专利名称：新型真菌菌株白僵菌mtcc 5184及由其制备酶的方法
技术领域：
本发明涉及新型的真菌菌株白僵菌MTCC 5184 (Beauveria sp. MTCC5184)及由其制备酶的方法。具体地，本发明涉及包含来自白僵菌种MTCC5184的蛋白酶、脂肪酶和糖酶的酶组合物。本发明还涉及制备所述酶组合物的方法及其用途。
背景技术：
据估算，目前全球销售的工业用酶价值达十亿美元。工业用酶中，75%是水解酶。蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和木聚糖酶合计占酶销售总量的约85-90%，而在这其中约60%是来源于植物、动物和微生物的蛋白酶。细菌蛋白酶为人所熟知，真菌来源的蛋白酶虽然有益但有限。与其他酶组合的蛋 白酶的其他真菌来源也很有限。Leopold 等发表的题为 “Action of enzymatic systems of Galleriamellonella on the cuticle of the greater wax moth larvae (Galleria mellonella)，，的论 文(Journal of Invertebrate Pathology, Volume 18，Issue 3,November1971, Pages322-330)公开了寄生于昆虫的真菌，球孢白僵菌(Beauveria bassiana)(半知菌纲)向营养培养基中分泌至少三种酶脂肪酶、蛋白酶和几丁质酶的混合物，其能使真菌能穿过受侵染昆虫的表皮。由 B. E. Urtz 和 I C. Rice 发表的题为 “Purification and characterizationof a novel extracellular protease from Beauveria bassiana，，的论文(MycologicalResearch(2000), 104:180-186)公开了从球孢白僵菌分离物中纯化的名为BPP(球孢白僵菌蛋白酶)的胞外蛋白酶。底物特异性表明所述蛋白酶还具有弹性蛋白酶活性。该蛋白酶在25°C稳定，最佳pH为碱性(7. 5-9. 5)。由 Deepti Agrawal 等发表的题为 “Alkaline protease production by a soilisolate of Beauveria feline under SFF condition:parameter optimication andapplication to soy protein hydrolysis，，的论文(Process Biochemistry, Volume40, Issues 3-4, March2005, Pages 1131-1136(doi:10. 1016/j. procbio.2004.03.006)讨论了猫白僵菌(beauveria felina) 土壤分离物用于大豆蛋白水解的碱性蛋白酶活性，并在固体底物发酵(SSF)的条件下将其和已知的碱性蛋白酶生产菌，米曲霉NCIM649 (Aspergillus oryzae NCIM 649)进行了比较,还优化了在SSF条件下影响碱性蛋白酶生产的参数。但是，没有任何现有技术涉及由白僵菌种生产单独或与碱性蛋白酶组合的淀粉酶、角蛋白酶和木聚糖酶。来源于白僵菌种的酶组合物在粗品的、精制的，纯化的或任何此类形式的生物质中的进一步应用迄今还未可知。发明目的因此，本发明的主要目的是提供白僵菌物种，其能够提供可应用于多个领域的酶组合物。本发明的另一个目的是提供包含来自真菌来源的至少一种或多种以下酶的组合物蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、木聚糖酶、几丁质酶和角蛋白酶，其中所述真菌来源是此前未知的白僵菌菌株。本发明的再一个目的是提供使用本发明人分离的属于白僵菌属的真菌培养物制备酶组合物的方法，所述酶组合物包含至少一种或多种以下酶蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、木聚糖酶、几丁质酶和角蛋白酶。