癌的治疗和/或预防用药物组合物的制作方法

专利名称：癌的治疗和/或预防用药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对CAPRIN-I的抗体或其片段作为癌的治疗和/或预防剂等的新的医药用途。
背景技术：
癌是占所有死亡原因的第一位的疾病，现行的治疗是以手术疗法为主、组合使用放疗法和化疗法的治疗。尽管近年来也有新的手术方法的开发、新型抗癌药的发现，但现状是除了一部分癌症，癌的治疗成绩并没有多大提高。近年来，随着分子生物学、癌免疫学的进步，与癌特异性反应的抗体类、由细胞毒性T细胞识别的癌抗原类、编码癌抗原的基因类等被鉴定，对以癌抗原类为靶的特异性的癌治疗方法的期待正在提高(非专利文献I)。
在癌治疗方法中，为了减轻副作用，期望作为癌抗原被识别的肽、多肽或蛋白质在正常细胞中几乎不存在，而在癌细胞中特异性地存在。1991年，比利时Ludwig研究所的Boon等通过使用了自身癌细胞株和癌反应性T细胞的cDNA表达克隆法分离了由⑶8阳性T细胞所识别的人黑素瘤抗原MAGEl (非专利文献2)。之后，报道了 SEREX(重组表达克隆的抗原血清学分析，serological i dent i feat ion of antigens by recombinant expressioncloning)法，其采用基因的表达克隆的方法来鉴定由在癌患者的活体内与自身的癌反应而产生的抗体所识别的肿瘤抗原(非专利文献3和专利文献I)，利用该方法，在正常细胞中几乎没有表达、在癌中特异性地表达的几种癌抗原被分离(非专利文献4 9)。进一步地，实施了使用以其一部分为靶、与癌抗原特异性反应的免疫细胞的细胞疗法、或含有癌抗原的疫苗等的癌特异性免疫疗法的临床试验。另一方面，近年来，以癌细胞上的抗原蛋白质为靶的、用于治疗癌的各种抗体药物在世界上有所增长。作为癌特异性治疗药得到了一定的药效而受到人们的瞩目，但成为靶的抗原蛋白质的大部分在正常细胞中也表达，作为抗体施与的结果，不仅是癌细胞，表达抗原的正常细胞也受到损伤，该结果所产生的副作用成为问题。因此，如果能够鉴定在癌细胞表面特异性地表达的癌抗原、并使用以该癌抗原为靶的抗体作为药物，则可以期待实现副作用更少的利用了抗体药物的治疗。细胞质增殖相关蛋白I (Cytoplasmic-and proliferation-associateed protein1，CAPRIN-1)是已知在分裂间期的正常细胞发生活化和/或细胞分裂时表达，并在细胞内与RNA形成细胞内应激颗粒而参与mRNA的运输、翻译的控制等的细胞内蛋白质。另一方面，CAPRIN-I具有各种别名，作为其例子，有GPI锚定膜蛋白I、膜组分表面标志物I蛋白(MllSl)等，有宛如已知本蛋白质是细胞膜蛋白质那样的名称。这些别名本来源自认为CAPRIN-I的基因序列具有GPI结合区、并且CAPRIN-I是在大肠癌细胞中表达的膜蛋白质(非专利文献10)的报告，但后来报告了 上述非专利文献10的报告中的CAPRIN-I的基因序列有误，现在在GenBank等中登记的CAPRIN-I基因序列中由于I个碱基缺失而发生移码，从而80个氨基酸从C末端缺失，其结果是所产生的人为产物(74个氨基酸)是上述报告中的GPI结合部分，而且在5’侧也存在基因序列的错误，53个氨基酸从N末端缺失(非专利文献11)。另外，已经报告了由现在在GenBank等中登记的CAPRIN-I的基因序列编码的蛋白质不是细胞膜蛋白质(非专利文献11)。并且，基于认为CAPRIN-I是细胞膜蛋白质的非专利文献10的报告，专利文献2和3以MlISl的名称记载了 CAPRIN-I作为细胞膜蛋白质的一种可作为抗体药物的靶而用于癌治疗(实施例中完全没有关于使用了针对本蛋白质的抗体的治疗的记载)。但是，如非专利文献11的报告所述，从专利文献2申请时到现在，CAPRIN-I是不在细胞表面表达的蛋白质已经成为了一般说法，显然仅基于CAPRIN-I是细胞膜蛋白质这样的错误信息的专利文献2和3的内容不应当理解为本领域技术人员的技术常识。现有技术文献专利文献专利文献I :美国专利第5698396号专利文献2 :US2008/0075722
专利文献 3 W02005/100998非专利文献非专利文献I :秋吉毅，“癌i化学療法”、1997年、第24卷、p551_519(癌i化学療法社、日本)非专利文献2 =Bruggen P. et al.，Science, 254 :1643-1647(1991)非专利文献3 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 :11810-11813(1995)非专利文献4 : Int. J. Cancer, 72 :965-971(1997)非专利文献5 =Cancer Res.，58 1034-1041 (1998)非专利文献6 Int. J. Cancer, 29 :652-658 (1998)非专利文献7 Int. J. Oncol.，14 :703-708(1999)非专利文献8 =Cancer Res.，56 :4766-4772 (1996)非专利文献9 Hum. Mol. Genet6 :33-39,1997非专利文献10 J. Biol. Chem.，270 :20717-20723,1995非专利文献11 J. Immunol.，172 :2389-2400,200
发明内容
