专利名称：植物基因组dna的循环提取方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学实验中植物DNA分离提取和纯化技术，尤其涉及一种植物基因组DNA的循环提取方法。
背景技术：
基因组DNA的提取是分子生物学实验很重要的一个环节；基因组DNA的质量和产量，直接影响分子生物实验中与DNA有关的后续实验的进行。植物物种间的异质性往往限制了基因组DNA提取方法的适用范围。用于植物基因组DNA提取的材料主要是叶片，叶片内次生代谢产物的复杂程度与基因组DNA的质量和产量密切相关。幼嫩叶片细胞分裂旺盛，DNA含量高，次生代谢产物积累量少，被公认是基因组DNA提取的最佳材料；而植物的成熟叶片则相对积累了大量的次生代谢产物，不利于提取高质量的基因组DNA。许多DNA提取的方法局限于从幼嫩植物叶片中提取高质量和高产量的基因组DNA。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种植物基因组DNA 的循环提取方法(简称方法)；本方法适用范围广，且能从成熟叶片中提取到高产量的基因组 DNA。本发明的目的是这样实现的本方法包括步骤①将植物组织样品在液氮速冻下磨成细粉后，取0. 3g转入2mL离心管中；②加入500 μ 1预热的3% CTAB提取液，充分混勻，65°C水浴40min ；③12000rpm常温离心15min，转移上清液到新的1. 5mL离心管中，加入100 μ 1的 24 1的氯仿-异戊醇，充分混勻后，常温12000rpm离心15min，抽提1 2次，抽提后的上清液转入新的离心管中，加入两倍体积的提前预冷到-20°C的100%酒精；放置于_20°C 冰柜30min，让DNA沉淀充分析出，将析出的DNA沉淀转移到含有lmL70 %酒精的1. 5mL离心管中，漂洗1 2次，每次30min，倒干酒精，待DNA沉淀干燥后，用100 μ 1的Ta ^充分溶解，并用1μ 1浓度为10μ g/mLRNA酶37°C消化30min，该过程得到的DNA样品，称为IstDNA ；④步骤③中转移上清液后离心管底部的组织样品，继续加入500 μ 1的3% CTAB 提取液进行提取，该组织样共循环提取4次，依此又得到3批次DNA样品，分别称为2ndDNA、 3rdDNA 和 4thDNA。所述100%酒精是指纯的酒精溶液。所述70%酒精是指70mL纯酒精用无菌纯净水定容到IOOmL的酒精溶液。本方法中组织样循环提取4次，持续时间较长，但本方法步骤灵活，可视具体情况删减循环次数。本方法所提取的成熟叶片DNA，IstDNA可能含有较多的次生代谢产物，DNA的产量
3可能较低，可直接弃掉第1次水浴后离心产生的上清液，直接进行后3次DNA的提取。而 2" )ΝΑ、3^ΝΑ和4thDNA的产量相对高，浓度大致为100-500ng/l·! 1 ；质量也高，满足PCR等分子生物学实验的要求。本方法所使用的3% CTAB 提取液成分为3% CTAB, IOOmM Tris-HCl，20mM EDTA, 1. 4M NaCl，pH 值为 8. 0。所述的3%是指 3g/100mL。本方法所使用的TaiE 成分为=IOmM Tris-HCl,0. ImM EDTA，pH 8. O0工作原理叶片组织通过一次提取不能充分分离基因组DNA，故可通过多次提取的方式充分提取叶片内所含的基因组DNA。具体是叶片组织样加入DNA提取液后在65°C 下裂解细胞，离心转移的上清再经过氯仿异戊醇的萃取、酒精的沉淀，得到絮状的DNA沉淀，最后利用70%乙醇洗涤DNA沉淀，得到第1次DNA沉淀，即IstDNA ；而离心转移上清后位于离心管底部的组织样可继续加DNA提取液，进行新一轮的基因组DNA提取，组织样可循环提取4次，又得到3批次DNA样本。本发明可分离到较高产量和质量的植物基因组DNA，满足分子生物学实验对基因组DNA浓度和纯度的要求。2、植物基因组DNA的鉴定用本方法提取的植物基因组DNA样品，可经0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA,并经PCR扩增基因组DNA样品鉴定DNA的质量。3、本方法的用途本方法可以从多种植物叶片中提取到较高产量和质量的基因组DNA。尤其可克服植株成熟叶片积累的大量次生代谢产物对基因组DNA提取的影响，能从植物成熟叶片中提取到符合分子生物学实验要求的基因组DNA。本发明具有下列优点和积极效果
