么实验误差大， 重复性不高。发明内容
本发明的目的在于提供一种利用RGB三原色原理的微藻胞内油脂含量的快速测定方法。
本发明的技术方案是以小球藻Chlorella vulgaris为出发藻种，以SE培养基培养小球藻，生长期内用自制光箱拍照，并用MATLAB编程分析照片中R、G、B的值，从而建立实测油脂含量与R、G、B平均值的关系模型，最后可以直接通过拍照读取R、G、B的值来计算胞内油脂的含量。
本发明采用的藻种为小球藻Chlorella vulgaris，所述小球藻Chlorella vulgaris购自中国科学院典型培养物种保藏委员会淡水藻种库，藻种编号FACHB_32。
本发明包括以下步骤
1)制作拍照用光箱；
2)将不同培养时期的藻液，倒在培养皿中，再放置在不透光板中央，然后放入光箱内，打开光源，用数码相机从箱体的顶面通孔拍照；
3)从小球藻照片上中央位置截取图像；
4)用MATLAB编写程序，分析图像上的R、G、B三种颜色的平均像素值，并绘制像素分布5)建立实测油脂含量与R、G、B三种颜色平均像素值关系的模型成=aR+bG+cB, 求模型参数a、b、c;
6)建立模型后，通过拍照截图，用MATLAB编程读取RGB值，带入模型得到小球藻细胞中油脂的含量，单位为mg/g。
在步骤1)中，所述光箱设有箱体，箱体的底面为敞口，顶面中央设有通孔，在箱体内设有灯管，所述箱体的棱长可为50cm，所述通孔的直径可为5cm，箱体内壁可为黑色；所述灯管可设4根白色LED灯管，4根白色LED灯管设在灯箱内的四角。
在步骤2、中，所述培养皿可采用一次性培养皿；所述不透光板可采用白色不透光亚克力板。
在步骤3)中，所述图像可为IOOX 100像素大小的图像。
在步骤4)中，所述分析图像上的R、G、B三种颜色的平均像素值，可分析图像上 10000个点的R、G、B三种颜色的平均像素值。
本发明建立的小球藻胞内油脂测定方法操作简单，测定结果精确，模型计算油脂含量与实际油脂含量线性相关系数R2达到0. 9978，而且重复性好，需要样品量少。总之，与传统的分析油脂含量的方法相比，具有更简捷，精确的优势。
图1为本发明实施例的光箱结构示意图。
图2为本发明实施例的小球藻图片R、G、B值分布图。在图2中，横坐标为象素值， 纵坐标为出现次数；图中a为蓝色，b为红色，c为绿色。
图3为RGB模型预测油脂含量与实际油脂含量线性关系图。在图3中，横坐标为预测油脂含量(mg/g)，纵坐标为实际油脂含量(mg/g)；线性相关系数R2 = 0.9978。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
1)制作拍照用光箱，参见图1，所述光箱设有箱体1，箱体1可采用铝合金制作，呈棱长50cm的正方体框架，箱体1的底面11为敞口，顶面12中央设有通孔13，在箱体1内设有4根白色LED灯管2，4根白色LED灯管2设在箱体1内的四角，所述通孔13的直径可为 5cm，箱体1内壁可为黑色；箱体1上可设开关3。
2)判断光箱内光源分布是否均勻光箱内光源分布均与否对建立模型的准确性和重复性影响极大，判断光箱内光源分布是否均勻可以采用分析光箱所拍照片的RGB均勻度来判断。从小球藻照片上截取100X 100的像素图后，用MATLAB编辑的统计RGB值的程序来分析像素图，然后绘制R、G、B的分布图，看分布图中R、G、B的分布是否为单峰状。如果是单峰状的，说明所拍小球藻的照片光线分布很均勻，重复性很好，从而也说明了自制光箱内光源分布很均勻，适合用来拍照。如图2所示即为R、G、B分布很均勻的图，都是单峰状的。
3)建模过程对正常生长的小球藻，每次取样60 70ml，然后摇勻，倒入一次性平板中没过底部，放在亚克力板的中央位置，盖上光箱用数码相机拍照。
用截图工具，例如pho to shop、QQ截图等从所拍小球藻照片上中央位置截取 100X100大小的像素图。把这个像素图移动到用MATLAB所编统计像素值的程序所在文件夹，运行程序，输入截图名称，即可得到截图的10000个点的R、G、B的平均值以及R、G、B值的分布图。
然后再取50ml样品，测0D684，然后对照DCW-0D684的标准线性关系式，计算样品中小球藻的生物量。然后离心、洗涤、烘干样品，用索氏萃取法以正己烷为溶剂萃取小球藻中的油脂，通过称量接受瓶萃取前后的重量差来测定油脂的重量，这样就可以得到实测油脂占细胞干重的含量mg/g。
间隔时间取8个样，得到8组数据，包括样品R、G、B的平均值以及实测油脂含量如表1所示。
表1 R、G、B的平均值以及实测油脂含量与模型预估含量