本发明的再一个目的是提供在宽pH范围和短发酵周期中具有活性且稳定的碱性蛋白酶的制备方法。本发明的再一个目的是提供用于生产单独或组合的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、木聚糖酶、几丁质酶和角蛋白酶的经济方法。本发明的更进一步的目的是提供所述酶在动物组织培养、分析工具、医药、分子生物学、皮革、去污剂、食品、纺织等行业的应用/用途。发明概述本发明公开了白僵菌属的新种，即白僵菌MTCC-5184。本发明还公开了包含选自但不限于由所述真菌来源制备的蛋白酶、糖酶和脂肪酶的至少一种酶的组合物。本发明还描述了所述酶组合物的制备方法及其应用/用途。更具体地，本发明涉及在宽pH范围内具有活性且稳定，并且在多种去污剂、有机溶剂、变性剂等存在下稳定的碱性蛋白酶、脂肪酶和糖酶，其在动物组织培养、皮革、食品、去污剂和其他行业有潜在应用。因此，本发明提供了保藏号为MTCC 5184的白僵菌种真菌菌株，其中所述菌株保藏在布达佩斯条约承认的国际保藏单位MTCC。本发明进一步提供了由保藏号为MTCC 5184的白僵菌种制备酶的方法，所述酶包括选自但不限于蛋白酶、糖酶和脂肪酶的至少一种酶，所述方法包括[a]在包含O. 15-80%碳源、O. 15-80%氮源和诱导物的培养基中，pH在5. 0-9. O范围，温度在15-32°C之间的有氧条件下，将白僵菌MTCC 5184培养2-7天；[b]收获步骤[a]获得的培养物；并且[c]通过常规方法分离/提取液相中的酶。
图I :显示了基于内转录间隔区(ITS)序列的多序列比对的同源性的系统树图。新分离物的ITS序列显示与猫白僵菌序列具有最高同源性。图2a :猫白僵菌(NCM 1314)的形态学。图2b :新分离物的形态学。形态学上有显著不同，特别是在新分离物中存在直立柄(束丝，synnemata)。图3 :显示白僵菌种MTCC 5184产生脂肪酶的平板试验。在包含三丁酸甘油酯的培养基上生长的白僵菌菌落周围的透明区表明真菌分泌了脂肪酶。图4 :显示白僵菌种MTCC 5184产生几丁质酶的平板试验。在酸胀几丁质板上，在放置有培养滤液的点周围的透明圈表明真菌分泌了几丁质酶。
图5a :描述了在10%麦芽糊精存在下喷雾干燥的蛋白酶的稳定性，和图5b :描述了在15%麦芽糊精存在下喷雾干燥的蛋白酶的稳定性。图6 :纯化蛋白酶的阳离子聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，其显示了(6a)银染后的单个蛋白条带和^b)显示活性染色后清除了明胶的相应条带。图7 :纯化蛋白酶的MALDI-T0F，其显示了分子量为28. 2kDa的主峰。图8:来自白僵菌的新菌株的纯化蛋白酶N-末端序列与其他生物的蛋白序列的多序列比对，其显示与来自其他生物的少数蛋白酶的部分序列相似性。图9 :苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制蛋白酶的动力学抑制与温育时间呈线性关系，并随PMSF浓度而增加。
图10 :在水互溶性溶剂存在下，蛋白酶于37°C的稳定性。蛋白酶在甲醇存在下最稳定(保留>80%的初始活性)，其后依次是乙醇、异丙醇和丙酮，而对照保留了约30-35%的初始活性。图11 :在水不相溶性溶剂中，蛋白酶于37°C的稳定性。蛋白酶在所有水不相溶性溶剂中都是稳定的，24小时后仍保留50-80%的活性。图12 :尿素浓度对蛋白酶稳定性的影响。蛋白酶在尿素存在下是稳定的，并显示随着尿素浓度的增加而稳定性略有增加。图13 :在3M NaCl和6M尿素存在下，蛋白酶的稳定性。温育2小时后，在6M尿素存在下蛋白酶保留超过85%活性，在3M NaCl存在下蛋白酶保留75%活性，对照组保留67%的初始活性。图14 =NaCl浓度对蛋白酶稳定性的影响。在3M NaCl存在下，蛋白酶显示100%的稳定性。图15 =UV-Vis光谱显示在溶液中存在银纳米颗粒。280nm处和400nm附近的峰分别是由于蛋白质和银纳米颗粒的存在而产生的。图16 :动物细胞在蛋白酶处理前后的显微照片。细胞因蛋白酶的作用而分离。图17 :显示血迹去除的图。粗蛋白酶能够去除血迹和血块，而商业去污剂仅除去血迹。
