植物体地上部位表达的植物转化启动子及其用途的制作方法

专利名称：植物体地上部位表达的植物转化启动子及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于植物体地上部位表达的启动子及其制造方法。具体地说，本发明涉及植物体地上部位表达的单子叶植物转化启动子及其制造方法。
背景技术：
启动子是连接在构造基因上部的基因体部位，具有与其连接的构造基因转录到mRNA的调整作用。启动子是由几个一般转录因子结合才能活化，通常具有调整基因表达的TATA框、CAT框等的碱基序列。生体基本代谢所需的蛋白质在细胞内要保持一定浓度以上，连接在这些基因的启动子只靠一般转录因子的作用一直保持活性。相对地对平时没有作用，只有在特定的情况 下被要求功能的蛋白质来讲，诱导其构造基因表达的诱导性启动子连接在其构造基因上。即生物体的发展过程中、或是受周围环境因素的外部刺激而活化的特异性转录因子与诱导性启动子结合，启动子才能活化。在具有新特性的耕作植物的生产方面，向植物体引入的外部基因的表达受转录性、后转录性、转译及后转译因素等的巨大影响。所述因素中，尤其属于转录因素的启动子直接影响转基因的转录，结果改变表达的水准。另外，所述启动子能改变转基因的表达步骤、组织或细胞特异性的最重要因素。到现在为止，为了表达转基因多种植物体中分离出许多启动子，但实际上其中只有少数利用在植物转化。花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子和其衍生物是目前最广利用的启动子，在植物体的全体组织上诱导广泛的基因表达。花椰菜花叶病毒(CaMV)3尤其在维管束组织及根和叶的大部分细胞上显示大的活性。但是CaMV 35S启动子在水稻等单子叶植物显示的活性比双子叶植物低，甚至在花粉等特定细包上不显示任何活性。CaMV 35S以外来自于双子叶植物的其他多数启动子利用在单子叶植物转化上，但是比来自单子叶植物的启动子显示较低的活性。对此，水稻的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基(RbcS)启动子，水稻的肌动蛋白I (Actl)启动子及玉米的Ubil启动子一直以为对单子叶植物转化有用的启动子而被研究。尤其，因为Actl及Ubil启动子比CaMV 35S启动子在单子叶植物显示较高的活性，一般利用在单子叶植物的转化上。可是，虽然Ubil启动子在许多细胞类型上显示活生，但是不包含植物体的全体组织。另外，在幼根显示强大的活力，但随着根的成熟其活性明显地减少。Actl启动子主要在生长组织和生殖组织显示活性，在单子叶植物上要普遍存在的基因表达不太有效果。因此对单子叶植物转化而言，不断地提出需要开发显示强而稳定、全体活性的启动子。对此本发明人等要开发对单子叶植物转化有效的启动子不断努力的结果，发现来自水稻的特定启动子适合单子叶植物的植物体地上部位表达，完成了本发明。

发明内容
发明需要解决的技术课题本发明的目的是提供对植物转化有效的启动子。本发明的另一目的是提供包含所述启动子的重组植物表达载体。本发明的另一目的是提供利用所述启动子和重组植物表达载体生产目的蛋白质的方法和由其生产的蛋白质。本发明的另一目的是提供利用所述重组植物表达载体的转化植物的制造方法及由所述方法转化的植物。本发明的另一目的是提供所述转化植物的种子。解决课题的技术方案 为了完成本发明的目的，本发明提供包含选自由序列号(SEQ. ID. No. ) I及2形成的群 中至少一个序列的启动子。本发明是涉及来自水稻的特定启动子，具体地说，所述启动子可以是植物体地上部位表达的单子叶植物转化启动子。另外，适合植物体地上部位表达。所述植物体地上部位可以是叶子。所述序列号I的启动子命名为“核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基3 (RbcS3),所述序列号2的启动子命名为“磷酸核酮糖激酶(PRK)”。新分离的2种启动子比叶子特异性表达启动子的RbcSl启动子(GenBankaccession no. D00643)更强的在叶子上表达。并且，所述RbcSl启动子和PRK启动子，比现有的玉米泛素启动子的表达量更强，与OsCcl启动子(GenBank accession no. AF399666)的叶子上的表达量类似。在本发明的一实施例，上述序列的突变体可包含在本发明的范围内。所述突变体是碱基序列有变化，但具有与序列号I或2的碱基序列类似功能及免疫学特性的碱基序列。