专利名称：一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于增殖羊口疮病毒的永久细胞系制备方法，其为一种利用犊牛睾丸细胞制备成细胞系，羊口疮病毒利用此细胞系增殖的方法。背景技术：
背景技术：
中，羊传染性脓疱俗称羊口疮(Orf virus)，是绵羊和山羊的一种由口疮病毒所致的人兽共患传染病，世界动物卫生组织(OIE)将该病列为需申报类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。本病几乎分布于世界所有养羊国家，自然情况下主要侵害绵羊和山羊，山羊较为多发。本病常呈群发性流行，3飞月龄羔羊最易感染，成年羊发病较少，病羊和带毒羊是本病的传染源。病毒可随病羊的唾液、脓疱和水疱分泌物以及脱落的痂皮排出， 其传播途径主要是经损伤的皮肤或黏膜而感染。健康羊与病羊直接接触，或接触被病羊污染的饲槽、饲料、饮水、用具、垫草、牧场及厩舍等而感染。近年来随着我国肉用羊、毛用羊及奶山羊养殖业的迅速发展，我国已成为世界第一养羊大国，养羊业已成为我国许多地方的支柱和特色产业之一。另一方面，羊疫病，尤其是羊口疮也成了威胁养羊业的主要疫病之一。养羊户急需优质高效价格低廉的羊口疮疫
田ο但目前市场上却没有羊口疮疫苗可供用户使用，造成这一问题的原因在于疫苗生产企业不愿意生产羊口疮弱毒疫苗，因为该疫苗生产需要的细胞是犊牛原代睾丸细胞，这些细胞制备程序复杂，生产成本过高，耗费时间和财力，且难以实现有效地质量控制，企业难以获得较丰厚的利润。因此，研发适于羊口疮病毒(疫苗株)增殖的细胞系有着重要的应用价值。
发明内容
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种用于增殖羊口疮病毒的永久细胞系制备方法，其利用该细胞系接种羊口疮病毒(疫苗株)，病毒达到稳定增殖目的，为羊口疮病毒弱毒疫苗研制和生产提供了稳定的细胞环境和标准化的培养条件。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种用于增殖羊口疮病毒的永久细胞系制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)犊牛睾丸细胞的获取、分离与培养；(2)犊牛睾丸细胞永久化的建立；(3)羊口疮病毒的稳定增殖。步骤(1)中，犊牛睾丸细胞的获取为犊牛出生后未进食前采集犊牛的睾丸，低温运输，然后分离睾丸细胞。步骤(1)中犊牛睾丸细胞的分离为机械法或胰蛋白酶消化法。步骤(1)中犊牛睾丸细胞的培养液为M199、DMEM高糖或RPMI-1640培养基。步骤(2)中犊牛睾丸细胞永久化的建立是通过导入端粒酶逆转录基因方法实现的。步骤(2)中在犊牛睾丸细胞永久化的建立过程中，利用脂质体2000进行真核表达载体细胞转染，并利用RT-PCR法检测稳定转染的犊牛睾丸细胞中hTERT的表达。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下
本发明分离培养犊牛睾丸细胞，达到稳定的培养条件后，转染人端粒酶逆转录酶基因 (hTERT)使犊牛睾丸细胞永生化，建立犊牛睾丸细胞系。利用此犊牛睾丸细胞系接种羊口疮病毒(疫苗株)，病毒(疫苗株)能够在该系细胞培养环境中稳定增殖，为羊口疮病毒弱毒疫苗研制和生产提供了稳定的细胞环境和标准化的培养系统，可用于羊口疮疫苗的大量生产。四、附图表说明
图1为犊牛睾丸细胞系的培养(正常)结果； 图2为RT-PCR检测转染细胞系中hTERT的表达结果； 图3为犊牛睾丸细胞系接种羊口疮病毒地方分离株后的细胞病变结果； 图4为犊牛睾丸细胞系接种羊口疮病毒疫苗株后的细胞病变结果； 五具体实施例方式
参见图1，图1为本发明犊牛睾丸细胞系的培养(正常)结果；参见图2，利用RT-PCR法扩增.N为阴性对照未转染hTERT的细胞，20和60分别为转染hTERT的犊牛睾丸细胞传20 代、60代hTERT表达情况，P为阳性对照。参见图3，接种羊口疮病毒地方分离株后的细胞病变，细胞出现空泡；参见图4，接种羊口疮病毒疫苗株后的细胞病变，细胞病变比较缓慢；参见表1，表1为羊口疮疫苗毒株接种犊牛睾丸细胞系后96h的滴度测定结果。
表1为羊口疮病毒接种犊牛睾丸细胞系后96h的涌度测定结果病毒毒株病毒涌度(TCID;:)
原代细胞犊牛睾丸細胞系
竿P雍疫苗抹陕西分离袜5.