具体实施例方式根据本发明，本文公开了包含选自但不限于来自真菌来源的蛋白酶、糖酶和脂肪酶的至少一种酶的组合物，其中所述真菌来源是此前未知的白僵菌菌株。所述白僵菌种的真菌菌株是从兔粪中分离的，保藏号为MTCC_5184(印度昌迪加尔微生物典型培养物保藏中心)。白僵菌的来源是土壤、昆虫、动物粪便、树枝和海洋生物等。所述培养物从兔粪中分离。将粪便颗粒放置在陪替氏平皿中的干净且湿润的滤纸上。将培养皿保持在潮湿的房间内，并在室温下培养2-3周。起初有白色的真菌生长，进一步培养显示小突起，并发育成直立的柄。小心地使用无菌尖头针从这些柄取出孢子，并铺在麦芽提取物、葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨(MGYP)琼脂平板上。通过在MGYP平板上的多次再培养纯化分离的菌落，并将单菌落转移到MGYP斜面上。用18S rDNA和ITS序列以及形态学特征表征由此获得的分离物，并与猫白僵菌区分。表I和表2的结果显示了 18S rDNA和ITS序列的前10个BLAST命中结果。18S rDNA和ITS序列显示了与不同的猫白僵菌菌株99%的同源性。图I显示ITS基因和其他生物的序列同源性。根据18S rDNA和ITS序列同源性，本发明的分离物显示了与猫白僵菌98-100%的同源性。然而，如图2所示，和猫白僵菌(NCIM 1314)相比，其在形态上有显著差异。白僵菌种的新菌株MTCC 5184的18S rDNA和ITS基因序列已经保存在NCBI基因库中，登录号分别为FJ895305和FJ895306。在本发明的一个实施方式中，所述组合物包含选自但不限于蛋白酶、角蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、几丁质酶和脂肪酶的单个酶或其任意组合。在本发明的另一个实施方式中，所述酶组合物对真正的胶原蛋白是惰性的。在本发明的再一个实施方式中，本发明酶组合物的形式选自但不限于粗品形式、纯化形式、精制形式、细胞结合形式或被固定形式的生物质。在本发明的再一个实施方式中，所述酶组合物对通常应用于酶组合物的诸如干燥、过滤、浓缩和精制等的物理加工是稳定的。 在本发明的再一个实施方式中，本发明提供了使用白僵菌种制备酶组合物的方法，所述方法包括a.在pH 5.0-9.0范围，温度15-321之间的有氧条件下，将白僵菌阶(15184真菌菌株在包含碳源、氮源和诱导物的培养基中培养2-7天；b.收获培养物；和c.按常规方法分离/提取液相中的酶。在本发明的再一个实施方式中，生物体在180_220rpm振荡下浸没培养生长。在另一个实施方式中，所述生物体在稳态条件下固态发酵生长。在本发明的再一个实施方式中，所述碳源包括但不限于单独的糖、糖醇、多糖、油、脂肪、脂质和农产品/废物等，或其组合。所述糖是葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖和乳糖等；糖醇是甘油、甘露醇和山梨醇等；多糖是淀粉和木聚糖等；油/脂肪是橄榄油、葵花油、大豆油、芝麻油、芥子油、蓖麻油、椰子油、花生油和三丁酸甘油酯等；农产品/废物是大豆粉、马铃薯渣、玉米粉、豆柏、花生柏、芥菜籽饼、棉籽饼、麦麸、玉米芯、玉米柏和米糠等；包含几丁质的废物如蟹壳等。在本发明的再一个实施方式中，所述氮源是任选单独的有机或无机氮源或其组合。所述无机氮源选自但不限于磷酸氢二胺、硝酸钠、硝酸钾和尿素。