具体地说，所述启动子可包含与序列号I至2的碱基序列具有70%以上，较好具有80%以上，更好具有90%以上，最好具有95%以上序列相同度的碱基序列。对多核苷酸的“序列相同度％”是与两个优化排列的序列比较比对区而确认，比对区内多核苷酸序列的一部分相对于对两个序列优化排列的参考序列(不包含添加或删除)可包含添加或删除(即，间隔)。所述％是确认相同的核酸碱基在两个序列上都存在的位点数而计算匹配位点数，该匹配位点数除比对区内的总位点数，其结果乘100而算出序列相同度％，做比对序列的优化排列是由电脑执行公知的演算方式(例如，GAP，BESTFIT, FASTA及 TFAST in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(GCG) , 575 Science Dr. , Madison, WI, or BlastN and BlastX available from theNational Center for Biotechnology Information),或是以检查完成。多核苷酸序列的实际同一'I"生是指多核苷酸包含具有70%以上的序列同一'I"生，较好具有80%以上，更好具有90%以上，最好具有95%以上的序列同一性的序列。另一方面，两分子在严格的条件下特异地互相杂交时，核苷酸序列实际上是相同的。严格的条件是序列依赖性，在其他情况下是不会相同。严格的条件是在指定的离子强度及PH值下选取比对特定序列的热熔点(Tm)低10°C。Tm是标的序列的50%在完全匹配的探针上杂交的温度(在指定的离子强度及PH值下)。探计长度及碱基组成两者的函数，杂交体的Tm可利用文献(Sambrook, T. et al. , (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (secondedition), Volume 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring)内的资讯来计算。典型地，对南方转溃程序的严格条件包含以0.2XSSC在65°C洗涤。对于利用较佳的寡核苷酸探针时，洗涤条件是典型地在6XSSC约42 °C。本发明的一实施例中，所述启动子可包含与序列号I或2的序列互补的序列。术语“互补”，本技术领域中广泛使用的术语，是指核苷酸或核酸，例如DNA分子的双股之间的杂交或碱基配对。本发明的一实施例中，所述单子叶植物可以是水稻、大麦、小麦、玉米、小米或高粱，但不限于此。在本发明的另一方面，本发明提供包含根据本发明的启动子的重组植物表达载体。重组植物表达载体可列举图2记载的为一例，并不限于此。
具体地说，所述载体是把变形的绿萤光蛋白基因(GFP)，蛋白酶抑制剂II终结基因(TPinII)，0sCcl启动子(Pcytc)，除草剂抗性基因BAR (草丁膦乙转移基因)及胭脂碱合成酶终结子(TNOS)可操作地连接在本发明的启动子上。另外，右边界序列末端装上MAR序列使根据染色体内引入部位的表达量变化最少化而使得只能测定本发明启动子的固有活性。术语“重组”是指细胞复制异源核酸或表达所述核酸，或表达由肽、异源肽或异源核酸编码的蛋白质的细胞。重组细胞可以以顺义或反义的形态表达所述细胞的天然形态中还没有发现的基因或基因片段。另外重组细胞可以表达天然形态的细胞中发现的基因，但是所述基因是经变形并以人工手段再引入细胞的。术语“载体”在表示传递到细胞内的一个或多个DNA片段和核酸分子。所述载体可以复制DNA并能在宿住细胞中独立复制。术语“传达体”和“载体”通常互换使用。术语“表达载体”是指包含标的编码序列，和在特定宿主生物中表达可操作地连接的编码序列所需的合适核酸序列的重组DNA分子。众所周知，在真核细胞中可以使用启动子、增强子、终结信号及多腺_酸化信号。植物表达载体的较佳实例是Ti质体载体，当它存在于如根癌农杆菌的合适宿住时把自身的一部分，即所谓T区域转移到植物细胞。其他类型的Ti质体载体(参照EP O 116718 BI号)目前以可生产新种植物的原生质体利用在把植物细胞、或杂交DNA适当地插入植物基因体而转移杂交DNA序列。尤其Ti质体载体的较佳形式是如EP O 120 516 BI号及美国专利第4，940，838号请求的所谓二元载体。向植物宿住引入本发明的DNA，可利用的其他合适载体可以从来自于双链植物病毒包括CaMV、单链植物病毒及Gemini病毒等的病毒载体等选择，例如不完全性植物病毒载体。