专利名称：一种利用氧化胁迫提高出芽短梗霉黑色素产量的方法
一种利用氧化胁迫提高出芽短梗霉黑色素产量的方法技术领域
本发明属于由微生物液态发酵生产黑色素技术领域，具体利用环境胁迫提高出芽短梗霉黑色素产量的方法。
背景技术：
黑色素是一种广泛存在于生物体中的一类天然色素，它是通过多羟基酚(极易结合蛋白)氧化而形成结构不规则的非均质的类多酚聚合体。黑色素在工农业上，可以作为吸收紫外线的化妆品成分、天然染发剂的成分、阳离子螯和剂、作为无定形的半导体以及生物杀虫剂的光保护剂；此外黑色素在医学上也具有很广的应用范围，具有清除自由基、阻止心磷脂脂质体的氧化、抗辐射及抗氧化、对病理学和分类学的研究具有重要意义、作为新型的天然药物载体、用来治疗某些与黑色素缺乏相关的神经性疾病、一些可溶性黑色素在体外具有抑制爱滋病病毒感染宿主细胞的作用，因此有可能成为一种有效的药物.目前黑色素的生产多是通过化学合成或从动、植物体进行提取。化学合成黑色素反应过程多，且具有一定的毒害性；从动、植物体提取黑色素存在样品来源的问题。利用微生物生产黑色素具有反应条件温和、成本低、操作简单、无需大量的样品等优点。而国内利用真菌发酵生产黑色素的研究还很少，而本发明是利用环境胁迫提高出芽短梗霉黑色素的产量。发明内容
本发明的目的是提供一株产黑色素的出芽短梗霉菌(AurecAasidium Pullulans)，并采用改良培养基对其深层液态发酵提供黑色素产量的方法。
一种利用氧化胁迫提高出芽短梗霉黑色素产量的方法，其特征在于先将保藏编号为CGMCC3337的出芽短梗霉(AurecAasidium Pullulans)菌株活化后摇瓶培养，按照1 10%接种量接种于发酵培养基，进行液态发酵。发酵液在5000r/min的条件下离心5min， 所得上清液先以6mol/L盐酸酸解，后用50%的甲醇进行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用 lmol/L碱性溶液溶解得到黑色溶液。最后用3mol/L盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到
本发明采用的的实施步骤如下
(1)菌种活化将保藏在PDA培养基斜面上的菌种，在22 下恒温培养4 8小时，得到活化菌株；
(2)制备种子培养基，其水溶液组成为(g/L)葡萄糖20 40，土豆汁100 700， 牛肉膏1 5，蒸馏水，pH 4 7，121 °C灭菌20min;从斜面上挑取一环出芽短梗霉菌接入上面的种子培养基中摇瓶培养，培养1 ! 36h，培养温度27士2°C，转速为150 230rpm。
(3)发酵培养基现有的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L):葡萄糖40，土豆汁 400，牛肉膏l，FeS04 0 . 02，蒸馏水，121°C灭菌20min ；或本发明提出的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L)葡萄糖 40，土豆汁 400，牛肉膏 1，FeSO4O. 02，H2025mmoL/L 25mmoL/L，蒸馏水，pH 4，121°C灭菌 20min。
(4)将种子液接种于IOL自动控制发酵罐中，发酵培养基分别为现有发酵培养基和本发明提出的发酵培养基，装液量为7L，接种量为1 % 10 % (V/V)，发酵搅拌速度为 200 500r/min，发酵温度为25°C，通气量为0. 5 1(V/V)，罐压为0. 01 0. 02Mpa, pH 4. 0 7. 0，分别发酵3 5天。发酵得到的发酵液在5000r/min的条件下离心5min，所得上清液先以6mol/L盐酸酸解，后用50%的甲醇进行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用lmol/ L碱性溶液溶解得到黑色溶液。最后用3mol/L盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色ο
所述碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾或氨水溶液。
所述培养基中添加了 H2O2，H2O2会分解生成氧气，氧气是高度活性物质，当氧化不完全时则会生成活性氧类。活性氧类是机体内自由基的主要形式，可在细胞的正常代谢中产生，外界环境如辐射、氧化还原活性药物、金属离子也会刺激ROS的生成。正常情况下， ROS的产生和抗ROS水平是平衡的，当ROS产生大于抗ROS水平时，即会攻击机体，造成脂质、蛋白质、DNA的损伤，甚至是细胞的死亡，这就是所谓的氧化应激。生物体为了应付这种氧化应激反应已经进化出若干的保护机制，发生基因调节水平上的变化，从而诱导合成黑色素，保护自身不受ROS的伤害。当出芽短梗霉处于亚致死剂量的H2O2中时，它将适应这种应激条件从而对致死剂量的刺激产生黑色素。因此在出芽短梗霉的发酵培养基中添加亚致死剂量的H2A时，将会大大地提高短梗霉黑色素的产量。
