专利名称：从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法
技术领域：
本发明涉及的是微生物领域中的菌种分离方法，具体的是一种从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法。
背景技术：
目前人们可分离培养的微生物只占世界上微生物总量的1%左右，还有99%的微生物目前没有分离得到纯培养菌株。对于好氧菌的纯培养的分离与纯化技术自1880年Koch 发明的平板分离法以来已有130多年的历史了，稀释平板涂布法、稀释混合平板法、平板划线法、显微操作器单细胞挑取法都是常规的分离和纯化微生物的方法。前三种方法不需要特殊昂贵的仪器设备，极易操作，一般情况下都能顺利进行，达到好的效果。对于厌氧微生物的分离与培养有着特殊性，主要是采取各种方法使他们处于没有氧的环境或氧化还原点位低的条件下进行培养。对于厌氧要求相对较低的一般厌氧菌的培养主要有碱性焦性没食子酸法、庖肉培养基法，这两种方法是最常用的厌氧培养技术，虽然两种方法无需特殊昂贵的设备操作简单，适用于任何可密封的容器，可迅速建立厌氧环境，但其缺点是在氧化过程中会产生少量的有毒气体，会抑制某些厌氧菌的生活，其中庖肉培养基法多应用于厌氧的芽孢菌的分离与保存中。对于严格厌氧菌的分离和培养主要有 Hungate滚管技术、厌氧罐法、厌氧手套操作培养箱，以上方法操作复杂对实验仪器的要求也比较高并且试验成本很高，但也有其自身的优点，就是可以保证环境的绝对厌氧，也不会产生任何有毒的物质而抑制微生物的生长。纤维素分解复合菌系是一组以高温期堆肥为原料富集获得的具有高效稳定分解纤维素能力的细菌复合群体(一组木质纤维素分解菌复合系的筛选及培养条件对分解活性的影响，王伟东、崔宗均、牛俊玲、朴哲、刘建斌，中国农业大学学报，9 (5) 7 11,2004), 为了研究其微生物组成，筛选出分解能力更强的菌株，需要将复合菌系进行分离，分离出具有分解纤维素功能的单菌。但是在现有研究中，得到具有分解纤维素功能的单菌比较困难， 因为纤维素分解复合菌系中具有分解纤维素功能的菌株通常为厌氧菌，并且在分离的过程中需要随时观察降解纤维素的能力，以上提到的几种厌氧菌分离方法均不适宜。分解纤维素的厌氧菌的分离关键点在于1、单菌的分离；2、单菌功能的随时检测。目前一般采用 Hungate厌氧管技术，Hungate厌氧管能随时观察纤维素降解的情况，但不便进行单菌分离操作，易染菌，因为Hungate厌氧管体比较长，即便产生了单个菌落，菌落在挑出时难度也比较大，容易碰倒其他菌落、挑出时极易与管壁接触，造成挑出的单菌不纯，影响后续实验； 而厌氧罐不便随时观察菌种降解纤维素情况。因此，需要发明一种能够适合分解纤维素的厌氧菌的分离方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题提供一种从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法，解决目前Hungate厌氧管挑出菌落困难，容易染菌，造成菌落不纯以及厌氧罐法无法随时观察菌种降解纤维素情况的问题。本发明通过以下技术方案来实现从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法，包括以下步骤
A、将纤维素分解复合菌系用添加有滤纸的厌氧菌液体培养基在50°C培养5 8天，滤纸占厌氧菌液体培养基重量的1% 21 ；
B、取出菌液用磷酸缓冲液(以下简称PBS)按照1:10000 1000000的体积比进行稀
释；
C、稀释后的菌液用平板培养，平板为添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的0. 5% 1%，在50°C培养5 8天；
D、挑取单个菌落用添加有滤纸的厌氧菌液体培养基在50°C培养5 8天，滤纸占厌氧菌液体培养基重量的1% 21 ；
E、取能够降解滤纸的菌液，用添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基在50°C培养5 8 天，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的0. 5% 1% ；
所述的A、D、E步骤在Himgate厌氧管中进行，C步骤在厌氧罐中进行。重复D、E步骤3 4次。所述的滤纸被秸秆取代。采用上述技术方案的积极效果本发明根据纤维素降解实验的实际问题，将 Hungate厌氧管和厌氧罐结合使用，用Himgate厌氧管进行平行培养，并能够肉眼观察秸秆或滤纸的降解情况，便于功能验证，克服了厌氧罐法观察不方便的问题，同时采用厌氧罐中的平板分离出单个菌落，从平板上挑出单个菌落是比较容易的，避免了菌落之间的相互接触，防止菌落污染，单菌率更高，方便后续步骤的进行，这样就克服了 Himgate厌氧管挑菌困难，容易产生污染的问题；本方法综合了两种方法的优点，适于从纤维素分解复合菌系中分离出能够分解纤维素的功能性厌氧菌株，大大提高了分离效率。
图1是本发明的流程示意图2是菌落的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶图谱。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明。实施例1