尤其难以合适转化植物宿住时，使用所述载体可能有利。所述表达载体最好可以包含一个以上的筛选标志。所述标志是核酸序列通常具有以化学方法可选出的特性，包含可从非转化细胞分别转化细胞的所有基因。例如，可列举如嘉磷塞或草铵膦等的除草剂抗性基因，如卡那霉素，G418，博来霉素，潮霉素，氯霉素等的抗生剂耐性基因，但不限于此。术语“启动子”是指从构造基因起的DNA上游区域，即意味着为了开始转录RNA聚合酶结合的DNA分子。“植物启动子”是在植物细胞中可以开始转录的启动子。“组成启动子”是大部分的环境条件及发展状态或是细胞分化下具有活性的启动子。因为转化的选择在各种步聚中由各种组织完成，组成启动子在本发明可能比较有利。因此，组成启动子不限制选择可能性。所述终结子可以使用通常的终结子，例如可列举胭脂碱合成酶(N0S)、水稻α淀粉酶Ramyl A终结子，菜豆碱终结子，根癌农杆菌的章鱼碱基因的终结子等，但不限于此。关于终结子的心要性，通常认为此种区域增加植物细胞转录的可靠性及效率。因此，在本发明的内容最好使用终结子。根据本发明一实施例的重组植物表达载体中，所述植物表达载体是编码标的蛋白质的标的基因可操作地连接在在本发明启动子的下游而制造的。在本发明中，“可操作地连接”是指以单位作用于表达异源蛋白质的表达盒成分。例如，可操作地连接在编码蛋白质的异源DNA的启动子促进生产相当于异源DNA的功能性mRNA。所述标的蛋白质可以是所有种类的蛋白质，例如酶，荷尔蒙，抗体，细胞激素等具有医学活用性，或可以增进包含人类动物健康的大量储存营养成分的蛋白质，但不限于此。标的蛋白质，例如可列举介白素、干扰素、血小板诱导成长因子、血红素、弹力蛋白、胶原蛋 白、胰岛素、纤维母细胞生长因子、人体成长因子、人体血清白蛋白、红血球生成素等，并不限此。另外，本发明提供以所述重组植物表达载体转化植物体而在植物体地上部位生产标的蛋白质的方法。另外，提供由所述生产方法生产的标的蛋白质。生产的标的蛋白质如前述一样。植物转化是指将DNA转移到植物的任意方法。此种转化方法不一定具有再生及(或)组织培养期。植物种的转化目前不仅对双子叶植物，也对单子叶植物都很普遍。原则上，可以使用任意的转化方法将本发明的杂交DNA引入适当的祖细胞。所述的方法可适当地选自用于原生质体的I丐/聚乙二醇方法(Krens, F. A. et al. , 1982, Nature 296,72-74; Negrutiu I. et al. , June 1987，Plant Mol. Biol. 8，363-373)，用于原生质体的电穿孔方法(Shillito R.D. et al. , 1985 Bio/Technol. 3，1099-1102)，用于植物成分的显微注射方法(Crossway A. et al. , 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185),用于各种植物成分(被DNA或RNA覆盖的)的粒子冲击方法(Klein T. M. et al.，1987，Nature327，70)，对植物的浸泡或成熟花粉或是小孢子的转化由根癌农杆菌媒介基因转移(非完全性)中的病毒感染(EP O 301 316号)等。根据本发明的较佳方法包含农肝菌媒介的DNA传移。尤其较好使用EP A 120 516号及美国专利第4，940，838号公开的二元载体技术。利用在植物转化的“植物细胞”是任意细胞。植物细胞是培养细胞、培养组织、培养器官或全体植物，较好是培养细胞、培养组织或培养器官及更好是任意形态的培养细胞。“植物组织”是分化的或是未分化的植物组织，例如根、茎、叶、花粉、种子、愈合组织及利用在培养的多种形态的细胞，即包含单一细胞、原生质体、芽及愈合组织，但不限于此。植物组织可以是在植物中，或是器官培养、组织培养或细胞培养的状态。在本发明的另一观点，提供转化植物的制造方法，其特征是包含以根据本发明的重组植物表达载体使植物细胞转化的步骤；以及从所述转化植物细胞再分化转化植物的步骤。本发明的方法是包含以根据本发明的重组植物表达载体使植物细胞转化的步骤，所述转化可由根癌农杆菌媒介。另外，本发明的方法包含从所述转化植物细胞再分化转化植物的步聚。从转化植物细胞再分化转化植物的方法可利用在同业界公开的任意方法。
另外，本发明提供由根据本发明的转化植物的制造方法制造的转化植物。较好地所述植物是单子叶植物，更好地可以是水稻、大麦、小麦、玉米、小米或高粱，但不限于此。另外，本发明提供从所述转化植物获得的种子。较好地所述种子是来自单子叶植物，更好地可以来自水稻、大麦、小麦、玉米、小米或高粱，但不限于此。有益效果
