专利名称：酶法催化油脂制备生物柴油的过程中回收脂肪酶的方法
技术领域：
本发明涉及生物化工领域，具体地说，涉及酶法催化油脂制备生物柴油的过程中回收脂肪酶的方法。
背景技术：
油脂工业的新前景-生物柴油是由生物油脂原料通过转酯反应生成的长链脂肪酸酯类物质，是一种新型的无污染可再生能源。生物柴油的燃烧性能可以与传统的石油系柴油媲美，由于生物柴油燃烧后发动机排放出的尾气里有害物质比传统石化柴油降低了 50 %，因此生物柴油的研究和应用已经受到了广泛的关注。目前生物柴油主要是用化学法生产，即用动植物油脂和一些低碳醇(甲醇或乙醇)在碱或者酸性催化剂作用下进行转酯反应，生成相应的脂肪酸甲酯或乙酯。化学法制备生物柴油存在如下一些不可避免的缺点①油脂原料中的游离脂肪酸和水严重影响反应的进行；②甲醇在油脂中溶解性不好，易导致乳化液的形成从而使得后续处理过程复杂； ③工艺要求甲醇用量大大超过反应摩尔比，过量甲醇的蒸发回流增大过程能耗。由于利用生物酶法合成生物柴油具有反应条件温和、无污染物排放、油脂原料中的游离脂肪酸和少量水不影响酶促反应等优点，符合绿色化学的发展方向，因而日益受到人们的重视。但同化学方法相比，生物酶的成本过高，这已成为制约酶法产业化生产生物柴油的主要瓶颈。固定化脂肪酶可以重复使用，这可以在一定程度上降低酶的使用成本。但固定化酶的制备成本很高，其中绝大部分成本归结于酶的下游过程操作成本，即酶的分离、纯化和固定化。故直接利用游离脂肪酶作为催化剂，则可以有效省去酶的分离、纯化和固定化等程序，可以大幅度降低酶的制备成本。然而，在利用游离脂肪酶作为催化剂催化可再生油脂原料制备生物柴油的过程中，能否实现游离脂肪酶的多次回用是降低酶成本的关键，也是游离脂肪酶能否最终应用于生物柴油制备领域的主要制约因素。在利用游离脂肪酶催化油脂制备生物柴油的过程中，反应结束后通过离心或静置分层实现油相和水相的分离，游离脂肪酶富集在水相，水相中除了游离脂肪酶外，还有水、 副产物甘油以及一些油脂类物质。本发明人在CN101419322A中提出采用一次膜工艺进行水相中游离酶的回收并重复利用回收后的游离脂肪酶用于下一批次的催化反应。然而，进一步研究发现，离心或静置分层后，水相中含有少许的油脂类物质(中性油脂、游离脂肪酸、生物柴油以及一些单双甘油酯等)对孔径较小(拦截分子量大于15000Da)的膜性能有严重负面影响，如果采用一次膜回用工艺，整个过程操作时间较长，酶蛋白回收效率低。
发明内容
本发明旨在克服现有酶法催化油脂制备生物柴油的过程中膜回用工艺的不足，提供一种利用膜组合回收游离脂肪酶的新方法。为了实现本发明目的，本发明提供的酶法催化油脂制备生物柴油的过程中回收脂肪酶的方法，其是以短链醇ROH作为反应酰基受体，利用游离脂肪酶作为催化剂催化油脂原料与短链醇进行反应合成生物柴油，反应结束后，利用膜组合分离方法进行游离脂肪酶的回收，再利用回收的液体脂肪酶进行下一批次的反应。所述膜组合分离方法为先用孔径较大的粗滤膜对反应后水相进行第一次浓缩，收集滤液，然后用另一孔径较小的精滤膜对滤液进行第二次浓缩，合并两次回收的游离脂肪酶，用于下次的催化反应。前述的方法中，所述粗滤膜为20-100nm的金属膜或陶瓷膜，或截留分子量在 20000Da以上的有机膜。前述的方法中，所述精滤膜为5-20nm的陶瓷膜或金属膜，或截留分子量为 5000-20000Da 的有机膜。前述的方法中，所述脂肪酶是来源于酵母、霉菌、细菌或其它微生物的脂肪酶，或它们的组合。优选所述脂肪酶是来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)、米黑根毛霉 (Rhizomucor miehe)、嗜热丝抱菌(Thermomyces lanuginosus)或米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶，或它们的组合。前述的方法中，所述短链醇ROH中R为具有1-5个碳原子的烷基，且短链醇的添加方式为间歇分批多次加入或连续流加的方式。