图1是本发明的流程示意图，如图所示，首先在Hungate厌氧管中，将纤维素分解复合菌系用添加有滤纸的厌氧菌液体培养基在50°C培养8天，滤纸占厌氧菌液体培养基重量的 1%，取出菌液用PBS按照1:10000的体积比进行稀释。取稀释后的菌液涂布在平板上，平板为添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的0. 5%，于厌氧罐中在50°C培养8天。待长出菌落后，挑取单个菌落用添加有滤纸的厌氧菌液体培养基在50°C培养6天，滤纸占厌氧菌液体培养基重量的1%，筛选出能够降解滤纸的菌液后，用添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基在50°C培养5天，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的 0. 5%，重新产生单菌落，得到单菌，此过程均在Himgate厌氧管中进行。
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其中，厌氧菌液体培养基的配方是每Ikg中含有KCl 0. 2g，K2HPO3 3. 5g，KH2PO3 1.5g，NaCl 1. 0g，NH4Cl 1. Og, MgCl 20. 5g，酵母粉 2. 0g，蛋白胨 2. 0g，半胱氨酸 0. 5g，微量元素5g，维生素lg，刃天青lg，余量为水。其中，刃天青为指示剂，在缺氧条件下，刃天青不显色，而一旦进入氧气后，刃天青则显示红色。半胱氨酸的作用是使其与液体环境中的氧进行氧化反应生成胱氨酸进而消耗氧，保证无氧环境。厌氧菌固体培养基是在厌氧菌液体培养基的基础上每Ikg中添加20g的琼脂。微量元素配方为每Ikg 中含有 FeCl2 · 4H20 1. 5g，MnCl2 · 4H20 IOOmg, CoCl2 · 6H20 190mg, NiCl2 · 6H20 24mg, ZnCl2 70mg, H3BO3 6mg, CuCl2 · 2H20 2mg, NaMoO4 · 2H20 36mg，余量为水。维生素配方为每Ikg中含有核黄素0. Ig,硫胺素0. 2g，尼克酰胺0. 2g，吡哆胺 0. 5g，泛酸0. lg，生物素0. 02g，氰钴胺素0. lg，对氨基苯甲酸0. lg，叶酸0. 05g，硫辛酸 0. 05g，余量为水。PBS 配方为每 Ikg 中含有 KCl 0. 2g, NaCl 8. 0g, Na2HPO3 1. 44g, KH2PO3 0. 24g, 1% (重量比)L-盐酸半胱氨酸，pH为7. 4。实施例2
首先在Hungate厌氧管中，将纤维素分解复合菌系用添加有滤纸的厌氧菌液体培养基在50°C培养5天，滤纸占厌氧菌液体培养基重量的2%，取出菌液用PBS按照1:100000的体积比进行稀释。取稀释后的菌液涂布在平板上，平板为添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的1%，于厌氧罐中在50°C培养7天。待长出菌落后，挑取单个菌落用添加有滤纸的厌氧菌液体培养基在50°C培养5天，滤纸占厌氧菌液体培养基重量的洲，筛选出能够降解滤纸的菌液后，用添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基在50°C培养6天，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的1%，重新产生单菌落，此过程均在 Himgate厌氧管中进行。为了使单菌更纯，挑取单个菌落用添加有滤纸的厌氧菌液体培养基在50°C培养5天，滤纸占厌氧菌液体培养基重量的2%，再取能够降解滤纸的菌液，用添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基在50°C培养6天，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的1%。 挑取单个菌落用添加有滤纸的厌氧菌液体培养基在50°C培养5天，滤纸占厌氧菌液体培养基重量的2%，再取能够降解滤纸的菌液，用添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基在50°C培养6天，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的1%。挑取单个菌落用添加有滤纸的厌氧菌液体培养基在50°C培养5天，滤纸占厌氧菌液体培养基重量的2%，再取能够降解滤纸的菌液， 用添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基在50°C培养6天，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的1%。挑取单个菌落用添加有滤纸的厌氧菌液体培养基在50°C培养5天，滤纸占厌氧菌液体培养基重量的洲，再取能够降解滤纸的菌液，用添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基在50°C培养6天，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的1%，产生单菌。其中，各种试剂的配方同实施例1。实施例3
