专利名称：一种姜花萜类花香基因Hctps1启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种姜花萜类花香基因启动子及其应用。
背景技术：
WiVcXHedychium coronarium Koenig)是单子叶植物，为姜科姜花属多年生草本植物。姜科花卉约有50个属1500多种，代表性的品种有姜荷花、姜花、红丝姜花、红姜花、 郁金、红花月桃、瓷玫瑰(火炬姜)等。不同的姜花品种其香气不同，其中，白姜花花形优美， 芳香浓郁，是园林绿化和夏季切花的优良材料，也是提取芳香油的工业原料。高等植物发育过程中花的形成是一个十分复杂的过程，在这个过程中，大量基因的协同表达受到不同启动子的调节和控制。例如菊花UEPl启动子在伞形花序和花盘小花的花瓣中特异表达，其表达量是CaMV 35S启动子的50倍(Annadana，2002，Transgenic Research，11 (4) :437-445)。将果实成熟期特异表达的E8启动子和仙女扇的LIS基因导入番茄，成熟的果实合成并释放香气明显的S-芳樟醇和8-羟基芳樟醇(Lewinsohn，2001， Plant Physiology, 127 (3) 1256-1265)。采用果实成熟时期的特异表达的PG启动子，将柠檬罗烯香叶醇合成酶(GES)基因转入番茄，该基因在转基因番茄果实中过量表达导致香叶醇的积累量增加，改变了番茄果实风味(Davidovich，2007，Nature Biotechnology, 25 (8) 899-901)。利用APETALA1 (API)特异启动子驱动在花分生组织和第1、2轮花器官中表达细胞分裂素合成酶(isopentyl transferase, IPT)基因IPT4，研究结果表明APETALA1启动子驱动AtIPT4在转基因拟南芥中表达导致花和花器官发育异常(于明明，2009，植物学报， 44 (1) :59-68)。番茄AOC启动子转化烟草发现，在花部器官可表达且表达受茉莉酸甲酯和伤处理的诱导(Irene Stenzel，2008，Phytochemistry 1859 - 1869)。这些特异性启动子的应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。香气是观赏植物的重要品质之一，与植物其他观赏性状的遗传改良相比，植物花香代谢产物的多样性及其相关酶和基因表达调控的复杂性增加了植物花香基因工程改良的难度。目前对花香基因启动子的研究较少。旱莲木HMGR基因hmgl启动子可以在转基因烟草表皮细胞中优先表达⑶S报告基因(Burnett，1993，Plant Physiology, 103 (1) 41-48)。两种山字草属植物仙女扇和优雅春再来都存在LIS基因，但后者基本没有气味且 LIS 基因仅在柱头中表达(Cseke，1998，Molecular Biology and Evolution , 15 (11) 1491-1498)。对二者启动子序列比较时发现，后者在推测的TATA-box和CAAT_box上游有插入片段，而其他序列则完全一致，所以可能是由于启动子差异导致最后芳樟醇的释放量大不相同。对姜花香气研究发现，在姜花释香中起作用的主要是萜类化合物，包括沉香醇、 罗勒烯、1，8_桉油醇、月桂烯、桧烯等(范燕萍等，2003，园艺学报，30 (4) :475_475)，并且 4种不同颜色姜花的释香成分和含量都有显著性差异(范燕萍等，2007，园艺学报，34 (1) 231-234)。在不同转化体植物中，目标转基因表达水平差异大，存在限速酶基因表达与目标产物合成有时不一致等问题(孙明等，2007，安徽农业科学，35(11) :3169-3171)。在萜
3类和苯丙素类物质及其衍生物中，除了花香物质外还有大量的生理活性物质，因此在改造相关代谢途径的过程中，还可能会发生一些意想不到的代谢紊乱，采用花朵特异表达启动子控制相关酶的表达可能会降低这一问题发生的概率(缪昊抿等，2007，分子植物育种， 5(6) 67-74)。通过启动子的研究应用来调控基因表达，使植物目标产物在特定部位、特定时期和一定诱导条件下表达，为今后采用该花器官特异表达和在伤害、病虫害诱导条件下改良植物的花香、花色和提高抗性有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中植物某一基因不能人为调控的缺陷，提供一种姜花萜类花香基因启动子。本发明的另一目的是提供上述姜花萜类花香基因启动子的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种姜花萜类花香基因启动子，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。启动子是指基因上游一段可与RNA聚合酶及其他一些影响转录的反式因子结合而准确有效地起始转录的DNA序列。本发明克隆了姜花萜类花香基因端的上游调控序列，总长为1131bp，该序列具有启动子活性，并且在花器官部分特异表达，是一个花特异性启动子。本发明把所克隆的启动子用在线软件进行了转录起点的确定和相关作用元件的预测，ZfcTPW的5’端上游序列除了具有大多数高等植物启动子所有的TATA-box和 CAAT-box等保守序列外，还具有许多与光调控有关的元件，如G-box、GAG-moti f、ATCT -motif等反应元件；许多与逆境调控相关的元件，如CGTCA-motif、CAT_box、TCA-element 等响应元件。