本发明菌种使用天津科技大学申请中菌种，申请号为CN200910071018，发明名称为一种大量产生β -聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培养方法，
公开日期是 2011. 02. 23。该专利中公开了出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ΤΚΡΜ00006，菌种保藏号为CGMCC3337，2009年10. 14日保藏。
有益效果
本发明提出的发酵培养基配方，与现有发酵培养基相比，黑色素产量由2.47g/L 提高到12. 86g/L，发酵周期有7天缩短为3天，使培养基底物得到充分利用，提高了原料的利用率，降低了生产成本。
具体实施方式
实施例1
(1)菌种活化将保藏在PDA培养基斜面上菌，在22恒温培养4小时，得到活化菌株；
(2)取一环出芽短梗霉菌种接入装有50毫升培养基的500毫升挡板瓶中。种子培养基的水溶液组成为(g/L):葡萄糖20，土豆汁100，牛肉膏1，蒸馏水，pH 4，121°C灭菌 20min ；摇瓶于25°C，转速为150r/min的摇床上培养Mh，作为种子液。
(3)发酵培养基现有的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L):葡萄糖40，土豆汁 400，牛肉膏1，FeSO4O. 02，pH 4，121°C灭菌20min。121°C高压蒸汽灭菌20min ；或本发明提出的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L):葡萄糖40，土豆汁400，牛肉膏1，FeSO4O. 02, H2025mmoL/L，蒸馏水，pH 4，121°C 灭菌 20min。
(4)将种子液接种于IOL自动控制发酵罐中，发酵培养基分别为现有发酵培养基和本发明提出的发酵培养基，装液量为7L，接种量为(V/V)，发酵搅拌速度为200r/min，发酵温度为25°C，通气量为0.5(V/V)，罐压为O.OlMpa，pH 4.0，分别发酵3天。发酵得到的发酵液在5000r/min的条件下离心5min，所得上清液先以6mol/L盐酸酸解，后用50%的甲醇进行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用lmol/L碱性溶液溶解得到黑色溶液。最后用 3mol/L盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色素。
(5)发酵液经上述处理后，分别获得7. 49g/L和11. Mg/L的黑色素，采用本发明的发酵培养基，黑色素的产量提高了 50. 1%。
实施例2:
(1)菌种活化将保藏在PDA培养基斜面上的菌种，在下恒温培养6小时，得到活化菌株。
(2)取一环出芽短梗霉菌种接入装有50毫升培养基的500毫升挡板瓶中。种子培养基的水溶液组成为(g/L):葡萄糖40，土豆汁700，牛肉膏5，蒸馏水，pH 4，121°C灭菌 20min ；摇瓶于^°C，转速为230r/min的摇床上培养36h，作为种子液。
(3)发酵培养基现有的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L):葡萄糖40，土豆汁 400，牛肉膏UeSO4 0.02，蒸馏水，pH 4，121°C灭菌20min ；或本发明提出的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L)葡萄糖40，土豆汁400，牛肉膏1，FeSO4O. 02，H20225mmoL/L，蒸馏水， pH 4，121°C 灭菌 20min。
(4)将种子液接种于IOL自动控制发酵罐中，发酵培养基分别为现有发酵培养基和本发明提出的发酵培养基，装液量为7L，接种量为10% (V/V)，发酵搅拌速度为500r/ min，发酵温度为^°C，通气量为1(V/V)，罐压为O.OlMpa，pH 4.0，分别发酵4天。发酵得到的发酵液在5000r/min的条件下离心5min，所得上清液先以6mol/L盐酸酸解，后用50% 的甲醇进行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用lmol/L碱性溶液溶解得到黑色溶液。最后用 3mol/L盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色素。
(5)发酵液经上述处理后，分别获得6. 95g/L和11. 74g/L的黑色素，采用本发明的发酵培养基，黑色素的产量提高了 68. 9%。
实施例3
(1)菌种活化将保藏在PDA培养基斜面上的菌种，在25°C下恒温培养6小时，得到活化菌株；
(2)种子培养取一环出芽短梗霉菌种接入装有50毫升培养基的500毫升挡板瓶中。种子培养基的水溶液组成为(g/L):葡萄糖20，土豆汁100，牛肉膏1，蒸馏水，pH 4， 121°C灭菌20min ；摇瓶于温度为25°C，转速为200r/min的摇床上培养Mh，作为种子液；