0
1
C-5.
0
15.
0
1
-D5.
O实施例
以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的使用范围。1、犊牛睾丸细胞的分离与培养
无菌条件下，Hank’ s液(双抗)冲洗睾丸3次，无菌剪刀剪去附睾及白膜，留下睾丸实质。Hank，s液冲洗睾丸实质，直至无血液，然后将其移至无菌三角瓶内。用眼科剪将睾丸剪碎，约广3mm大小，Hrnik，s液冲洗，静置2_3min。弃去上清，反复洗涤3次，加入 7. 6,0. 25%的胰蛋白酶，用量为组织体积的2、倍，4°C静置过夜。隔天后，吸去胰蛋白酶，加入M199培养液，轻轻吹打，将细胞吹散，50mL离心管离心，IOOOrpm,离心lOmin，弃去上清，加入培养液重悬细胞，调整细胞密度，37°C，5% CO2培养。2、牛睾丸上皮细胞永久化的建立
培养的犊牛睾丸细胞铺满培养瓶的60% 70%时，利用脂质体2000进行真核表达载体pCI-neo-hTERT (购于Addgen)细胞转染，进行新霉素(neo)筛选培养，进行细胞扩
4大传代。提取第20、60代转染细胞和未转染的细胞的总RNA，逆转录反应合成cDNA，利用特异性引物扩增hTERT片段和内参GAPDH，检测hTERT的表达。hTERT引物hup 5， GCTGCTCAGGTCTTTCTTTTATG 3' ；hdown 5' CGACGTAGTCCATGTTCACAA 3，，退火温度 55 °C; GAPDH 引物Gup :5’ GAAGGTGAAGGTCGGAGT 3’ ；Gdown 5' GAAGATGGTGATGGGATTTC 3，，退火温度56°C。结果显示，经过筛选转染后的犊牛睾丸细胞传代至60代以后，hTERT呈阳性，细胞生长呈石子路状。
3.羊口疮病毒的稳定增殖
取细胞系冻存细胞复苏后，用含10%犊牛血清的1640培养基悬浮细胞，37°C，5%C02培养48h。取300 L 500 L的羊口疮疫苗株病毒，接种细胞系，继续培养96h，观察病变。 待培养细胞出现空斑时，冰冻整个培养物。然后反复冻融三次后，离心，收集上清，测定病毒滴度。
权利要求
1.一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法，其特征在于包括以下步骤(1) 犊牛睾丸细胞的获取、分离与培养；(2)犊牛睾丸细胞永久化的建立；(3)羊口疮病毒在细胞系的增殖培养。
2.根据权利要求1所述的一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法，其特征在于步骤(1)中，犊牛睾丸细胞的获取为犊牛出生后未进食前采集犊牛的睾丸，低温运输， 然后分离睾丸细胞。
3.根据权利要求1所述的一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法，其特征在于步骤(1)中犊牛睾丸细胞的分离为机械法或胰蛋白酶消化法。
4.根据权利要求1所述的一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法，其特征在于步骤(1)中犊牛睾丸细胞的培养液为M199、DMEM高糖或RPMI-1640培养基。
5.根据权利要求2所述的一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法，其特征在于步骤(2)中犊牛睾丸细胞永久化的建立是通过导入端粒酶逆转录基因方法实现的。
6.根据权利要求2所述的一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法，其特征在于步骤(2)中，在犊牛睾丸细胞永久化的建立过程中，利用脂质体2000进行真核表达载体细胞转染，并利用RT-PCR法检测稳定转染的犊牛睾丸细胞中hTERT的表达。
全文摘要
本发明涉及一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法，其利用此犊牛睾丸细胞系接种羊口疮病毒，达到病毒病毒能够稳定大量增殖的目的，为羊口疮病毒弱毒疫苗研制和生产提供了稳定的细胞环境和标准化的培养系统。本发明包括以下步骤(1)犊牛睾丸细胞的获取、分离与培养；(2)犊牛睾丸细胞永久化的建立；(3)羊口疮病毒在细胞系的增殖培养。
文档编号C12R1/91GK102533660SQ201110452708
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者尚川川, 李 杰, 罗军, 陈德坤 申请人:西北农林科技大学