根据本发明的启动子可以利用于植物体，尤其是单子叶植物的转化。特别在如水稻的单子叶植物，对特异地表达叶子基因的转化植物体将会有巨大的贡献。


图I显示水稻各组织的地上部位表达基因的表达；
图2是水稻转化载体的模似 图3是根据本发明一实施例的启动子构造 图4显示在转化水稻种子内的GFP萤光表达；
图5显示在转化幼苗上的GFP萤光表达；
图6显示在转化水稻花上的GFP萤光表达；
图7是利用RT-PCR对幼苗上的萤光表达的分量比较。
具体实施例方式以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例只是例示本发明，并不是以这些实施例限制本发明的范围。
实施例材料及方法
I.预测启动子序列及萃取
1997年开始2004年12月完成水稻整体基因体定序的国际水稻基因组测序计划(IRGSP)序列和根据此实施基因命名的TIGR命名数据，利用所述序列和数据预测启动子区域来制作水稻转化载。选定结束命名的BAC，从编码序列(⑶S)的ATG位置到上游约2kbp的序列假设为启动子区域，只萃取此序列，在2kbp之内要分离整体大小为约I. 8-2kb的启动子，使用为聚合酶链反应(PCR)引子制作用模板。.使用RT-PCR(反转录酶-PCR)的地上部位表达基因分析
为了分析地上部位表达基因，从种子，和长7天、30天、60天的苗的叶子和根以及花组织采取了试料。为了准备试料以70%乙醇和20%chloraX溶液消毒种子，在无光状态发育5天,在温室展开。为了萃取整体RNA,使用了 RNeasy植物小型试剂盒(Qiagen, Cat.No. 74904)。萃取的整体RNA400ng合成了第 I 条cDNA(Invitrogen, Cat. No. 18080-051),cDNA合成反应物I均做为模板实施了 PCR，在PCR反应中使用的引子如下，为了比较使用的cDNA量(loading control)使用了泛素引子(ubi),其序列如下
正方向引子 RbcS3:5’- TATACAGAGGAGACTCGATTGA -3’(序列号 3)
反方向引子 RbcS3 : 5’- TACATACACAGCTGATGTTGAC-3’(序列号 4)
正方向引子 PRK :5’-GGCATCCTCGCATTTCTTGTA-3’(序列号 5)反方向引子 PRK : 5’ -AGAGGTAGGAGCATCCTCAT-3’(序列号 6 )
正方向引子 RbcSl :5’-GGTGGCAACTAAGCCGTCAT-3’(序列号 7)
反方向引子 RbcSl :5’-AAGCAGAGCACGGCCGGTAA-3’(序列号 8)
正方向引子 OsCcl :5’-ACTCTACGGCCAACAAGAAC-3’(序列号 9)
反方向引子 OsCcl :5’-CTCCTGTGGCTTCTTCAACC-3’(序列号 10)
正方向引子 OsUbil :5’-ATGGAGCTGCTGCTGTTCTA-3’(序列号 11)
反方向引子 OsUbil :5’-TTCTTCCATGCTGCTCTACC-3’(序列号 12)
PCR 条件是 PTC200 PCR machine(MJ research), cDNA I 均，2X Taq premix(Solgent.Co. Cat. No. EP051020-T2B6-1)，模板特异性引子分别以4pmol，全体以20均反应，95°C30秒，550C 30秒，720C I分，32转进行。.启动子的增幅(amplification)及分离(isolation)
预测的2kbp启动子序列为模板,利用引子designer4 program(ver. 4. 20, Scientific& Educational software),设计了分离整体大小为约I. 8_2kb的启动子的PCR引子。设计条件是PCR条件是引子的GC%范围在40-60%，Tm范围55_66°C，碱及游离镁浓度分别为0，0. 15mM，引子(PCR引子)的长度是使模板特异性区域为20bp，使5’接头序列)为12bp。此接头序列不是为了利用限制酶和DNA接合酶的现有选殖方法，是为了位置特异性重组而插入的序列。为了获得PCR反应中使用为模板的DNA，播种日本型Nipponbare品种的水稻,在温室生长3周后，只切开叶子萃取了基因体DNA。基因体DNA是首先切开的叶子用液体氮急速冷冻，利用研钵微细地磨碎后，利用DNAzol (molecular research center, Cat. No.DN128)溶液分离的。PCR反应分成两个步骤进行。I次反应是从水稻的基因体中分离特定启动子的反应，使用了连接在12bp接头序列的整体大小32bp的模板特异性引子。引子序列的构成如下