在本发明的再一个实施方式中，所述有机氮源选自但不限于单独的蛋白胨、胰蛋白胨、豆糖(soyatose)、豆蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酪蛋白、肉膏、牛肉膏、酵母提取物、玉米浆和富氮豆科底物，例如大豆粉、豆柏、鹰嘴豆粉(gram flour)、绿豆粉、芥菜籽饼、棉籽饼和花生柏等，来自于乳制品、家禽、肉类和食品加工的废物，富含角蛋白的废物，例如毛发、羽毛，来自于渔业的废物和其他废物，或其组合。在本发明的再一个实施方式中，分离酶的常规方法是过滤、离心或用水或稀表面活性剂提取。在本发明的再一个实施方式中，所述诱导物选自但不限于单独的蛋白胨、胰蛋白胨、豆糖、豆蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酪蛋白、肉膏、牛肉膏、酵母提取物、玉米浆和富氮豆科底物，例如大豆粉、豆柏、鹰嘴豆粉、绿豆粉、芥菜籽饼、棉籽饼和花生柏等；来自乳制品(如乳清)、家禽、食品加工、肉类和鱼类的废物，如鱼粉和鸡毛、羽毛粉等；农业废物，如油籽饼；和碳水化合物废物，如废谷物/谷粒、麦麸、玉米芯、玉米柏、米糠、油、脂肪；制革废物如刮肉(fleshings)、切屑(trimmings)和铬革屑；富含角质的底物,例如指(趾)甲、蹄、头发，或其组合。在本发明进一步的实施方式中，所述诱导物可以是碳源。在另一个实施方式中，所述诱导物可以是氮源，其用于生产包含选自脂肪酶、蛋白酶和糖酶的至少一种酶的酶组合物的方法。在本发明的另一个实施方式中，所述酶的浓缩通过膜过滤，或通过加入盐(如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)的盐析、加入有机溶剂(如乙醇、丙酮)，或通过冷冻干燥或喷雾干燥完成。在本发明的再一个实施方式中，本发明的蛋白酶在pH 3-11的范围，优选在pH 7是稳定的，对去污剂、变性剂、水互溶性有机溶剂和水不互溶性有机溶剂是稳定的，并且在温度达50°C时是稳定的。所述蛋白酶在30-70°C的温度范围内，优选50°C，在pH 5. 5_12的范围内，以及在螯合剂、金属离子存在下有活性。
在本发明的再一个实施方式中，粗蛋白酶和纯化的蛋白酶对白蛋白、血红蛋白、角蛋白、弹性蛋白-苔黑素(elastin-orcin)、偶氮酪蛋白、偶氮胶原(azocoll)和明胶都有活性。在本发明的再一个实施方式中，所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶且被苯甲基磺酰氟(PMSF)所抑制。在本发明的另一个实施方式中，所述淀粉酶在pH 4-8的范围内，优选pH 6且在20-70 0C的温度范围内，优选45 °C时有活性。在本发明的再一个实施方式中，木聚糖酶在pH 4-9范围内，优选pH 6且在30-70°C的温度范围内，优选50°C时有活性。在本发明的再一个实施方式中，脂肪酶在pH 4-9范围内，优选pH 7且在20_60°C的温度范围内，优选500C时有活性。在本发明的另一个实施方式中，所述酶组合物对真正的胶原蛋白是惰性的。所述蛋白酶活性以酪氨酸当量表示。反应混合物包含经适当稀释的酶溶液试样和含IOmg Hammerstein酪蛋白的O. IM碳酸钠缓冲液(pH 9. O),总体积为2ml。在50°C温育10分钟后，加入3ml 5%三氯乙酸(用浓盐酸酸化)终止反应。室温静置30分钟后，通过Whatman I号滤纸过滤形成的沉淀。测量三氯乙酸可溶部分在280nm的吸光度。根据预先校准的280nm吸光度对酪氨酸浓度的标准曲线计算所产生的酪氨酸的微克数，单位表示为在实验条件下每分钟释放的酪氨酸微摩尔数。用含1%可溶性木聚糖的50mM磷酸钾缓冲液(pH 6)测定木聚糖酶活性。Iml总反应混合物包含O. 5ml适当稀释的酶和O. 5ml底物，并在50°C温育30分钟。利用二硝基水杨酸法(P. Bernfeld 1955, Amylase: a& β , Methods in Enzymology, Volume 1，149)测定释放的还原糖。木聚糖酶活性表示为在实验条件下每分钟产生的还原糖(木糖等价物)的微摩尔数。用含1%可溶性淀粉的50mM磷酸钾缓冲液(pH 6)测定淀粉酶的活性。