优选所述短链醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇中的一种或多种。前述的方法中，所述油脂为生物油脂，包括植物油脂、动物油脂、废食用油、油脂精练下脚料、微生物油脂或各种废弃油脂。其中，所述植物油脂为蓖麻油、菜籽油、大豆油、花生油、玉米油、棉籽油、米糠油、 棕榈油、棕榈油脂肪酸、文冠果油、小桐籽油等中的一种或多种。所述动物油脂为鱼油、猪油等。所述微生物油脂为酵母油脂、微藻类油脂等。具体地，在利用游离脂肪酶催化油脂制备生物柴油的过程中，首先加入基于油脂 4-6摩尔的短链醇(可以采取间歇分批多次加入或连续流加的方式)，加入基于油脂质量 2% -20%的水，加入基于单位油脂质量20-200个酶活单位的液体脂肪酶(包括各种来源的脂肪酶，特别包括来源于南极假丝酵母、米黑根毛霉、嗜热丝孢、米曲霉的脂肪酶)，不同来源的脂肪酶可以组合起来使用，在适于酶反应的任何生化反应器中进行反应，温度控制在35°C 50°C，反应4-12小时后，油脂原料转化生成生物柴油的得率超过90%。反应结束后，静置或离心分出油相和水相(油相为生物柴油相，水相主要为脂肪酶、副产物甘油及少许油脂类物质)，然后再利用组合膜工艺进行水相中游离酶的回收，即先用孔径较大的粗滤膜对反应后水相进行第一次浓缩，实现部分游离脂肪酶和水相中油脂类物质的回收，然后再将渗透液经过另一孔径较小的精滤膜装置，进行余下游离脂肪酶的回收。本发明首次提出在利用游离脂肪酶催化油脂制备生物柴油的过程中，采用组合膜工艺进行游离脂肪酶的回收，有效解决了游离脂肪酶的回用问题。先通过一道粗滤膜实现部分游离脂肪酶以及油脂类物质的拦截，然后将渗透液进一步采用孔径较小的精滤膜进行余下游离脂肪酶的回收，这种组合膜工艺可以显著缩短酶的回收时间，降低水相中油脂类物质对精滤膜的污染，该法对提高生产效率，延长膜的使用寿命以及降低游离酶回收成本等都具有非常重要的意义，从而使得液体脂肪酶在生物柴油制备领域中具有很好的应用前
旦
ο
图1为本发明的酶法催化油脂制备生物柴油的过程中组合膜回收脂肪酶的工艺流程图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1将摩尔比为4 1的甲醇和大豆油(3kg)，加入基于油脂质量3%的水，装入5L反应器中搅拌均勻，水浴加热至40°C后，加入基于单位油脂质量200个酶活单位的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的游离脂肪酶，反应转速控制在600rpm，甲醇在4个小时内勻速加入，8小时生物柴油得率为94%。反应结束后，离心分出油相和水相，进而利用膜分离回收水相中的游离脂肪酶。先选用膜孔径IOOnm的金属膜截留部分游离脂肪酶以及水相中的油脂类物质，而后将渗透液再经过截留分子量为5000Da的有机膜，进行余下游离脂肪酶的回收。整个过程游离脂肪酶的回收率高达96.5%。实施例2将摩尔比为4. 5 1的乙醇和大豆油(3kg)，加入基于油脂质量3%的水，装入5L 反应器中搅拌均勻，水浴加热至40°C后，加入基于单位油脂质量40个酶活单位的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的游离脂肪酶，反应转速控制在600rpm，乙醇在8个小时内勻速加入，12小时生物柴油得率为92%。反应结束后离心分出油相和水相，进而利用膜分离回收水相中的游离脂肪酶，先选用膜孔径20nm的陶瓷膜截留部分游离脂肪酶和水相中的油脂类物质，过膜后的渗透液再经过截留分子量为20000Da的有机膜拦截，游离脂肪酶的回收率高达97%。实施例3将摩尔比为5 1的甲醇和小桐籽油(3kg)，加入基于油脂质量3%的水，装入5L 反应器中搅拌均勻，水浴加热至40°C后，加入基于单位油脂质量50个酶活单位的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的游离脂肪酶，反应转速控制在600rpm，甲醇在5个小时内勻速加入，8小时生物柴油得率为94%。