正方向模板特异性引子5’ -AAAAAGCAGGCT-模板特异性序列_3’
反方向模板特异性引子5’-AGAAAGCTGGGT-模板特异性序列_3’
具体的基因特异性引子序列如下。a. RbcS3启动子引子
正方向引子5’ -AAAAAGCAGGCTGCGAGGTGCTTAGGCTATTG-3’(序列号 13)
反方向引子5’ -AGAAAGCTGGGTGCATACAGCTGATCCTTCCAC-3’(序列号 14)b. PRK启动子引子
正方向引子5’ -AAAAAGCAGGCTGTCTGTTGGCCTACGACAAG-3’(序列号 15)
反方向引子5’ -AGAAAGCTGGGTCTGAGCATGAAACCTGAAAG-3’(序列号 16)
I 次 PCR 是基因体 DNA50ng, 2X Taq premix (Solgent. Co. Cat. No.EP051020-T2B6-1)，模板特异性引子分别lOpmol，全体以50ul反应，95°C I分，55°C I分，680C 2分，30转进行。2次反应是为了插入启动子于转化用载体而插入需要的接头序列(att site),为了增幅而实施。要附加插入于启动子的序列长度是约29bp，为了提高PCR的效率此序列的一部分(12bp)悬挂在模板特异性序列执行第一次PCR后，取此PCR反应液的1/50 (Iul)再以具有整体重组序列的引子(接头序列引子)进行第二次PCR反应。因此，此反应物具有水稻的启动子和用于重组的att序列。接头序列引子的序列如下attBl 接头引子5’ -GGGGACAAGITTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’(序列号 17) attB2 接头引子5’ -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’(序列号 18)
2 次 PCR 是 I 次 PCR 反应物 lul，2X Taq premix (Solgent. Co. Cat. No.EP051020-T2B6-1)，接头引子分别 2pmol，全体以 50ul 反应，95°C 30 秒，45。。30 秒，68°C 2分，5转进行后，再以95°C 30秒，55°C 30秒，68°C 2分，20转进行。上面的PCR 方法是为了利用 Gateway 系统(Invitrogen, Cat. No. 12535-029)以Invitrogen提示的方法执行的。.增幅的启动子的选殖
利用Gateway系统(Invitrogen, Cat. No. 12535-029)插入于转化用载体。首先,增幅的启动子在1%琼脂糖凝胶上电泳后，在凝胶上以亮带分离及Mega-spin琼脂糖凝胶萃取试剂盒(Intron, Cat. No. 17183)纯化,纯化的启动子5ul, BP clonase酶混合物4ul, 5X BP 反应缓冲 4ul，pD0NR 载体 300ng/2ul，TE 缓冲(IOmM Tris/pH8. O, ImM EDTA)，全体 20ulBP反应在25°C执行了 16小时。之后，在此反应物添加LR clonase酶混合物6ul，0. 75MNaCl lul,转化用转体450ng/3ul,全体30ul, 25°C,进行了 LR反应8小时，添加porteinaseK 3ul，在37°C反应I小时后，其中取出2ul在DH5a胜任细胞转化，转化的DH5a细胞50ug/ml在含有大观霉素抗生剂的LB琼脂培养基上展开，在37°C恒温器培养12小时后，在筛选的细胞中萃取DNA通过PCR反应确认是否插入启动子后，执行定序及BLASTN，由分离的启动子确认完整的插入。水稻转化载体pMJ401如下。右边界序列和左边界序列之间重组后与启动子交替的盒以标志基因GFP和PINII (蛋白酶抑制剂II)终结子连接在3’方向。能使所述盒执行BP及LR反应具有att序列。筛选基因(筛选标志基因)是除草剂抗性基因Bar (草丁膦乙转移基因)，基因Bar制造得可由本发明人开发的持续性表达启动子OsCcl(参见美国专利第6，958，434)来调整，此基因由NOS (胭脂碱合成酶)终结子连接。另外,右边界序列(right-border sequence)末端装上MAR序列使根据染色体内引入部位的表达量变化最少化而使得只能测定启动子的固有活性。.利用农杆菌的水稻转化