Iml总反应混合物包含0. 5ml适当稀释的酶和0. 5ml底物，并在45°C温育30分钟。利用二硝基水杨酸法(P. Bernfeld 1955, Amylase: a & β , Methods in Enzymology, Volume 1，149)测定释放的还原糖。淀粉酶活性表示为在实验条件下每分钟产生的还原糖(葡萄糖等价物)微摩尔数。用两种不同方法测定脂肪酶活性。a.以对硝基苯酹棕榈酸盐(pNPP)为底物的分光光度测定法在恒定搅拌下,将Iml溶液A (含30mg pNPP的IOml 2-丙醇)逐滴加入到9ml溶液B (含O. Ig阿拉伯胶和O. 4g Triton-X-100的90ml蒸馏水)，制备新鲜的底物溶液。乳液保持稳定2小时。测定混合物包含O. 9ml底物、O. Iml 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7)和O. Iml适当稀释的酶。将所述测定混合物在28°C温育20分钟，然后通过加入2ml 2%Na2C03终止反应。在410nm测定释放的对硝基苯酚量。脂肪酶的活性表示为在实验条件下每分钟释放的对硝基苯酚的微摩尔数。
b.脂肪酶的滴定测定法通过在研磨混合器中将20ml橄榄油、165ml 10%阿拉伯胶和15g冰混合10分钟，并在玻璃棉上过滤而制备底物，然后储存在4°C。针对脂肪酶测定，反应混合物包含2ml磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7. O)、5ml底物和Iml粗培养液并在50rpm振荡下在50°C温育I小时。通过加入4ml丙酮乙醇(1:1)终止反应。在空白组中，在用丙酮乙醇终止反应后加入酶。用IOmM NaOH滴定释放的游离脂肪酸。脂肪酶的活性表示为在实验条件下每分钟释放的游离脂肪酸的微摩尔数。本发明的酶组合物可用于需要基于酶的组合物的所有领域，包括食品、医药、皮革和纺织行业。蛋白酶应用于农业、皮革、纺织、丝脱胶、乳制品、食品、饲料、去污剂、医药行业、肥料、由植物、动物制备培养基成分和蛋白水解物、肽合成、分子生物学、化妆品和废物处理等行业。脂肪酶应用于农业、皮革、纺织、乳制品、食品、饲料、去污剂、医药行业、肥料、化妆品、废物处理和聚合物合成等的行业。淀粉酶应用于农业、皮革、纺织、食品、饲料、去污齐IJ、医药行业、培养基成分的制备、废物处理等行业。木聚糖酶应用于农业、造纸和纸浆、皮革、纺织、食品、饲料、医药、废物处理、单细胞蛋白、燃料、溶剂、寡糖合成、纤维(如大麻、黄麻、苎麻、亚麻等)脱胶、剥皮等行业。传统上，角蛋白酶用于生产羽粉、肥料和胶类等。这些应用范围正在慢慢扩大，且如今其正在越来越多地用在其他领域，如去污剂的配制、化妆品、皮革、药物和动物饲料。最近，它们应用在治疗疯牛病(降解朊蛋白)、生物可降解塑料和羽粉的生产。目前正在探索具有温和弹性蛋白水解活性但缺乏溶胶原活性的角质蛋白酶在皮革生产的脱毛过程中的应用。包含选自但不限于来自白僵菌种的蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、几丁质酶、角蛋白酶和脂肪酶的至少一种酶的酶组合物用于皮革生产中如脱毛的预鞣加工、动物细胞培养、从摄影胶片回收银、纳米颗粒合成、有机溶剂中的肽合成和去污剂组合物。此类去污剂能去污。常规的脱毛加工方法产生污水排放，所排放的污水具有高有机氮、生物需氧量(BOD)、化学需氧量(COD)和总溶解固体量(TDS)和高pH，其污染土壤和地表水并因此对生态系统造成不可逆转的破坏。使用碱性蛋白酶脱毛使废水量和污染负荷都显著减少。此外，淀粉酶，特别是淀粉酶与蛋白酶的组合可用在准备工段的软化操作(美国专利第4，273，876 号)。本发明的酶组合物可用于皮革工业的各种预鞣加工。特别地，所述组合物单独用于预鞣加工。更特别地，如本文的例示，本发明的酶组合物为皮革行业提供了无化学添加剂的预鞣加工的选择。这种环保型方法涉及在脱毛过程中用蛋白水解酶替代石灰和硫化物，从而导致废水中的BOD、COD和TDS降低。