反应结束后离心分出油相和水相，进而利用膜分离回收水相中的游离脂肪酶，先选用膜孔径50nm的陶瓷膜截留部分游离脂肪酶和水相中的油脂类物质，过膜后的渗透液再经过膜孔径5nm的陶瓷膜拦截，酶蛋白的回收率高达98%。实施例4将摩尔比为5 1的乙醇和小桐籽油(3kg)，加入基于油脂质量3%的水，装入5L 反应器中搅拌均勻，水浴加热至40°C后，加入基于单位油脂质量20个酶活单位的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的游离脂肪酶，反应转速控制在600rpm，乙醇在8个小时内勻速加入，12小时生物柴油得率为91%。反应结束后静置分层，分出油相和水相，进而利用膜分离回收水相中的酶蛋白，先选用膜孔径IOOnm的金属膜截留部分游离脂肪酶和水相中的油脂类物质，过膜后的渗透液再经过截留分子量为IOOOODa的有机膜拦截，酶蛋白的回收率高达98%。实施例5
将摩尔比为4.5 1的甲醇和潲水油(3kg)，加入基于油脂质量10%的水，装入5L 反应器中搅拌均勻，水浴加热至45°C后，加入基于单位油脂质量50个酶活单位的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的游离脂肪酶，反应转速控制在600rpm，甲醇在5个小时内勻速加入，8小时生物柴油得率为92%。反应结束后离心分出油相和水相，进而利用膜分离回收水相中的酶蛋白，先选用膜孔径80nm的金属膜截留部分游离脂肪酶和水相中的油脂类物质，过膜后的渗透液再经过膜孔径20nm陶瓷膜拦截，酶蛋白的回收率高达96%。实施例6将摩尔比为6 1的乙醇和潲水油(3kg)，加入基于油脂质量10%的水，装入5L 反应器中搅拌均勻，水浴加热至40°C后，加入基于单位油脂质量80个酶活单位的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的游离脂肪酶，反应转速控制在600rpm，乙醇在8个小时内勻速加入，12小时生物柴油得率为90%。反应结束后离心分出油相和水相，进而利用膜分离回收水相中的游离脂肪酶，先选用膜孔径30nm的陶瓷膜截留部分游离脂肪酶和水相中的油脂类物质，过膜后的渗透液再经过膜孔径5nm陶瓷膜拦截，酶蛋白的回收率高达96%。实施例7将摩尔比为4. 5 1的甲醇和棕榈油(3kg)，加入基于油脂质量5%的水，装入5L 反应器中搅拌均勻，水浴加热至50°C后，加入基于单位油脂质量50个酶活单位的来源于米黑根毛霉(Miizomucor miehe)的游离脂肪酶，反应转速控制在700rpm，甲醇在5个小时内勻速加入，8小时生物柴油得率为94%。反应结束后离心分出油相和水相，进而利用膜分离回收水相中的游离脂肪酶，先选用拦截分子量为40000Da的有机膜截留部分游离脂肪酶和水相中的油脂类物质，过膜后的渗透液再经过截留分子量为5000Da的有机膜拦截，酶蛋白的回收率高达97%。实施例8将摩尔比为4. 5 1的乙醇和蓖麻油(3kg)，加入基于油脂质量5%的水，装入5L 反应器中搅拌均勻，水浴加热至35°C后，加入基于单位油脂质量50个酶活单位的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的游离脂肪酶，反应转速控制在700rpm，乙醇在8个小时内勻速加入，12小时生物柴油得率为93%。反应结束后离心分出油相和水相，进而利用膜分离回收水相中的游离脂肪酶，先选用膜孔径50nm的金属膜截留部分游离脂肪酶和水相中的油脂类物质，过膜后的渗透液再经过截留分子量为IOOOODa的有机膜拦截，酶蛋白的回收率高达97%。回收的酶液中副产物甘油的残存量为4%。实施例9将摩尔比为4. 5 1的甲醇和棕榈油脂肪酸(3kg)，加入基于油脂质量5%的水， 装入5L反应器中搅拌均勻，水浴加热至50°C后，加入基于单位油脂质量50个酶活单位的来源于嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的游离脂肪酶，反应转速控制在600rpm，甲醇在5个小时内勻速加入，8小时生物柴油得率为92%。