发明要解决的课题本发明的目的是鉴定在癌细胞的表面特异性地表达的癌抗原蛋白质，提供以该癌抗原蛋白质作为靶的抗体的、作为癌的治疗和/或预防剂的用途。用于解决课题的方法本发明人等进行了努力研究，结果发现通过使用了源于狗的精巢组织的cDNA文库和患乳癌的狗的血清的SEREX法，获取编码与在源于荷癌生物体的血清中存在的抗体结合的蛋白质的cDNA，以获取的基因和该基因的人、牛、马、小鼠、鸡同源性基因为基础，制作了具有序列编号2 30中偶数的序列编号所示的氨基酸序列的CAPRIN-I和针对这些CAPRIN-I的抗体。并且发现CAPRIN-I在乳癌、脑瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、食道癌、大肠癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌和纤维肉瘤中特异性地表达，而且CAPRIN-I蛋白质的一部分在这些癌细胞的细胞表面特异性地表达。并且发现针对CAPRIN-I的在各癌细胞的细胞表面表达的部分的抗体损伤表达CAPRIN-I的癌细胞，从而完成了本发明。因此，本发明具有以下特征。本发明提供用于癌的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于，含有与由序列编号2 30中偶数的序列编号表示的CAPRIN-I的部分多肽具有免疫反应性的抗体或其片段作为有效成分，所述CAPRIN-I的部分多肽具有序列编号37所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。在其实施方式中，上述癌是乳癌、脑瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、食道癌、大肠癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌或纤维肉瘤。在另外的实施方式中，上述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。 在另外的实施方式中，上述抗体为人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、或双特异性抗体。本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2010-023454号、2010-183162号的说明书和/或附图
中记载的内容。发明的效果本发明中使用的针对CAPRIN-I的抗体损伤癌细胞。因此，针对CAPRIN-I的抗体在癌的治疗和/或预防中是有用的。附图的简单说明图I是显示编码CAPRIN-I蛋白质的基因的在正常组织和肿瘤细胞株中的表达图谱的图。参照编号I显示编码CAPRIN-I蛋白质的基因的表达图谱，参照编号2显示GAPDH基因的表达图谱。图2是显示由与癌细胞的细胞表面反应的针对CAPRIN-I的多克隆抗体产生的、对表达CAPRIN-I的乳癌细胞株MDA-MB-157的细胞毒性的图。参照编号3显示添加# I的针对CAPRIN-I的多克隆抗体时的活性，参照编号4显示添加源于没有用抗原免疫的兔的对照抗体时的活性，参照编号5显示添加PBS代替抗体时的活性。
具体实施例方式本发明中使用的针对序列编号2 30中偶数的序列编号的多肽的抗体的抗肿瘤活性，可以如下所述，通过研究在生物体内对荷癌动物的肿瘤增殖的抑制，或者通过研究在生物体外对表达该多肽的肿瘤细胞是否显示介由免疫细胞或补体的细胞毒性，来进行评价。其中，编码包含序列编号2 30中偶数的序列编号(即，序列编号2，4，6……28，30)的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列，分别在序列编号I 29中奇数的序列编号(即，序列编号1，3,5......27,29)中显不。本发明公开的序列表的序列编号6、8、10、12和14所示的氨基酸序列是通过使用了源于狗精巢组织的cDNA文库和患乳癌的狗的血清的SEREX法，作为与在源于荷癌狗的血清中特异性地存在的抗体结合的多肽而被分离出的CAPRIN-I的氨基酸序列，另外，序列编号2和4所示的氨基酸序列是作为上述多肽的人同源因子(同源物)而被分离出的CAPRIN-I的氨基酸序列，序列编号16所示的氨基酸序列是作为上述多肽的牛同源因子而被分离出的CAPRIN-I的氨基酸序列，序列编号18所示的氨基酸序列是作为上述多肽的马同源因子而被分离出的CAPRIN-I的氨基酸序列，序列编号20 28所示的氨基酸序列是作为上述多肽的小鼠同源因子而被分离出的CAPRIN-I的氨基酸序列，序列编号30所示的氨基酸序列是作为上述多肽的鸡同源因子而被分离出的CAPRIN-I的氨基酸序列(参照下述的实施例I)。已知CAPRIN-I在分裂间期的正常细胞发生活化和/或细胞分裂时表达。已知CAPRIN-I不在细胞表面表达，但根据本研究，可以明确CAPRIN-I蛋白质的一部分在各种癌细胞的细胞表面表达。而且，可以明确识别包含序列编号37所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80%以上、优选85%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上的序列同一性的氨基酸序列的CAPRIN-I蛋白质的部分多肽的抗体，显示抗肿瘤活性。本发明的抗体包含与上述CAPRIN-I蛋白质的片段结合、且显示抗肿瘤活性的所有抗体。