这些酶能够在pH 6-8范围内用于皮革加工。与用固体硫化物和氢氧化钙而完全破坏了毛发本身的传统方法不同，酶解方法导致去除表皮层进而使毛发松动或从根去除。实施例以下利用实施例对本发明进行描述，但这些实施例仅用作说明而不应以任何方式解释为对本发明范围的限制。实施例IA本实施例描述了通过十六烷基三甲基溴 化铵(CTAB)法提取白僵菌MTCC 5184的基因组DNA。为提取DNA，将该真菌培养在包含麦芽提取物、葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨的MGYP培养基的液体培养瓶中，所述培养基的组成(g/L)为麦芽提取物_3、酵母提取物-3、蛋白胨-5以及葡萄糖-10。通过从7日龄的MGYP斜面接种孢子开始培养。将培养瓶在旋转振荡仪上(200rpm)于28V温育48小时。将培养物以8000rpm离心15分钟，反复洗涤以去除培养基组分。将3-5g湿菌丝在液氮中研磨，然后加入8-10ml CTAB提取缓冲液(pH8，包含O. 2%β-巯基乙醇)，随后加入20μ I蛋白酶K(20mg/ml)并于65°C温育I小时。接着，加入20μ1 RNase A(10mg/ml)并再于65°C温育15分钟。向离心(8000rpm，10分钟)后收集的上清中加入IOml的氯仿异戊醇(24:1)。振荡混合物5分钟并在10，OOOrpm,4°C离心15分钟。向上清中加入2体积的CTAB沉淀缓冲液并于室温放置I小时。将离心后收集的沉淀溶解在5ml I. 2M NaCl中并加入5ml的氯仿异戊醇(24:1)。向水相中加入2体积的无水乙醇以沉淀DNA。取出DNA用70%乙醇洗涤，溶解在5ml O. IMTris-乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液(pH 8.0)中，并储存。用分光光度计测量样本在260nm处的吸光度而对DNA进行定量，并用O. 8%琼脂糖凝胶电泳检测纯度。实施例IB该实施例描述了通过聚合酶链反应(PCR)扩增基因组DNA的18S rDNA和内转录间隔区(ITS)基因。鉴定真菌种类所用的引物是通用的真菌18S rDNA引物NSl-F(GTA GTCATA TGC TTG TCT C)、NS8_R(TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA)、ITSl-F(TCC GTA GGT GAACCT GCG G)和 ITS4-R(TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)。设置聚合酶链式反应(25 μ I)以利用基因组DNA扩增18S rDNA和ITS基因。反应混合物通常包含基因组DNA-0. 70μ1、10ΧPCR 缓冲液-2. 50 μ 1、0· 2mM dNTPs-2. 5 μ l、10_20pmol 正向和反向引物-各 I. 25 μ I、蒸馏水-16. 60 μ I和I单位的Taq DNA聚合酶-O. 20 μ I。18S rDNA和ITS基因扩增的PCR条件是95°C初始变性3分钟；随后是94°C I分钟，570C 30秒、72°C 2分钟的35个循环；最后72°C延伸10分钟。取5 μ I上述PCR扩增产物在I. 0%琼脂糖凝胶上检测扩增情况。实施例IC该实施例描述了 PCR扩增产物的纯化。向20μ I PCR扩增产物中加入12μ I20%PEG-NaCl (聚乙二醇-NaCl)溶液，并在37°C温育30分钟。然后在12，OOOrpm离心20分钟。弃上清,沉淀用70%乙醇洗两次，并通过12，OOOrpm离心20分钟分离。干燥沉淀,溶解在10 μ I双蒸水中并储存于_20°C。实施例ID该实施例描述了纯化的PCR产物的测序。按照厂商的方案，采用ABIPRISMBigDye Terminator 循环测序即用反应试剂盒(Perkin Elmer Applied BiosystemsDivision, Foster City, CA)并使用Taq DNA聚合酶实施测序反应。