一种表达载体，其特征在于含有上述姜花萜类花香基因启动子，如将该启动子序列插入载体PCAMBIA1300G的多克隆位点构建而成的表达载体等。含有上述表达载体的基因工程菌，优选宿主菌为大肠杆菌DH5 α，即表达载体转化大肠杆菌(五co/i)DH5a。本发明的姜花萜类花香基因启动子在调控下游基因表达中的应用。如制备转基因植物，将该姜花萜类花香基因连接到植物转化载体中，然后导入姜花或其它植物细胞中，获得表达所述姜花萜类花香基因启动子的转基因花香品种或抗性品种。在姜花萜类花香基因论启动子在调控下游基因表达时，可以通过茉莉酸甲酯或损伤处理进行诱导。本发明的姜花萜类花香基因启动子还可以用于鉴定姜花或其它植物的花香基因型，如根据该基因产生的特异性分子标记，制备分子探针进行鉴别。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明的姜花萜类花香基因启动子启动活性高，能够调控植物花香形成的相关萜类合成酶，且可人为控制，为以后采用基因工程技术研究TPS基因家族成员的姜花花香中的作用、改良植物的观赏性状、花卉品质等提供了有用的分子工具，在植物基因工程领域具有广阔的应用前景。
图1.实施例2 Hctpsl启动子转基因烟草植株特异PCR检测，其中质粒-.Hctpsl 启动子_gus重组质粒；M =DNA DL 2000分子量标准；CK 未转化植株；0_16 特异引物扩增的PCR产物。图2.实施例Wctpsl启动子转化烟草后的⑶S活性表达，A，野生型烟草花瓣；B， 未诱导转基因烟草花瓣；C，MeJA处理后花瓣中；D，伤害处理后花瓣中；E，未诱导花萼；F， 伤害处理后花萼；G，未诱导茎中；H，伤害处理后茎中；I，未诱导叶；J，MeJA处理后叶中；K， 虫害处理后叶和维管束中；L，伤害处理后幼嫩叶子。
具体实施例方式实施例1白姜花花香基因&启动子的获得 1.实验材料和试剂
白姜花材料白姜花的叶片。菌种大肠杆菌五coli DH5a。载体pCAMBIA1300G。工具酶和修饰酶各种限制性内切酶和修饰酶购自Promega公司和TAKARA公司。化学试剂 化学药品均为国产分析纯。试剂盒质粒DNA提取用试剂盒为上海生工公司产品；回收DNA 用试剂盒为上海生工公司的DNA片段快速纯化/回收试剂盒；引物合成由上海生工公司合成。测序由深圳华大基因科技有限公司完成。2. DNA 的提取
实验以姜花的叶片为材料，用改良的CTAB法提取DNA，具体步骤如下 (1)取姜花叶片0. Γ0. 2g在液氮中研磨后转移至1. 5ml离心管中。(2)加入 1 ml CTAB (Tris 100 mM，NaCl 1.4 Μ, 20 mM EDTA，CTAB 2%，巯基乙醇 0. 1%)，65°C，30分钟。每隔10分钟，颠倒一次。(3)加Iml酚氯仿(1 1)混合液，颠倒几次，10000 rpm离心10分钟，转移上清至一新的离心管，加等体积的氯仿异戊醇04 1)，混勻，10000 rpm离心10分钟。转
移上清至一新的离心管。(4)加等体积的异丙醇，颠倒混勻，10000 rpm离心10分钟，除去上清，70%乙醇洗一次，真空抽干，溶于30 μ L的无菌水中，用于PCR检测。3.论77^/启动子全长序列的获得
采用hiTAIL-PCR技术克隆论7757的5'端上游调控序列。根据已知的论7757的 DNA序列，在其5'端设计3个向外的特异性巢式引物spl、sp2、sp3，随机简并引物参照 Liu 禾口 Chen 等(2007, High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.Biotechniques,43 (5) :649- 650,652, 654)文献中设计的5个随机简并引物(LAD-I、2、3、4和ACl)，具体引物序列如下 spl 5' - CTG GTA ATT GGC CGA TCG CCT CGA -3，(SEQ ID N0:2)； sp2 5'- GCA TCG GAT GAG TGT GAG GCA CGG TTG CTT GAC G -3，(SEQ ID N0:3)； sp3 5'- GGT GGC GCA TCG CCG GAG TGC AAA GAG GTG -3， (SEQ ID N0:4)。扩增的体系和程序参照文献(Liu和Chen等，High-efficiency thermalasymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences , Biotechniques，43 (5) :649- 650，652，654)中的进行。把扩增出DNA片段从琼脂糖胶中回收并连接到PMD-19T vector，转化五coli. DH5 α，酶切鉴定后测序，获得论77^/基因5 ‘ 端上游调控序列，如SEQ ID NO: 1所示。实施例2 HcTPSl基因5'端启动子功能分析 1.启动子表达载体构建
根据启动子序列设计片段相对应的包含私BamHl酶切位点的特异引物，上下游引物分别命名为Pl和P2。片段引物序列