本发明中使用的针对上述CAPRIN-I的抗体只要是可发挥抗肿瘤活性，就可以是任何种类的抗体，包含例如单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体例如合成抗体、多特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(scFv)等、人抗体、它们的抗体片段例如Fab和/或F(ab’)2、Fv等。这些抗体和其片段还可以利用本领域技术人员公知的方法制备。在本发明中，期望是与CAPRIN-I蛋白质或其部分多肽具有免疫反应性(即，介由抗原-抗体反应 与CAPRIN-I蛋白质结合)的抗体、优选可与CAPRIN-I蛋白质特异性地结合的抗体，优选为单克隆抗体，但只要可稳定地生产均质的抗体，则也可以是多克隆抗体。另外，当受试者是人时，为了避免或抑制排斥反应，期望是人抗体或人源化抗体。这里，“与CAPRIN-I蛋白质特异性地结合”是指与CAPRIN-I蛋白质特异性地结合，与CAPRIN-I蛋白质以外的蛋白质实质上不结合。本发明中可使用的抗体的抗肿瘤活性，可以如下所述，通过研究在生物体内对荷癌动物的肿瘤增殖的抑制，或者通过研究在生物体外对表达该多肽的肿瘤细胞是否显示介由免疫细胞或补体的细胞毒活性，来进行评价。进一步地，本发明中作为癌的治疗和/或预防的对象的受试者是人、宠物、家畜类、竞技用动物等哺乳动物，优选的受试者是人。以下对于与本发明相关的抗原的制备、抗体的制备、以及药物组合物进行说明。<抗体制备用抗原的制备>作为用于获取本发明中使用的针对CAPRIN-I的抗体的致敏抗原使用的蛋白质或其片段，可以源自人、狗、牛、马、小鼠、大鼠、鸡等，对成为其来源的动物种类没有限制。但是优选考虑与在细胞融合中使用的母细胞的适合性来选择该蛋白质或其片段，一般来说，优选源于哺乳动物的蛋白质，特别优选源于人的蛋白质。例如当CAPRIN-I是人CAPRIN-I时，可以使用人CAPRIN-I蛋白质和/或其部分肽、表达人CAPRIN-I的细胞等。人CAPRIN-I和其同源物的碱基序列和氨基酸序列例如可以通过访问GenBank(美国 NCBI)，利用 BLAST、FASTA 等的算法(Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90 :5873-5877,1993 ；Altschul et al. ,Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402,1997)来得到。在本发明中，当以人CAPRIN-I的碱基序列(序列编号I或3)或氨基酸序列(序列编号2或4)为基准时，包含与它们的ORF或成熟部分的碱基序列或氨基酸序列具有70% 100%、优选80% 100%、更优选90% 100%、进一步优选95% 100%、例如97% 100%、98% 100%、99% 100%或99. 5% 100%的序列同一性的序列的核酸或蛋白质成为靶。这里，序列同一性”是将2个序列在导入间隙或不导入间隙的情况下以形成最大的类似度的方式比对(对齐)时，相同氨基酸(或碱基)相对于氨基酸(或碱基)的总数的百分比(％)。CAPRIN-I蛋白质的片段具有从作为抗体识别的最小单位的表位(抗原决定簇)的氨基酸长度、至小于该蛋白质的全长的长度。表位是指在哺乳动物、优选人中具有抗原性或免疫原性的多肽片段，其最小单位包含约7 12个氨基酸、例如8 11个氨基酸。因此，本发明的抗体的特征在于，识别包含序列编号37所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80%以上、优选85%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上的序列同一性的氨基酸序列中的约7 12个氨基酸、例如8 11个氨基酸的片段。上述的含有人CAPRIN-I蛋白质和/或其部分肽的多肽可以按照例如Fmoc法(芴基甲基氧基羰基法)、tBoc法(叔丁基氧基羰基法)等的化学合成法进行合成(日本生化学会编、生化学实验讲座I、夕 > 々質Q化学(蛋白质的化学)I V、化学修飾m F'合成(化学修饰和肽合成)、东京化学同人(日本)、1981年)。另外，也可以利用各种市售的肽合成仪通过常规方法进行合成。另外，使用公知的基因工程学方法(SambiOok等，MolecularCloning,第2版，Current Protocols in Molecular Biology(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubel 等，Short Protocols in Molecular Biology,第 3 版，Acompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), JohnWiley & Sons等)，制备编码上述多肽的多核苷酸，将该多核苷酸整合到表达载体中并导入宿主细胞，在该宿主细胞中生产多肽，由此可以得到目的多肽。编码上述多肽的多核苷酸可以通过公知的基因工程学方法和/或使用了市售的核酸合成仪的常规方法来容易地制备。例如含有序列编号I的碱基序列的DNA可以通过使用人染色体DNA或cDNA文库作为模板、使用以可扩增序列编号I中记载的碱基序列的方式设计的一对引物进行PCR来制备。