Nakdong 水稻种子(Oryza sativa L. cv Nakdong)去外壳后，添加 70% (v/v)乙醇，轻摇I分洗涤。洗涤的种子在放入20%chlorax内摇动I小时消毒，用灭菌水洗涤数次。洗涤的种子为了转化，如 Jang 所述(Jang, I-C. et al. , Mol breeding, 5:453-461，1999),在愈合组织诱导培养基(2N6)培养一个月诱导胚芽愈合组织后，与由Agrobacterium triplemating方法获得的农杆菌共同培养，插入所述启动子的转化载体插入水稻基因体后，转化的愈合组织在筛选培养基(2N6-CP)培养一个月。之后,挑选筛选长大的细胞在再分化培养基(MS-CP)培养一个月到两个月后再分化的植物体在温室中顺化。顺化的水稻经一种除草剂处理后，挑选对此显示抗性的植物体做了后裔检定。.观察水稻各器官的GFP表达
为了分析启动子的活性，使用的标志基因GFP的表达确认是，在种子、黑暗状态生长5天的幼苗和花器宫上观察到的。基因表达的观察是在能确实观察基因的插入及分离的T2步骤开始实施。种子的GFP表达是去外壳，利用LAS3000系统(Fuji photo film. co.)和立体显微镜SZX9-3122 (Olympus, Tokyo, Japan)在种子的胚和胚乳观察到GFP表达。对无光培养的幼苗，在种子中观察到GFP表达的种子再用乙醇和20%chloraX溶液消毒，为了确认筛选标志bar基因的活性，在含有PPT成分的MS-P培养基(PPT4mg/l)黑暗状态下发芽了两天。在黑暗状态发芽的幼苗是以LAS3000观察GFP表达，接着在恒温器中生长三天后，在幼叶和根观察到基因表达。LAS3000的条件是精确度、标准以及I秒曝光时间(460nm感光滤色片，510nm抑止滤光片)。花在出穗之前采取，利用立体显微镜SZX9-3122 (Olympus,Tokyo, Japan)，观察去花的颖片之前和之后，观察了各器官的GFP表达。.以RT-PCR分析启动子活性
无光培养的幼苗分成_叶和根萃取了整体RNA。在种子中观察到GFP表达的种子用乙醇和20%chlorax溶液消毒，为了确认筛选标志bar基因的活性，在含有PPT (固杀草)成分的MS-P培养基(PPT4mg/l)，在恒温器，黑暗状态下发育了五天。为了在此幼苗中萃取整体RNA，使月了 RNeasy植物小型试剂盒(Qiagen, Cat. No. 74904)。以萃取的整体RNA400ng合成了第 I 条 cDNA (Invitrogen, Cat. No. 18080-051),米取此 cDNA 合成反应物 2ul 做 为模板实施了 PCR。PCR反应使用了两种引子。第I个引子是要相对比较启动子间插入的GFP表达量的引子(引子GFP)，第2个引子是要比较cDNA使用量(loading control)的引子(引子OsUbiI )，引子序列如下
正方向引子 GFP :5’-CAGCACGACTTCTTCAAGTCC-3’(序列号 19)
反方向引子 GFP :5’ -CTTCAGCTCGATGCGGTTCAC-3’(序列号 20)
正方向引子 OsUbil :5’-ATGGAGCTGCTGCTGTTCTA-3’(序列号 11)
反方向引子 OsUbil :5’-TTCTTCCATGCTGCTCTACC-3’(序列号 12)
PCR 条件是 PTC200 PCR machine (MJ research), cDNA 2ul, 2X Taq premix (Solgent.Co. Cat. No. EP051020-T2B6-1)，模板特异性引子分别以4pmol，全体以20ul反应，95°C30秒，55°C I分，4°C 10分，25转进行。实施例I :地上部位表达基因的水稻各组织表达分析