①本方法中循环提取的步骤，1份组织样可进行4次基因组DNA提取，得到4次基因组DNA样本，使基因组DNA产量显著提高；②本方法适用的植物物种范围较广，且能从植物成熟叶片中提取到较好的基因组 DNA。本发明适用于植物基因组DNA的提取。
图1是植物基因组DNA循环提取方法的流程图，图中1-植物组织，2-DNA提取液，3_组织样，4_上清液，5-DNA沉淀。图2是使用本方法提取的小麦、大麦、高粱和玉米成熟叶片鲜样的基因组DNA电泳图片；图中W、B、S、C分别代表小麦、大麦、高粱和玉米，每个物种的组织样是10个不同基因型叶片的混合样，小麦和大麦设置2个重复，高粱和玉米设置3个重复；英文小写字母 “a”和“b”分别代表DNA提取过程中加入组织样的CTAB提取液的体积500 μ 1和1000 μ 1， 标注在英文小写字母a和b前的阿拉伯数字1、2、3、4分别代表lstDNA、2ndDNA、3rfDNA、4thDNA ； 10ng、50ng和IOOng是已知浓度的标准λ DNA的上样量，可根据其对应的泳道的DNA条带的亮度估算待测DNA的浓度；每个DNA样本的上样量原DNA溶液稀释25倍后，取5 μ 1稀释
4液上样。图3是利用1条ISSR引物扩增小麦、大麦、高粱和玉米DNA样本后的电泳图片；图中W、B、S、C分别代表小麦、大麦、高粱和玉米，阿拉伯数字1、2、3和4分别代表 IstDNAJndDNAJlrdDNA和4thDNA，ISSR引物是哥伦比亚大学开发的100条ISSR引物中编号为 873的引物；所使用marker为B031 (购买于北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，图中已标出该marker的500bp和IOOObp条带位置。英译汉UCTAB =Cetyltrimethyl Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化铵；2> EDTA =Ethylene Diamine Tetraacetic Acid, Zi二月安0 !；
具体实施例方式下面结合附图和实施例详细说明一、提取方法选用4个物种，分别是小麦、大麦、水稻和玉米(小麦和大麦各2个重复，水稻和玉米各3个重复)，CTAB提取液的用量是500 μ 1。另外为了验证CTAB提取液的用量对DNA产量的影响，选用小麦和大麦两个物种(各2个重复)，使用ΙΟΟΟμ 1 CTAB提取液进行基因组 DNA的提取。使用本方法进行下述14次提取作业①将植物组织样品在液氮速冻下磨成细粉后，取0. 3g转入2mL离心管中；②加入500 μ 1预热的3% CTAB提取液，充分混勻，65°C水浴40min ；③12000rpm常温离心15min，转移上清液到新的1. 5mL离心管中，加入100 μ 1的 24 1的氯仿-异戊醇，充分混勻后，常温12000rpm离心15min，抽提1 2次，抽提后的上清液转入新的离心管中，加入两倍体积的提前预冷到-20°C的100%酒精；放置于_20°C 冰柜30min，让DNA沉淀充分析出，将析出的DNA沉淀转移到含有lmL70%酒精的1. 5mL离心管中，漂洗1 2次，每次30min，倒干酒精，待DNA沉淀干燥后，用100 μ 1的Ta ^充分溶解，并用1μ 1浓度为10μ g/mLRNA酶37°C消化30min，该过程得到的DNA样品，称为IstDNA ；④步骤③中转移上清液后离心管底部的组织样品，继续加入500 μ 1的3% CTAB 提取液进行提取，该组织样共循环提取4次，依此又得到3批次DNA样品，分别称为2ndDNA、 3rdDNA 和 4thDNA。