PCR的反应条件可以适当设定，可以列举例如，使用耐热性DNA聚合酶(例如Taq聚合酶、Pfu聚合酶等)和含有Mg2 +的PCR缓冲液，将包含在94°C保持30秒(变性)、在55°C保持30秒 I分钟(退火)、在72°C保持2分钟(延伸)的反应过程作为I个循环，例如进行30个循环后，在72°C反应7分钟的条件等，但不限定于此。对于PCR 的方法、条件等,例如记载于 Ausubel 等,Short Protocols in Molecular Biology,第3 版,Acompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995),John Wiley & Sons (特别是第 15 章)中。另外，基于本说明书中的序列表的序列编号I 30所示的碱基序列和氨基酸序列的信息，制备合适的探针和/或引物，使用该探针和/或引物来对人等的cDNA文库进行筛选，由此可以分离所需的DNA。cDNA文库优选由表达序列编号2 30中偶数的序列编号的蛋白质的细胞、器官或组织来制备。这样的细胞或组织的例子是源于精巢、白血病、乳癌、淋巴瘤、脑瘤、肺癌、大肠癌等的癌或肿瘤的细胞或组织。上述探针或引物的制备、cDNA文库的构建、cDNA文库的筛选、以及目的基因的克隆等的操作对于本领域技术人员而言是已知的，可以按照例如Sambrook等，Molecular Cloning,第2版，Current Protocols in MolecularBiology (1989)、Ausbel等(上述)等中记载的方法来进行。由这样所得的DNA,可以得到编码人CAPRIN-I蛋白质或其部分肽的DNA。作为上述宿主细胞，只要是可表达上述多肽的细胞，就可以是任意的细胞，作为原核细胞的例子可以列举大肠杆菌等，作为真核细胞的例子可以列举猴肾脏细胞C0S1、中国仓鼠卵巢细胞CHO等哺乳动物细胞、人胎儿肾脏细胞株HEK293、小鼠胚胎皮肤细胞株NIH3T3、芽殖酵母、裂殖酵母等的酵母细胞、蚕细胞、爪蟾卵细胞等，但不限于此。当使用原核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，使用具有能在原核细胞中复制的起点、启动子、核糖体结合部位、多克隆位点、终止子、抗药性基因、营养缺陷型互补基因等的表达载体。作为大肠杆菌用表达载体，可以例示pUC系、pBluescriptII、pET表达系统、PGEX表达系统等。如果将编码上述多肽的DNA整合到这样的表达载体中，用该载体转化原核宿主细胞后，培养所得的转化体，则可以在原核宿主细胞中表达由上述DNA编码的多肽。此时，也可以使该多肽作为与其他蛋白质的融合蛋白质来表达。当使用真核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，使用具有启动子、剪接区、多聚(A)添加部位等的真核细胞用表达载体。作为这种表达载体，可以例示pKAl、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV 载体、pRS、pcDNA3、pYES2 等。与上述同样地，如果将
编码上述多肽的DNA整合到这样的表达载体中，用该载体转化真核宿主细胞后，培养所得的转化体，则可以在真核宿主细胞中表达由上述DNA编码的多肽。当使用pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl等作为表达载体时，可以作为附加了 His标签(例如(His)6 (His)ltl)、FLAG标签、myc标签、HA标签、GFP等各种标签的融合蛋白质，而表达上述多肽。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。为了从宿主细胞中分离纯化目的多肽，可以将公知的分离操作组合来进行。可以列举例如，利用了脲等的变性剂和/或表面活性剂的处理、超声波处理、酶消化、盐析或溶剂分别沉淀法、透析、离心分离、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等电点电泳、离子交换色谱法、疏水色谱法、亲和色谱法、反相色谱法等，但不限于此。<抗体的结构>抗体通常是至少含有2条重链和2条轻链的杂多聚体糖蛋白质。IgM是不同的，其是由2条相同的轻(L)链和2条相同的重⑶链构成的约150kDa的杂四聚体糖蛋白质。典型地，各个轻链通过I个二硫键与重链连接，但各种免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键的数目有变化。各个重链和轻链还具有链内二硫键。各个重链在一端具有可变区(VH区)，几个恒定区与其连接。各个轻链具有可变区(VL区)，在其相反的端具有I个恒定区。轻链的恒定区与重链最初的恒定区对齐，且轻链可变区与重链的可变区对齐。抗体的可变区通过被称为互补性决定区(CDR)的特定区域表现特定的可变性，从而赋予抗体以结合特异性。可变区的相对保守的部分被称为框架区(FR)。完整的重链和轻链的可变区分别含有通过3个⑶R连接的4个FR。3个⑶R在重链中从其N末端依次被称为⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3，同样在轻链中被称为⑶RL1、⑶RL2、⑶RL3。在抗体对抗原的结合特异性中，⑶RH3最为重要。另外，各链的CDR通过FR区以接近的状态被保持在一起，与来自其他链的CDR —同有助于抗体的抗原结合部位的形成。恒定区不直接有助于抗体与抗原结合，但表现各种效应器功能，例如、对抗体依赖性细胞性细胞毒活性(ADCC)的参与、介由对Fe Y受体的结合而产生的吞曬作用、介由新生儿Fe受体(FcRn)的半衰期/清除速度、介由补体级联的Clq构成要素的补体依赖性细胞毒(CDC)。<抗体的制备>