为了观察RbcS3及PRK的地上部位表达启动子的组织特异活性，在种子，和长7天、30天、60天的苗分别从叶子和根的组织以及花组织采取了试料，在各试料萃取了全体RNA。此RNA为模板合成cDNA，执行PCR而增幅后，在2%琼脂糖凝胶上电泳。图I是利用RT-PCR,水稻内2个地上部位表达基因及已公知的启动子RbcSl (GenBank accession no.D00643), OsCcl (GenBank accession no. AF399666)以及 OsUbil (GenBank accessionno. AK121590)的各组织表达现象的比较结果。如图I所示，可知在本发明使用的RbcS3及PRK的水稻内各组织的表达在包含叶和花的地上部位组织表达的很强。另外，显示与已被知晓的持续性表达启动子RbcSl基因表达类似的现象，由此可确认这些是地上部位表达基因。实施例2 :水稻转化用载体的制造及启动子构造
制作了分析启动子活性的水稻转化用载体，显示在图2。图2显示pMJ401载体，是筛殖以PCR分离的启动子的母载体。attRl，attR2位置是BP反应后与启动子具有的attLl，attL2序列发生重组(位置特异性重组)的部位，LR反应后,启动子和盒交替，attRl, attR2序例也和attLl, attL2交替。对各基因的说明如下MAR, matrix attachment region(I. 3kb) , X98408 ;盒 B，转换盒 B (I. 7kb)，invitrogen, Cat. No. 11828-019 ;GFP，变形绿萤光蛋白基因(O. 74kb)，U84737 ;TPINII，蛋白酶抑制剂II终结子(I. Okb), X04118;OsCcl，细胞色素 c 启动子(O. 92kb), Af399666 ;BAR，草丁膦乙转移基因(O. 59kb)，X17220 ；TN0S，胭脂碱合成酶终结子(O. 28kb)。图3是显示本发明启动子的水稻基因体上的构造。实施例3:转化水稻种子内的GFP萤光表达
从以各启动子载体转化的水稻获得至T3步骤的后裔后，去掉种子的颖片利用立体显微镜 SZX9-3122 (Olympus, Tokyo, Japan)观察了 GFP 表达。图4显示在转化水稻种子内的GFP萤光表达。在图4对各基因的说明如下。NC:阴性对照组Nakdong (非转化种子)；RbcS3 RbcS3启动子；PRK :PRK启动子；RbcSl =RbcSl启动子；0sCcl Oryza sativa L.细胞色素C启动子；ZmUbil :玉米泛素启动子载体。在非转化的对照组(阴性对照组)在胚略有背景，但种子整体上GFP没有表达。以阳性对照组使用的OsCcl启动子，RbcSl启动子在程度上有差异，但都在胚上GFP表达，尤其玉米泛素启动子不仅在胚，也在胚乳可观察到很强的GFP。根据本发明的2种新的启动子(RbcS3以及PRK)，与持续性表达启动子OsCcl启动子和玉米泛素启动子比较时，虽然表达的弱，但在叶子上显示与特异性RbcSl启动子类似程度的GFP表达。实施例4 :转化_曲的GFP萤光表达
从以各启动子载体转化的水稻获得至T3步骤的后裔后，去掉种子的颖片利用立体显微镜SZX9-3122 (Olympus, Tokyo, Japan)观察了 GFP表达,确认是否为同型结合子。确认的种子经消毒后，在恒温器(27°C)以黑暗状态发育5天后，以LAS3000系统(Fuji photofilm, co.,精确度、标准、I秒的曝光时间，460nm感光滤色片，510nm抑止滤光片)观察了 GFP表达。在黑暗状态下生长的幼苗状态观察GFP表达是为了防止发生由植物体内的叶绿素对萤光的干涉现象而不好观察GFP萤光表达的情形。图5显示在转化幼苗上的GFP萤光表达。在图5对各基因的说明如下。NC :阴性对照组Nakdong (非转化种子)；RbcS3 RbcS3启动子；PRK PRK启动子；RbcSl =RbcSl启动子；0sCcl Oryza sativa L.细胞色素C启动子；ZmUbiI :玉米泛素启动子载体。如图5所示，在非转化的对照组(阴性对照组)在种子略有背景，但在幼叶和根GFP没有表达。如现有的公知，以阳性对照组使用的RbcSl启动子在叶子上表达的很强，OsCcl启动子和玉米泛素启动子在叶子和根可观察到很强的GFP。根据本发明的2种新的启动子(RbcS3以及PRK)，如同RbcSl启动子主要在叶子上基因表达。实施例5 :转化水稻花的GFP萤光表达
在种子及幼苗显示均等GFP表达的T2后裔种子播种在温室，采取出穗之前的花，利用立体显微镜SZX9-3122(01ympus，Tokyo, Japan)在去花的颖片之前和之后，观察了各组织的GFP表达。图6显示在转化水稻花上的GFP萤光表达。在图6对各基因的说明如下。NC:阴性对照组Nakdong (非转化种子)；RbcS3 RbcS3启动子；PRK PRK启动子；RbcSl =RbcSl启动子；0sCcl Oryza sativa L.细胞色素C启动子；ZmUbil :玉米泛素启动子载体。OsCcl :GFP在水稻种子和幼苗的叶子和根都表达的很强，但在花几乎没有表达，在叶子显出特异表达的RbcSl :GFP在花药观察到GFP表达。ZuUbil:GFP在外稃，内稃，雄蕊，花药等所有花器上表达很强，可知在植物体整体表达。