反应结束后离心分出油相和水相， 进而利用膜分离回收水相中的游离脂肪酶，先选用截留分子量为50000Da的有机膜截留部分游离脂肪酶和水相重的油脂类物质，过膜后的渗透液再经过截留分子量为20000Da的有机膜拦截，酶蛋白的回收率高达96 %。实施例10将摩尔比为4. 5 1的乙醇和脂肪酸(3kg)，加入基于油脂质量5%的水，装入5L反应器中搅拌均勻，水浴加热至45°C后，加入基于单位油脂质量50个酶活单位的来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的游离脂肪酶，反应转速控制在600rpm，乙醇在8个小时内勻速加入，12小时生物柴油得率为92%。反应结束后离心分出油相和水相，进而利用膜分离回收水相中的游离脂肪酶，先选用截留分子量为15000Da的有机膜截留部分游离脂肪酶和水相中的油脂类物质，过膜后的渗透液再经过截留分子量为5000Da的有机膜拦截， 酶蛋白的回收率高达98%。实施例11将摩尔比为4 1的甲醇和棕榈油(3kg)，加入基于油脂质量5%的水，装入5L反应器中搅拌均勻，水浴加热至35°C后，加入基于单位油脂质量20个酶活单位的来源于嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的游离脂肪酶和基于单位油脂质量30个酶活单位的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的游离脂肪酶，反应转速控制在600rpm，甲醇在5个小时内勻速加入，8小时生物柴油得率为92%。反应结束后，静置后，分出水层，利用膜分离回收酶蛋白，先选用截留分子量为30000Da的有机膜截留部分游离脂肪酶和水相重的油脂类物质，过膜后的渗透液再经过孔径为5nm的陶瓷膜拦截，酶蛋白的回收率高达98%。实施例12将摩尔比为6 1的乙醇和蓖麻油(3kg)，加入基于油脂质量5%的水，装入5L反应器中搅拌均勻，水浴加热至40°C后，加入基于单位油脂质量60个酶活单位的来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的游离脂肪酶以及基于单位油脂质量50个酶活单位的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的游离脂肪酶，反应转速控制在600rpm，乙醇在3个小时内勻速加入，5小时生物柴油得率为90%。反应结束后，静置后，分出水层，利用膜分离回收酶蛋白，先选用截留分子量为40000Da的有机膜截留部分游离脂肪酶和水相中的油脂类物质，过膜后的渗透液再经过截留分子量为IOOOODa的有机膜拦截，酶蛋白的回收率高达 98%。实施例1-12的酶法催化油脂制备生物柴油的过程中组合膜回收脂肪酶的工艺流程图如图1所示。对比例为进一步验证本发明的组合膜工艺所产生的有益效果，将本发明与CN101419322A 进行了回收效果的对比实验。将摩尔比为6 1的乙醇和菜籽油(3kg)以及基于油脂质量10%的水，装入5L反应器中搅拌均勻，加热至40°C后，加入基于单位油脂质量100个酶活单位的来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的液体脂肪酶，甲醇在7个小时内勻速加入，9小时生物柴油得率为95%。反应结束后离心分层，取出水相。根据CN101419322A中公开的方法，直接利用截留分子量为15000Da的精滤膜回收水相中的酶蛋白，膜通量仅为7. 5L/m2/h，要实现酶蛋白的回收率大于95%，处理时间较长。同时，由于水相中油脂类物质容易堵塞孔径小的精滤膜，导致膜污染严重，在连续处理 10小时后，膜性能显著下降，通量降至3L/m2/h以下。在本发明的组合膜工艺中，先采用粗滤膜(截留分子量为40000Da的有机膜)处理水相，膜通量高达为100L/m2/h，进而采用截留分子量为15000Da的精滤膜对经过粗滤膜处理过的滤液进行再次处理，膜通量可达到40L/m2/h，实现酶蛋白回收率大于95%所需的处理时间大大缩短。