本发明的抗CAPRIN-I抗体是指与CAPRIN-I蛋白质的全长或其片段具有免疫反应性的抗体。这里，“免疫反应性”是指在生物体内抗体与CAPRIN-I抗原结合的特性，介由这种结合可以发挥损伤(例如、杀死、抑制或缩小)肿瘤的功能。即，本发明中使用的抗体只要能够与CAPRIN-I蛋白质结合而损伤肿瘤、例如白血病、淋巴瘤、乳癌、脑瘤、肺癌、食道癌、胃癌、肾癌、大肠癌、卵巢癌、前列腺癌、纤维肉瘤等，则不问其种类。抗体的例子包含单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、抗体片段(例如Fab、F(ab’)2)等。另外，抗体是免疫球蛋白分子的任意类、例如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD和IgY,或任意亚类、例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2 等。抗体进而除了糖基化以外，也可以通过乙酰化、甲酰化、酰胺化、磷酸化、或聚乙二醇(PEG)化等被修饰。 以下显示各种抗体的制备例。抗体为单克隆抗体时，例如将表达CAPRIN-I的乳癌细胞株SK-BR-3等施与小鼠而进行免疫，从该小鼠取出脾脏，将细胞分离，然后使该细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，从所得的融合细胞(杂交瘤)中选择产生具有癌细胞增殖抑制作用的抗体的克隆。将产生具有癌细胞增殖抑制作用的单克隆抗体的杂交瘤分离，培养该杂交瘤，利用普通的亲和纯化法从培养上清中纯化抗体，由此可进行制备。产生单克隆抗体的杂交瘤例如也可以如下地制备。首先，按照公知的方法，用致敏抗原对动物进行免疫。作为一般的方法，可以通过将致敏抗原向哺乳动物的腹腔内或皮下注射来进行。具体来说，可以将致敏抗原利用PBS(磷酸盐缓冲液，Phosphate-BufferedSaline)、生理盐水等稀释成合适量、进行悬浮，在所得的的液体中根据需要适量混合通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂，乳化后，每4 21天对哺乳动物施与数次。另外，致敏抗原免疫时也可以使用合适的载体。这样将哺乳动物免疫，确认在血清中所需的抗体水平升高，然后从哺乳动物收集免疫细胞，进行细胞融合，作为优选的免疫细胞特别可以列举脾细胞。作为与上述免疫细胞融合的其它母细胞，使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。该骨髓瘤细胞可以优选使用公知的各种细胞株、例如P3U1 (P3-X63Ag8Ul)、P3 (P3x63Ag8. 653)(J. Tmmunol. (1979) 123,1548-1550)>P3x63Ag8U. I(Current Topics in Microbiology andImmunology (1978)81，1-7)、NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Tmmunol. (1976)6，511-519)、MPC-Il(Margulies. D. H. et al.，Cell (1976)8,405-415)、SP2/0 (Shulman,M. et al. , Nature (1978) 276, 269-270)、FO (deSt. Groth, S. F. et al. , J. Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148,313-323)、R210(Galfre, G. et al.，Nature (1979) 277，131-133)等。上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可以按照公知的方法、例如Kohler和 Milstein 等的方法(Kohler, G. and Milstein, C. Methods EnzymoI. (1981)73,3-46)等来进行。更具体地，上述细胞融合例如可在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施。作为融合促进剂，可以使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，进而根据需要为了提高融合效率，还可以添加使用二甲基亚砜等的助剂。免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意地设定。例如优选使免疫细胞相对于骨髓瘤细胞为I 10倍。作为上述细胞融合中使用的培养液，可以使用例如，对于上述骨髓瘤细胞株的增殖合适的RPMI1640培养液、MEM培养液，其他可以在这种细胞培养中使用的通常的培养液，进一步也可以合并使用胎牛血清(FCS)等的血清补液。细胞融合是将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，将预先加热至37°C左右的PEG溶液(例如平均分子量1000 6000左右)以通常30 60%(w/v)的浓度添加、混合，由此形成作为目的的杂交瘤。接着，反复进行逐渐添加合适的培养液、离心除去上清的操作，由此除去对于杂交瘤的发育不优选的细胞融合剂等。