Pl 5' - GGC GCA TGC ATT ACG ATG GAC TCC AGA GC S Sphl (SEQ ID N0:5)； P2 5' - GGC GGA TCC GAT TTA GTG GCT TTT TGT TTT AG -3’3mHI (SEQ ID N0:6), 常规PCR扩增HcTPSl基因5 ‘端上游调控序列。pCAMBIA1300G植物表达载体用SphY称BamHl限制性内切酶进行双酶切，1%琼脂糖凝胶回收大片段。利用T4 DNA连接酶将目的片段(带有酶切位点的论炉幻基因5'端上游调控序列)定向插入到植物表达载体。将连接产物转化大肠杆菌(五colOm^a感受态细胞，经酶切和测序鉴定后，获得重组植物表达载体。制备根癌农杆菌EHA105感受态细胞，将上述重组植物表达载体转入农杆菌。2.启动子表达载体在烟草的遗传转化
(1)预培养将无菌叶片切成0.5 cmX0.5 cm的小块，接种在诱导培养基上进行预培养，光照培养纩3 d。2)农杆菌侵染及共培养取预培养2 3 d后的材料，加入制备好的农杆菌悬浮菌液，侵染5 10 min，倒掉菌液，取出外植体置于无菌吸水纸上吸去附着的菌液，重新置于原预培养基上，28 °C暗培养3 d。3)抑菌和筛选培养将共培养后的外植体转接到抑菌筛选培养基(MS+1. 0mg/L 6-BA+0. 2 mg/L NAA+250mg/LCarb+30 mg/L Hyp)上选择培养20 d后，外植体的转化细胞将产生抗性愈伤组织，将这些抗性愈伤组织转入相应的选择分化培养基(MS+0. 1 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA +250 g/L Carb + 30 mg/L Hyp)上进行分化出芽培养。4)诱导生根在选择生根培养基(l/^MS+250 mg/L Carb)上诱导约4周后，不定芽长至2 cm以上，将叶盘边缘长出的幼芽从基部与叶盘切下，插入含有选择压的生根培养基上进行生根培养。5)炼苗、移栽及管理待植株生长出大量根时，准备移栽。先进行炼苗将组培苗从组培室拿出，旋松瓶盖，在室内放置广7 d，每天晒广2 h太阳；然后取出苗子，洗净根系上的培养基，移栽到灭过菌的培养土中，移栽后罩上打有小孔的透明塑料，以保持759Γ85% 的湿度，25°C，光照150(T2500 Lux，光周期以每天光照14 16 h/8^10 h小时黑暗。培养 1(T15 d左右，移到室外进行适应生长。(6)转基因植株的PCR检测CTAB法提取抗性植株叶片基因组DNA，用预先设计的包含私BamHl酶切位点的论77^/基因特异引物及潮霉素磷酸转移酶基因引物如 II 进行PCR扩增，能扩增出条带的为阳性植株。hpt II 引物上游引物5' -CTT CTA CAC AGC CAT CGG TCC AGA-3‘ (SEQ IDN0:7)；
下游引物5' -GAT GTA GGA GGG CGT GGA TAT GTC-3‘ (SEQ ID NO:8)。检测结果见图1，通过图1可以看出，启动子已经转化到烟草植株中。实施例3转基因植株⑶S组织化学检测 1.转基因植株GUS组织化学染色
实验材料为经过PCR检测初步确认的转基因植株，用非转基因植株作为阴性对照，取不同发育时期的根、茎、叶、花瓣、花萼、柱头、花丝、花药及花梗等部位进行染色、脱色，肉眼观察并拍照记录。GUS染色液的配制
权利要求
1.一种姜花萜类花香基因启动子，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一种表达载体，其特征在于含有权利要求1所述姜花萜类花香基因启动子。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于由权利要求1所述姜花萜类花香基因 Hctpsl启动子插入载体pCAMBIA1300G的多克隆位点构建而成。
4.一种基因工程菌，其特征在于含有权利要求2或3所述表达载体。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于宿主菌为大肠杆菌DH5α。
6.权利要求1所述启动子在调控下游基因表达中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于通过茉莉酸甲酯或损伤处理进行诱导表达。
8.权利要求1所述启动子在鉴定姜花萜类花香基因中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种姜花萜类花香基因Hctps1启动子及其应用。该姜花萜类花香基因Hctps1启动子核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，总长为1131bp，是一个花特异性启动子。本发明的姜花萜类花香基因Hctps1启动子启动活性高，能够调控植物花香形成的相关萜类合成酶，且可人为控制，为以后采用基因工程技术研究TPS基因家族成员的姜花花香中的作用、改良植物的观赏性状、花卉品质等提供了一种高效的分子工具，在植物基因工程领域具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/63GK102586250SQ201110453640
公开日2012年7月18日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者余让才, 李昕悦, 玉云祎, 范燕萍, 郑少缘 申请人:华南农业大学