(3)发酵培养基现有的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L):葡萄糖40，土豆汁 400，牛肉膏1，FeSO4O. 02，蒸馏水，pH 4，121°C灭菌20min ；或本发明提出的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L)葡萄糖40，土豆汁400，牛肉膏1, FeSO4O. 02，H20215mmoL/L，蒸馏水， pH 4，121°C 灭菌 20min。
(4)将种子液接种于10L自动控制发酵罐中，发酵培养基分别为现有发酵培养基和本发明提出的发酵培养基，装液量为7L，接种量为6% (V/V)，发酵搅拌速度为300r/min， 发酵温度为25°C，通气量为0.8作八)，罐压为0.0说 ？!1 4，分别发酵7天和5天。发酵得到的发酵液在5000r/min的条件下离心5min，所得上清液先以6mol/L盐酸酸解，后用50% 的甲醇进行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用lmol/L碱性溶液溶解得到黑色溶液。最后用3mol/L盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色素。
(5)发酵液经上述处理后，分别获得8. 46g/L和12. 86g/L的黑色素，采用本发明的发酵培养基，黑色素的产量提高了 52%。
权利要求
1 一种利用氧化胁迫提高出芽短梗霉菌黑色素产量的方法，其特征在于先将出芽短梗霉(AurecAasidium Pullulans)菌株活化后摇瓶培养，将摇瓶种子液体按照发酵培养基体积的1 10%接种于发酵培养基，进行发酵，发酵液在5000r/min的条件下离心5min，所得上清液盐酸酸解后用甲醇沉淀，得黑色素粗品，上述粗品用碱性溶液溶解得到黑色溶液后用盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色素。
2.如权1所述一种利用氧化胁迫提高出芽短梗霉菌黑色素产量的方法，步骤如下(1)菌株活化将保藏在PDA培养基斜面上菌，在22 恒温培养4 8小时，得到活化菌株；(2)摇瓶培养从斜面上挑取一环出芽短梗霉菌接入种子培养基中摇瓶培养；(3)液态发酵将种子液接种于IOL自动控制发酵罐中，发酵培养基装液量7L，接种量为1 % 10 %，发酵搅拌速度为200 500r/min，发酵温度为25°C，通气量为0. 5 1 (V/ V)，罐压为0. 01 0. 02Mpa，pH 4. 0 7. 0，发酵3 5天;(4)黑色素提取发酵液在5000r/min的条件下离心5min，所得上清液盐酸酸解后用甲醇沉淀，得黑色素粗品，上述粗品用碱性溶液溶解得到黑色溶液，后用盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色素。
3.如权1所述一种利用氧化胁迫提高出芽短梗霉菌黑色素产量的方法，特征在于所述碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钾或氨水溶液。
4.如权1所述一种利用氧化胁迫提高出芽短梗霉菌黑色素产量的方法，特征在于所述发酵培养基组成为(g/L):葡萄糖40，土豆汁400，牛肉膏IfeSO4 0.02， H2O2 5mmoL/L 25mmoL/L，蒸馏水，pH 4。
5.如权1所述一种利用氧化胁迫提高出芽短梗霉菌黑色素产量的方法，特征在于所述发酵培养基组成为(g/L)葡萄糖40，土豆汁400，牛肉膏l，FeS04 0 . 02， H2O2 15mmoL/L，蒸馏水，pH 4。6. 一种出芽短梗霉菌株(Aureobasidium Pullulans) CGMCC3337在黑色素发酵中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种利用氧化胁迫提高出芽短梗霉黑色素产量的方法，特征是将出芽短梗霉菌活化4～8小时，然后摇瓶培养12～36小时，按发酵培养基体积的1～10％接种于发酵培养基，进行液态发酵。发酵得到的发酵液在5000r/min的条件下离心5min，所得上清液先以盐酸酸解，后用甲醇进行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用碱性溶液溶解得到黑色溶液。最后用盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色素。与采用其他发酵培养基相比，采用本发明的培养基，黑色素产量由2.47g/L提高到12.86g/L，发酵周期由7天缩短为3天，使培养基底物得到充分利用，提高了原料的利用率，降低了生产成本。
文档编号C12P1/02GK102517336SQ20111042652
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者乔长晟, 敖爱华, 汪建明, 郝华璇, 马正旺 申请人:天津北洋百川生物技术有限公司