这样得到的杂交瘤可以通过在通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养液)中培养来选择。上述HAT培养液中的培养持续对于除了作为目的的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)灭绝充分的时间(通常数天 数·周)。然后，实施通常的有限稀释法，进行产生目的抗体的杂交瘤的筛选和单克隆化。另外，除了对人以外的动物免疫抗原来得到上述杂交瘤以外，还可以将人淋巴细胞、例如感染了 EB病毒的人淋巴细胞在体外(in vitro)用蛋白质、蛋白质表达细胞或其溶解物致敏，使致敏淋巴细胞与来自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞、例如U266 (注册编号TIB196)融合，得到产生具有所需活性(例如、细胞增殖抑制活性)的人抗体的杂交瘤。这样制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养，另外，可在液氣中长期保存。S卩，使用所需抗原或表达所需抗原的细胞作为致敏抗原，按照通常的免疫方法进行免疫，将所得的免疫细胞利用通常的细胞融合法与公知的母细胞融合，利用通常的筛选法通过对单克隆抗体产生细胞(杂交瘤)进行筛选来制备。本发明中可使用的抗体的其它例子是多克隆抗体。多克隆抗体可以例如如下地得到。用天然的CAPRIN-I蛋白质、或作为与GST等的融合蛋白质而在大肠杆菌等微生物中表达的重组CAPRIN-I蛋白质、或其部分肽对小鼠、产生人抗体的小鼠、兔等小动物进行免疫,得到血清。通过将该血清利用例如硫酸铵沉淀、蛋白质A、蛋白质G柱、DEAE离子交换色谱、偶联有CAPRIN-I蛋白质或合成肽的亲和柱等进行纯化来制备。这里，作为产生人抗体的小鼠，已知例如KM小鼠(3MJ > 7 7 — /Medarex)和Xeno小鼠(Amgen)(例如国际公开第W002/43478号、国际公开第W002/092812号等)。将这种小鼠用CAPRIN-I蛋白质或其片段进行免疫时，可以由血液得到完全人多克隆抗体。另夕卜，可以从免疫后的小鼠中取出脾脏细胞，利用与骨髓瘤细胞的融合法制备人型单克隆抗体。抗原的调制可以根据使用了动物细胞的方法(日本特表2007-530068)或使用了杆状病毒的方法(例如国际公开第W098/46777号等)等来进行。当抗原的免疫原性低时，使其与白蛋白等具有免疫原性的巨大分子结合而进行免疫即可。此外，可以使用基因重组型抗体，该基因重组型抗体通过将抗体基因由杂交瘤克隆，整合到合适的载体中，并将其导入宿主，使用基因重组技术而产生(参照例如Carl，A. K. Borrebaeck, James,ff. Larrick,THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES,Published inthe United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990)。具体来说，由杂交瘤的 mRNA使用逆转录酶来合成抗体的可变区(V区)的cDNA。如果可得到编码目的抗体的V区的DNA，则将其与编码所需的抗体恒定区(C区)的DNA连接，将连接产物整合到表达载体中。或者也可以将编码抗体的V区的DNA整合到含有抗体C区的DNA的表达载体中。该DNA以在表达控制区域、例如增强子、启动子的控制下表达的方式整合到表达载体中。接着可以用该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。本发明的抗CAPRIN-I抗体优选是单克隆抗体。但也可以是多克隆抗体、转基因抗体(嵌合抗体、人源化抗体等)等。单克隆抗体包含人单克隆抗体、非人的动物单克隆抗体(例如小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、鸡单克隆抗体等)、嵌合型单克隆抗体等。单克隆抗体可以通过培养杂交瘤来制备，所述杂交瘤通过将来自用CAPRIN-I蛋白质免疫的非人哺乳动物(例如小鼠、产生人抗体的小鼠、鸡、兔等)的脾细胞与骨髓瘤细胞的融合来得到。嵌合 型抗体是将来自不同动物的序列组合而制备的抗体，例如是包含小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体等。嵌合抗体的制备可以使用公知的方法来进行，例如可以通过将编码抗体V区的DNA和编码人抗体C区的DNA连接，将其整合到表达载体中并导入宿主，而使其产生，从而得到。并且，在下述的实施例中，制备单克隆抗体，并确认了抗肿瘤效果，所述单克隆抗体与由序列编号2 30中偶数的序列编号表示的CAPRIN-I的部分多肽具有免疫反应性，所述CAPRIN-I的部分多肽具有序列编号37所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。这些单克隆抗体包含具有序列编号43或序列编号63的氨基酸序列的重链可变(VH)区、和具有序列编号47、序列编号51或序列编号67的氨基酸序列的轻链可变(VL)区，其中，在该VH区包含由序列编号40或序列编号60的氨基酸序列表示的CDRl、由序列编号41或序列编号61的氨基酸序列表示的CDR2和由序列编号42或序列编号62的氨基酸序列表示的CDR3，该VL区域包含由序列编号44、序列编号48或序列编号64的氨基酸序列表示的CDRl、由序列编号45、序列编号49或序列编号65的氨基酸序列表示的CDR2和由序列编号46、序列编号50或序列编号66的氨基酸序列表示的CDR3。