该试剂盒包含带有被称为BigDye Terminators的不同突光标记的四种ddNTPs。在20 μ I测序反应里使用2 μ IPCR产物和3pmol测序引物。用于测序的测序引物为NS I (GTA GTC ATA TGC TTG TCT C)、NS 2 (GGC TGC TGG CAC CAG ACT TGC)、NS 3 (GCA AGT CTG GTG CCA GCA GCC)、NS 4 (CTTCCG TCAATT CCT TTAAG)、NS 5(AAC TTAAAG GAA TTG ACG GAA G)、NS 6(GCA TCA CAG ACCTGT TAT TGC CTC)、NS 7 (GAG GCA ATA ACA GGT CTG TGA TGC)和 NS 8 (TCC GCA GGT TCACCT ACG GA)，ITS I (TCC GTA GGT GAA CCT GCG G)和 ITS 4 (TCC TCC GCT TAT TGA TATGC) (White et al 1990)。测序反应混合物在Perkin Elmer热循环仪9700中进行25个循环。每个循环由95°C 10分钟、50°C 5分钟和60°C 4分钟构成。DNA测序在ABI1500自动测序仪上进行。实施例IE
该实施例描述了在上述实施例中得到的18S rDNA和ITS序列的基础上，对白僵菌新菌株MTCC 5184的鉴定及种系发生关系。因为获得的序列是小片段，通过重叠序列进行准确比对。通过NCBI数据库中的现有序列获得白僵菌新菌株的同源性百分比和种系发生关系。使用BLAST程序(www. ncbi. ncm. gov/blast)用GenBank数据库分析核苷酸序列。表I和表2的结果显示，在NCBI数据库中18S rDNA和ITS序列各自的前10个命中结果。18S rDNA和ITS序列显示与猫白僵菌的不同菌株有99%的同源性。图I显示ITS和其他生物的序列同源性。根据18S rDNA和ITS序列同源性，本发明的菌株显示了与猫白僵菌98-100%的同源性。然而如图2所示，本发明的菌株在形态学方面与猫白僵菌相比有显著的差异。白僵菌新菌株MTCC 5184的18S rDNA和ITS序列储存在NCBI基因库中，登录号分别为 FJ895305 和 FJ895306。表I :18S rDNA的前10个BLAST命中结果。
_显示显箸^!^(signilcant alignment)的序列__得分(bits) E 值 I R]源性=
AY261369.1_猫 RfS 菌株 CBS 250.34 18S__3157 OO I 99%
AY261367.1 猫 HIB 菌株 HL-51-ALSP16-1003 18S__3153 00|99%
AY261368.1猫白僵菌株 CBS Π3.71 18S3145 0.0 | 99%
AY489693.1/ acmvto/,ia .1 株 GJS72-26 丨 8S 2996 0.0 | 98%
AB023945.丨淡紫拟作拓消·|'(Ρ供y伽flyc.es'///gc.論/a·) 18S AIW 2968 0.0 97%AB237663.丨朱il:从赤立β (ΛΚ·"./α c/"mf/}ar/"a) WS 坫M 2964 0.0 | 98 AB067701.1 冬虫辽草顏xffwm/x) WS2964 0.0 97%
AY357275.1_Neciria curia 菌株 UMB 39.01 18S__2963 OO I 97%
AB003949.I_朱红从赤壳菌 18S 基W__2959 OJ I 97%
AY249900.0 糠生赤5^1}(.滋wec/r/fl/M7).T /e.v) 2946 0.0 I 97%_菌株 CBS 246.78 I8S___|_表2 :ITS的前10个BLAST命中结果。
权利要求