首先在Hungate厌氧管中，将纤维素分解复合菌系用添加有秸秆的厌氧菌液体培养基在50°C培养6天，秸秆占厌氧菌液体培养基重量的1%，取出菌液用PBS按照1:1000000的体积比进行稀释。取稀释后的菌液涂布在平板上，平板为添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的0. 5%，于厌氧罐中在50°C培养5天。待长出菌落后，挑取单个菌落用添加有秸秆的厌氧菌液体培养基在50°C培养8天，秸秆占厌氧菌液体培养基重量的1%，筛选出能够降解秸秆的菌液后，用添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基在50°C培养8天，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的0. 5%，重新产生单菌落，此过程均在Himgate厌氧管中进行。为了使单菌更纯，挑取单个菌落用添加有秸秆的厌氧菌液体培养基在50°C培养8天，秸秆占厌氧菌液体培养基重量的1%，筛选出能够降解秸秆的菌液后， 用添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基在50°C培养8天，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的0. 5%。挑取单个菌落用添加有秸秆的厌氧菌液体培养基在50°C培养8天，秸秆占厌氧菌液体培养基重量的1%，筛选出能够降解秸秆的菌液后，用添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基在50°C培养8天，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的0. 5%。挑取单个菌落用添加有秸秆的厌氧菌液体培养基在50°C培养8天，秸秆占厌氧菌液体培养基重量的1%，筛选出能够降解秸秆的菌液后，用添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基在50°C培养8天，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的0. 5%，产生单菌。其中，各种试剂的配方同实施例1。试验例1
图2是菌落的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶图谱，如图所示，将实施例1、实施例2、实施例3中得到的单菌落，采用氯苯法提取细菌总DNA。采用细菌16S rDNA通用引物27F (5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和 1492R (5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)，常规 PCR 方法扩增菌株的16S rDNA基因片段。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检查，EB染色后用凝胶成像系统照相，结果如图2所示，M为marker，1、2、3分别代表实施例1、实施例2、实施例3，所有扩增条带为单一条带，无杂带，分子量为1500bp，可以确定菌落为单菌。试验例2
分别挑取实施例1、实施例2、实施例3中得到的单菌落，接种到添加有秸秆的厌氧菌液体培养基中，秸秆占厌氧菌液体培养基重量的2%，以没有接菌的培养基做对照，在50°C培养。培养7天后，取出秸秆，烘干后分别称重，实施例1、实施例2、实施例3中的秸秆分别减重55. 6%,53. 5%,49. 8%，而对照中的秸秆减重小于1. 0%。因此，筛选出的单菌表现出了很强的降解纤维素的能力。
权利要求
1.一种从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法，其特征在于该方法包括以下步骤A、将纤维素分解复合菌系用添加有滤纸的厌氧菌液体培养基在50°C培养5 8天，滤纸占厌氧菌液体培养基重量的1% 21 ；B、取出菌液用PBS按照1:10000 1000000的体积比进行稀释；C、稀释后的菌液用平板培养，平板为添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的0. 5% 1%，在50°C培养5 8天；D、挑取单个菌落用添加有滤纸的厌氧菌液体培养基在50°C培养5 8天，滤纸占厌氧菌液体培养基重量的1% 21 ；E、取能够降解滤纸的菌液，用添加有纤维二糖的厌氧菌固体培养基在50°C培养5 8 天，纤维二糖占厌氧菌固体培养基重量的0. 5% 1% ；所述的A、D、E步骤在Himgate厌氧管中进行，C步骤在厌氧罐中进行。
2.根据权利要求1的所述的一种从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法，其特征在于还包括重复D、E步骤3 4次。
3.根据权利要求1的所述的一种从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法，其特征在于所述的滤纸被秸秆取代。
全文摘要
本发明涉及一种从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法，将Hungate厌氧管和厌氧罐结合使用，Hungate厌氧管用于肉眼观察纤维素的降解情况，根据功能筛选菌株，厌氧罐中的平板分离出单个菌落。该方法综合了两种方法的优点，适于从纤维素分解复合菌系中分离出能够分解纤维素的功能性厌氧菌株，大大提高了分离效率。
文档编号C12N1/22GK102424812SQ20111045272
公开日2012年4月25日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者刘权, 晏磊, 温雪, 王伟东, 王彦杰, 王艳霞, 高亚梅 申请人:黑龙江八一农垦大学