多克隆抗体包含对产生人抗体的动物(例如小鼠)免疫CAPRIN-I蛋白质而得到的抗体。人源化抗体是也称为重构(reshaped)人抗体的改变抗体。人源化抗体通过将来自免疫动物的抗体的CDR移植到人抗体的互补性决定区中来构建。其一般的基因重组方法也是已知的。具体来说，利用PCR法由以末端部具有重叠部分的方式制备的数个寡核苷酸合成DNA序列，该DNA序列是以将小鼠抗体或鸡抗体的CDR和人抗体的框架区(frameworkregion ；FR)连接的方式设计的。将所得的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接,接着整合到表达载体中，将其导入宿主而使其产生，从而得到(参照欧洲专利申请公开第EP239400号、国际公开第W096/02576号)。经由⑶R连接的人抗体的FR可以选择形成互补性决定区良好的抗原结合部位的FR。根据需要，也可以替换抗体的可变区中的框架区的氨基酸，以使重构人抗体的互补性决定区形成合适的抗原结合部位(Sato K. et al. , Cancer Research1993,53 :851-856) 0另外，也可以替换为各种来自人抗体的框架区(参考国际公开第W099/51743 号)。经由CDR连接的人抗体的框架区可以选择形成互补性决定区良好的抗原结合部位的框架区。根据需要，也可以替换抗体的可变区中的框架区的氨基酸，以使重构人抗体的互补性决定区形成合适的抗原结合部位(Sato K. et al. , Cancer Research 1993, 53 851-856)。在制备嵌合抗体或人源化抗体后，可以将可变区(例如FR)和/或恒定区中的氨
基酸用其它氨基酸替换等。氨基酸的替换例如是小于15个、小于10个、8个以下、7个以下、6个以下、5个以下、4个以下、3个以下、或2个以下的氨基酸、优选I 5个氨基酸、更优选I或2个氨基酸 的替换，替换抗体与未替换抗体应在功能上等同。期望替换是保守的氨基酸替换，这是电荷、侧链、极性、芳香族性等性质类似的氨基酸间的替换。性质类似的氨基酸例如可以分类为碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、无极性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸)、支链氨基酸(苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸)等。作为抗体修饰物，可以列举例如与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。在本发明的抗体修饰物中，不限定结合的物质。为了得到这样的抗体修饰物，可以通过对所得的抗体实施化学修饰来得到。这些方法在本领域已经被确立。这里，“在功能上等同”是指成为对象的抗体与本发明的抗体具有同样的生物学或生物化学的活性，具体来说，是指具有损伤肿瘤的功能、以及在对人应用时本质上不发生排斥反应等。作为这样的活性，可以列举例如细胞增殖抑制活性、或结合活性。作为用于调制与某多肽在功能上等同的多肽的本领域技术人员熟知的方法，已知有在多肽中导入突变的方法。例如只要是本领域技术人员，就可以使用定点诱变法(Hashimoto-Gotoh, T. et al. , (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ. , and Smith,Μ. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. , (1984) Nucleic AcidsRes.12,9441-9456、Kramer, W. and Fritz, HJ. , (1987)Methods Enzymol. 154,350-367、KunkeI, TA.，(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82,488-492、Kunkel (1988)MethodsEnzymol. 85，2763-2766)等，在本发明的抗体中导入适当的突变，由此制备与该抗体在功能上等同的抗体。识别由上述抗CAPRIN-I抗体所识别的CAPRIN-I蛋白质的表位的抗体，可以利用本领域技术人员公知的方法得到。例如，可以通过下述方法等来得到通过通常的方法(例如表位作图(epitope mapping)等)确定由抗CAPRIN-I抗体识别的CAPRIN-I蛋白质的表位，以具有该表位中所含的氨基酸序列的多肽为免疫原来制作抗体的方法；通过通常的方法确定制作的抗体的表位，选择表位与抗CAPRIN-I抗体相同的抗体的方法等。这里，“表位”是指在哺乳动物、优选人中具有抗原性或免疫原性的多肽片段，其最小单位包含约7 12个氨基酸、优选8 11个氨基酸。本发明的抗体的亲和常数KaGv/kJ优选至少为IO7M'至少为IO8M'至少为5 X IO8M'至少为IO9M'至少为5 X IO9M'至少为IOiqM'至少为5 X IOiqM'至少为IO11M'--Ji / ! \i _—- I \l---Il I. I Ic---f . lu. --C I I I Il I---. j X ,—r/ V . . V ■ ,----I I--!hi--------I/ .