ρ际油脂含量(mg/g) 预估油脂含量(mg/g)1190.284202.052202.066313312.62181.039193.991195.308310310.33159.163182.841134.031222222.24158.07187.12126.773320320.55126.568176.38555.366281280.46170.832185.87146.394290289.97151.883184.153106.018297296.78155.69189.081109.826292292.3
然后对8组数据用MATLAB进行线性拟合，模型为Y^ = aR+bG+cB，其中R、G、B为表中红色、绿色、蓝色的值，\为表中实测油脂含量。拟合完得到模型参数值为a = -1. 5379， b = 1.8504，c = 1.6343。所以建立的胞内油脂含量与R、G、B平均值的模型为^ =-1. 5379R+1. 8504G+1. 6343B (YL :mg/g DCff)。
模型建立后，就可以简单快速的只通过取少量藻液，拍照后用MATLAB编的程序读取R、G、B值，带入模型方程计算得出小球藻胞内油脂含量\。表1中预估油脂含量为用模型方程计算出来的预估油脂含量，可见与实际油脂含量差距不大，模型的重复性很高。
4)验证模型方程的精确性在小球藻培养的不同时期，取样用RGB模型分析预估油脂含量，同时用传统的称重法测量实际油脂含量，建立模型预估含量与实际含量的线性关系，分析线性度。
如图3所示为小球藻胞内油脂预测含量与实际含量的线性关系图。由图3中可见， 线性相关系数R2值有0. 9978，相关度非常高，模型方程的重复性很高，经验证可以用来作为快速测定小球藻胞内油脂含量的简易方法。
权利要求
1.一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法，其特征在于包括以下步骤1)制作拍照用光箱；2)将不同培养时期的藻液，倒在培养皿中，再放置在不透光板中央，然后放入光箱内， 打开光源，用数码相机从箱体的顶面通孔拍照；3)从小球藻照片上中央位置截取图像；4)用MATLAB编写程序，分析图像上的R、G、B三种颜色的平均像素值，并绘制像素分布图；5)建立实测油脂含量与R、G、B三种颜色平均像素值关系的模型=aR+bG+cB,求模型参数a、b、c ；6)建立模型后，通过拍照截图，用MATLAB编程读取RGB值，带入模型得到小球藻细胞中油脂的含量，单位为mg/g。
2.如权利要求1所述的一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法，其特征在于在步骤1) 中，所述光箱设有箱体，箱体的底面为敞口，顶面中央设有通孔，在箱体内设有灯管，所述箱体的棱长为50cm，所述通孔的直径为5cm，箱体内壁为黑色。
3.如权利要求2所述的一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法，其特征在于所述灯管设4根白色LED灯管，4根白色LED灯管设在灯箱内的四角。
4.如权利要求1所述的一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法，其特征在于在步骤2) 中，所述培养皿采用一次性培养皿。
5.如权利要求1所述的一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法，其特征在于在步骤2) 中，所述不透光板采用白色不透光亚克力板。
6.如权利要求1所述的一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法，其特征在于在步骤3) 中，所述图像为100X 100像素大小的图像。
7.如权利要求1所述的一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法，其特征在于在步骤4) 中，所述分析图像上的R、G、B三种颜色的平均像素值，是分析图像上10000个点的R、G、B 三种颜色的平均像素值。
全文摘要
一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法，涉及一种油脂含量测定方法。以小球藻Chlorellavulgaris为出发藻种，以SE培养基培养小球藻，生长期内用自制光箱拍照，并用MATLAB编程分析照片中R、G、B的值，从而建立实测油脂含量与R、G、B平均值的关系模型，最后可以直接通过拍照读取R、G、B的值来计算胞内油脂的含量。操作简单，测定结果精确，模型计算油脂含量与实际油脂含量线性相关系数R2达到0.9978，而且重复性好，需要样品量少。总之，与传统的分析油脂含量的方法相比，具有更简捷，精确的优势。
文档编号C12Q1/02GK102517372SQ20111040951
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者凌雪萍, 卢英华, 吴意珣, 敬科举, 文昌 申请人:厦门大学