1.保藏号为MTCC5184的白僵菌(Beauveria)真菌菌株,其中所述菌株保藏在布达佩斯条约承认的国际保藏单位MTCC。
2.由保藏号为MTCC5184的白僵菌制备酶的方法，所述酶包含选自但不限于蛋白酶、糖酶和脂肪酶的至少一种酶，所述方法包括 a)在包含O.15-80%碳源、O. 15-80%氮源和诱导物的培养基中，pH在5. 0-9. O范围内，且温度在15_32°C之间的有氧条件下，将白僵菌MTCC 5184培养2_7天，其中任选地所述碳源和氮源为诱导物； b)收获步骤(a)获得的培养物；并且 c)通过常规方法分离/提取液相中的酶。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述白僵菌的培养在浸没条件或固态发酵下完成。
4.如权利要求2所述的方法，其中，所述碳源选自以下组成的组糖，优选为葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和阿拉伯糖；糖醇，选自甘油、甘露糖醇和山梨糖醇组成的组；多糖，选自淀粉、木聚糖和半纤维素组成的组；油和脂肪，选自橄榄油、葵花油、大豆油、芝麻油、芥子油、蓖麻油、椰子油、花生油、三丁酸甘油酯组成的组；和农业废物，选自花生柏、麦麸、米糠、马铃薯渣、玉米粉、豆柏、芥菜籽饼、棉籽饼、玉米芯、玉米柏、乳制品、家禽、肉类和食品加工；富含角蛋白的废物，如毛发、羽毛；渔业废物、酸胀几丁质和含几丁质的废物。
5.如权利要求2所述的方法，其中，所述氮源选自以下组成的组蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酪蛋白、肉膏、酵母提取物、玉米浆、豆柏、芥菜籽饼、棉籽柏、豆糖、豆蛋白胨、鹰嘴豆粉、绿豆粉、硫酸铵、硝酸铵、磷酸氢二铵、尿素、硝酸钠、羽毛、鱼粉和毛发。如权利要求2的方法，其中，通过冷冻干燥、喷雾干燥、盐析法或超滤浓缩所述酶。
6.如权利要求2所述的方法，其中，所述酶组合物被部分纯化并用无机盐浓缩，所述无机盐选自硫酸铵、氯化钠和氯化镁组成的组。
7.权利要求2的方法制备的酶，其中，所述酶是粗品形式、被固定的形式、细胞结合形式、精制形式、纯化形式，并接受选自喷雾干燥、冷冻干燥、过滤、浓缩、精制和纯化的加工。
8.权利要求2的方法制备的酶，其中，所述酶组合物对真正的胶原蛋白是惰性的。
9.权利要求2的方法制备的蛋白酶，其中，所述蛋白酶在pH5. 5-12的范围内和30-70°C的温度范围内具有活性，在pH 3-11范围内和达50°C的温度下是稳定的。
10.如权利要求9所述的蛋白酶，其中，所述蛋白酶在水互溶性和水不互溶性溶剂中均是稳定的。
11.如权利要求9所述的蛋白酶，其中，所述蛋白酶被苯甲基磺酰氟抑制。
12.如权利要求9所述的蛋白酶，其中，所述蛋白酶在变性剂存在下是稳定的，并且在选自Hg、Cu和Cd的有毒金属存在下具有活性。
13.权利要求2的方法制备的糖酶，其中，所述糖酶pH4-9的范围内和20-70°C的温度范围内具有活性，并且PH 3-9的范围内是稳定的。
14.权利要求2的方法制备的脂肪酶，其中，所述脂肪酶在pH4-9的范围内和20-60°C的温度范围内具有活性。
15.权利要求2的方法制备的酶在皮革生产中的预鞣加工、动物细胞培养、从摄影胶片回收银、纳米颗粒合成、有机溶剂中的肽合成及在去污剂配制中的应用。
全文摘要
本发明公开了保藏号为MTCC 5184的白僵菌(Beauveria)种的真菌菌株。本发明还公开了由所公开的白僵菌制备酶混合物的方法，以及所述酶混合物在多个领域的用途，其中所述酶混合物包含选自但不限于蛋白酶、糖酶和脂肪酶的至少一种酶。
文档编号C12R1/645GK102858967SQ201180017172
公开日2013年1月2日 申请日期2011年2月4日 优先权日2010年2月5日
发明者西塔·拉什曼·里亚利, 雪夫·尚卡尔, 斯内哈尔·维贾伊·莫雷, 哈里什·班西拉尔·汉德尔瓦尔, 钱德拉·巴布·加南·纳拉辛汉, 萨拉瓦南·帕拉尼韦尔, 帕德马纳班·巴拉拉姆 申请人:科学与工业研究委员会