此外，粗滤膜连续工作30小时，膜通量仍可保持在80L/m2/h以上，而经过粗滤膜处理后的滤液由于不含有油脂类物质，精滤膜的性能保持良好，连续处理料液30 小时后，膜通量还可保持在30L/m2/h以上。显然，这种先用粗滤膜，再用精滤膜处理的组合膜工艺显著延长了膜的使用寿命，降低了游离脂肪酶的回收成本并大大提高了生产效率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.酶法催化油脂制备生物柴油的过程中回收脂肪酶的方法，以短链醇ROH作为反应酰基受体，利用游离脂肪酶作为催化剂催化油脂原料与短链醇进行反应合成生物柴油，反应结束后，利用膜组合分离方法进行游离脂肪酶的回收，其特征在于，先用孔径较大的粗滤膜对反应后水相进行第一次浓缩，收集滤液，然后用另一孔径较小的精滤膜对滤液进行第二次浓缩，合并两次回收的游离脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述粗滤膜为20-100nm的金属膜或陶瓷膜，或截留分子量在20000Da以上的有机膜。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精滤膜为5-20nm的陶瓷膜或金属膜， 或截留分子量为5000-20000Da的有机膜。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶是来源于微生物的脂肪酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶是来源于酵母、霉菌或细菌的脂肪酶，或它们的组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶是来源于南极假丝酵母 (Candida antarctica)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehe)、嗜热丝抱菌(Thermomyces lanuginosus)或米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶，或它们的组合。
7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述短链醇ROH中R为具有1-5 个碳原子的烷基，且短链醇的添加方式为间歇分批多次加入或连续流加的方式。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述短链醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇中的一种或多种。
9.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述油脂为植物油脂、动物油脂、微生物油脂或各种废弃油脂。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物油脂为蓖麻油、菜籽油、大豆油、花生油、玉米油、棉籽油、米糠油、棕榈油、棕榈油脂肪酸、文冠果油、小桐籽油中的一种或多种；所述动物油脂为鱼油和/或猪油。
全文摘要
本发明提供一种在利用脂肪酶催化油脂制备生物柴油的过程中，采用组合膜工艺回收游离脂肪酶的方法，可有效解决游离脂肪酶的回用问题，其是先通过一道粗滤膜实现部分游离脂肪酶以及油脂类物质的拦截，然后将渗透液进一步采用孔径较小的精滤膜进行余下游离脂肪酶的回收，这种组合膜工艺可以显著缩短酶的回收时间，降低水相中油脂类物质对精滤膜的污染，该法对提高生产效率，延长膜的使用寿命以及降低游离酶回收成本等都具有非常重要的意义，从而使得游离脂肪酶在生物柴油制备领域中具有很好的应用前景。
文档编号C12P7/64GK102417916SQ20111040993
公开日2012年4月18日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者刘德华, 朱罗乐, 杜伟 申请人:清华大学