根据本发明的2种新的启动子与对照组比较时，在所有花器上表达，但表达的分量不多，可称为叶子特异性表达。由此结果，新分类的本发明启动子(RbcS3及PRK)与现有的叶子特异性表达的RbcS启动子比较，可知是较少影响于生殖的叶子特异性启动子。实施例6 :利用RT-PCR的转化水稻，在其幼苗上的启动子活性(GFP表达程度)分析
无光培养5天的幼苗分成_叶和根萃取了 RNA。此RNA为模板合成cDNA，执行PCR增幅后，在I. 2%琼脂糖凝胶上电泳。标志使用IOObp ladder 300ng，各PCR产物载入5ul。GFP是增幅GFP引子的PCR产物，是相对地与插入启动子的GFP表达量做比较的产物，其大小是142bp。OsUbil是增幅Ubi引子IOObp的PCR产物，是与以模板使用的cDNA量(负载控制)做比较。如图7所示，如观察水稻幼苗的GFP萤光照片一样(参见图5)，RbcSl = GFP在根部 表达很弱，相对地在叶部表达的很强，但是与OsCcl:GFP，ZmUbiliGFP比较表达的相当弱。OsCcI:GFP在叶部和根部都比ZmUbil = GFP表达的强。据此，可以看出根据本发明的2种新的启动子(RbcS3及PRK)是比叶子特异性启动子RbcSl在叶部表达的更强。尤其，RbcS3启动子与RbcSl启动子和其他启动子在根部基因表达很弱的情形不同地，只有在叶表达。本发明的RbcS3启动子和PRK启动子，比RbcSl启动子强，与玉米泛素启动子类似。因此，根据本发明的两个启动子是植物体地上部位表达启动子，可以看出比现有的RbcSl启动子表达量良好。另外，根据本发明RbcS3启动子是叶子组织等异性表达，因为PRK启动子分别在根组织略有表达，在叶组织表达良好，根据表达现象的差异，可选择合适的启动子。
权利要求
1.一种启动子，其特征是包含从序列号I及2形成的群中选出的至少一个序列。
2.根据权利要求I所述的启动子，其特征是所述启动子是植物体地上部位表达的单子叶植物转化启动子。
3.根据权利要求2所述的启动子，其特征是所述植体地上部位是叶子。
4.根据权利要求I所述的启动子，其特征是所述启动子包含与从序列号I及2形成的群中选出的至少一个序列具有95%以上序列相同度的序列。
5.根据权利要求I所述的启动子，其特征是所述启动子包含与从序列号I及2形成的群中选出的至少一个序列成互补的序列。
6.根据权利要求2所述的启动子，其特征是所述单子叶植物是水稻、大麦、小麦、玉米、小米或高粱。
7.一种包含根据权利要求I至6的任意一项所述的启动子的重组植物表达载体。
8.根据权利要求7所述的重组植物表达载体，其特征是所述载体是编码标的蛋白质的标的基因可操作地连接在所述启动子的下游而制造的。
9.一种以根据权利要求8所述的重组植物表达载体使植物体转化而在植物体地上部位生产标的蛋白质的方法。
10.一种根据权利要求9所述的蛋白质生产方法生产的标的蛋白质。
11.根据权利要求10所述的标的蛋白质是由介白素、干扰素、血小板诱导成长因子、血红素、弹力蛋白、胶原蛋白、胰岛素、纤维母细胞生长因子、人体成长因子、人体血清白蛋白以及红血球生成素形成的群中选出的至少一个。
12.一种转化植物的制造方法，其特征是包含 以根据权利要求7所述的载体使植物细胞转化的步骤；及 从所述转化植物细胞再分化转化植物的步骤。
13.一种以根据权利要求12所述的方法制造的转化植物。
14.根据权利要求13所述的转化植物，其特征是所述植物是单子叶植物。
15.一种根据权利要求13或14所述植物的种子。
全文摘要
本发明涉及使值物转化的启动子。具体地说，本发明涉及植物体地上部位表达用启动子，包含所述启动子的重组植物表达载体，利用所述重组植物表达载体生产标的蛋白质的方法，根据所述方法生产的标的蛋白质，利用所述重组植物表达载体的转化植物的制造方法，根据所述方法制造的转化植物及所述植物的种子。
文档编号C12P21/00GK102883596SQ201180017159
公开日2013年1月16日 申请日期2011年4月1日 优先权日2010年4月9日
发明者金周坤, 朴洙贤 申请人:明知大学产学协力团