二、琼脂糖凝胶电泳检测本方法提取的基因组DNA如图2，小麦和大麦进行500 μ 1和1000μ 1提取液用量的对比实验，这两个处理间每批次提取的基因组DNA产量差异不大，说明循环提取的方法比增加提取液用量的方法能有效的从植物组织中充分的提取基因组DNA。如图2，采用上述方法所提取的DNA通过电泳检测后，除了小麦的IstDNA可观察到清晰的条带外，其余3个物种都观察不到条带。4个物种的2nd和都观察到清晰的条带。 除高粱WhDNA没有观测到条带外，小麦、大麦、玉米的WhDNA都观测到清晰的条带。可见，采用本发明方法所提取的小麦、大麦、高粱和玉米的基因组DNA产量高；而小麦、大麦、高粱和玉米四批次基因组DNA的差异可反应出不同植物物种间叶片内所含化学成分的异质性；除小麦外，大麦、高粱和玉米基因组DNA的IstDNA琼脂糖检测不到，可反映成熟叶片内较多的次生代谢产物严重影响了基因组DNA的提取。综上所述可充分说明本发明方法适用的植物物种范围较广，且能从植物成熟叶片中提取到高产量的基因组DNA。三、PCR扩增验实验结果如图3，大麦、高粱和玉米的IstDNAJndDNAJlrdDNA和4thDNA的ISSR扩增电泳图谱清晰、一致。小麦的2ndDNA JlrdDNA和fhDNA间扩增电泳图谱清晰、一致，而IstDNA稍异于其他三次电泳图谱。说明本发明的基因组DNA提取方法从成熟叶片中得到的四批次DNA，PtDNA 中可能含有的次生代谢产物影响了 PCR扩增，而后三次DNA质量较高，满足PCR的要求。
权利要求
1.一种植物基因组DNA的循环提取方法，其特征在于包括如下步骤①将植物组织样品在液氮速冻下磨成细粉后，取0.3g转入2mL离心管中；②加入500μ 1预热的3% CTAB提取液，充分混勻，65°C水浴40min ；③12000rpm常温离心15min，转移上清液到新的1.5mL离心管中，加入100μ 1的 24 1的氯仿-异戊醇，充分混勻后，常温12000rpm离心15min，抽提1 2次，抽提后的上清液转入新的离心管中，加入两倍体积的提前预冷到-20°C的100%酒精；放置于_20°C 冰柜30min，让DNA沉淀充分析出，将析出的DNA沉淀转移到含有lmL70 %酒精的1. 5mL离心管中，漂洗1 2次，每次30min，倒干酒精，待DNA沉淀干燥后，用100 μ 1的Ta ^充分溶解，并用1μ 1浓度为10μ g/mLRNA酶37°C消化30min，该过程得到的DNA样品，称为IstDNA ；④步骤③中转移上清液后离心管底部的组织样品，继续加入500μ 1的3% CTAB提取液进行提取，该组织样共循环提取4次，依此又得到3批次DNA样品，分别称为2ndDNA、3rfDNA 和 4thDNA。
2.按权利要求1所述的一种植物基因组DNA的循环提取方法，其特征在于所述的 3% CTAB 提取液成分为3% CTAB, IOOmM Tris-HCl, 20mM EDTA, 1. 4M NaCl，pH 值为8.0。
3.按权利要求1所述的一种植物基因组DNA的循环提取方法，其特征在于所述的 Ttl lE 成分为10mM Tris-HCl,0. ImM EDTA, pH 8. 0。
全文摘要
本发明公开了一种植物基因组DNA的循环提取方法，涉及分子生物学实验中植物基因组DNA分离提取技术。传统基因组DNA提取步骤主要包括细胞的破碎、非DNA成分的抽提、DNA的析出、离子的去除、DNA的干燥和溶解。本方法在传统基因组DNA提取步骤基础上增加了组织样品循环提取的步骤。具体是指1份组织样可先后加入4次DNA提取液，进行4次基因组DNA的分离过程，得到4次基因组DNA样品。本方法适用的植物物种范围较广；能从植物叶片，尤其是成熟叶片中提取到高产量的基因组DNA。
文档编号C12N15/10GK102433324SQ201110453509
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者张玲玲, 彭俊华 申请人:中国科学院武汉植物园