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13地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇、二溴卫矛醇(mitolactol)、哌 泊溴烧(pipobroman)、gacytosine、多西他赛、瘤可宁、吉西他滨(gemcitabine)、6_硫鸟嘌 呤、巯嘌呤、顺钼、奥沙利钼、卡波钼、长春碱、足叶乙甙、异环磷酰胺、米托葸醌、长春新碱、 长春瑞滨、诺消灵(novantrone)、替尼泊苷、依达曲沙(edatrexate)、道诺霉素、氨蝶呤、希 罗达(xeloda)、伊班膦酸盐(ibandronate)、伊立替康、拓扑异构酶抑制剂、二氟甲基鸟氨 酸(DMF0)、视黄酸、卡培他滨(capecitabine)、以及它们的药学上可接受的盐或衍生物。另外，通过将本发明的抗体、和抗肿瘤剂合并使用施与，可以得到更高的治疗效 果。本方法对CAPRIN-1表达的癌患者，在外科的手术前后的任一者都可以适用。特别在手 术后，对目前用抗肿瘤剂单独处理的CAPRIN-1表达的癌症，可以得到更好的癌复发防止和 /或生存时间的延长。作为可与本发明的抗体合并使用施与的抗肿瘤剂的例子，包含文献等中公 知的下述抗肿瘤剂，即，紫杉醇、多柔比星、柔红霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧 唆、噻替哌、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、benzodopa、卡波醌、meturedopa、uredopa、 六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺 (triethilenethiophosphoramide)、三轻甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)、布拉 他辛、布拉他辛酮、喜树碱、苔藓虫素、海绵多聚乙酰(callystatin)、cryptophycinl、 cryptophycin8> 海兔毒素(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、艾槽塞洛 素(eleutherobin)、水鬼蕉喊(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、 spongistatin、苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酉先胺(cholophosphamide)、 雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆 留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲憐胺(trofosfamide)、乌拉莫 司汀、卡莫司汀、氯乙链脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、 尼莫司汀、雷莫司汀、卡奇霉素(calicheamicin)、达内霉素(dynemicin)、氯屈膦酸、埃 斯培拉霉素(esperamicin)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨 酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素 (carzinophilin)、色霉素、更生霉素、detorbicin、6_重氮基_5_氧代-L-正亮氨酸、阿霉 素(adriamycin)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉 素 C、霉酌 酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、 培洛霉素、甲基丝裂霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比 星(rodorubicin)、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司、净司他丁 (zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)、三 甲曲沙(trimetrexate)、氟达拉滨(fludarabine)、6_巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他 滨、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮杂尿苷(azauridine)、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、 去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、卡普睾酮(calusterone)、 屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烧、睾内酮(testolactone)、氨鲁米特、米托坦、曲洛 司坦、亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醒内酯、醒磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿卩密唳 (eniluracil)、安 口丫 P定(amsacrine)、阿莫司汀(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、 依达曲沙(edatraxate)、defofamine、秋水仙胺(demecolcine)、地卩丫醌(diaziquone)、 依氟鸟氨酸(elfornithine)、依利醋铵(elliptinium)、埃博霉素(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、香苑多糖、氯尼达明(Ionidamine)、美登素(maytansine)、安丝菌素(ansamitocine)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌、mopidanmol、二胺硝[!丫 P定nitraerine、喷司他丁、蛋氨氮芥(phenamet)、卩比柔比星、洛索蒽酉昆(Iosoxantrone)、足叶草酸(podophyllinic acid)、2_乙基酰肼、甲节肼、雷佐生(razoxane)、根瘤菌素(rhizoxin)、西佐喃、错螺胺(spirogermanium)、细交链抱菌酮酸(tenuazonicacid)、三乙撑亚胺苯醌(triaziquone)、杆孢菌素(ror idine)A、蛇形菌素(anguidine)、聚氨酯、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇、二溴卫矛醇(mitolactol)、哌泊溴烧(pipobroman)、gacytosine、多西他赛、瘤可宁、吉西他滨(gemcitabine)、6_硫鸟嘌呤、巯嘌呤、顺钼、奥沙利钼、卡波钼、长春碱、足叶乙甙、异环磷酰胺、米托葸醌、长春新碱、长春瑞滨、诺消灵(novantrone)、替尼泊苷、依达曲沙(edatrexate)、道诺霉素、氨蝶呤、希罗达(xeloda)、伊班膦酸盐(ibandronate)、伊立替康、拓扑异构酶抑制剂、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、视黄酸、卡培他滨(capecitabine)、以及它们的药学上可接受的(公知的)盐或(公知的)衍生物。上述中，特别优选使用环磷酰胺、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨。或者，在本发明的抗体中，也可以结合文献等中公知的211At、mI、125I、9°Y、186Re、188Re、153SM、212Bi、32P、175Lu、176Lu等放射性同位素。放射性同位素期望是可有效地用于治疗或诊断肿瘤的同位素。本发明的抗体是与CAPRIN-I具有免疫反应性的抗体、特异性地识别CAPRIN-I的抗体、或者与CAPRIN-I特异性地结合的抗体，并且是显示对癌的细胞毒活性、或肿瘤增殖抑制作用的抗体。该抗体应该是具有在施与该抗体的对象动物中能够几乎避免或完全避免产生排斥反应的结构的抗体。作为这样的抗体，例如在对象动物为人时，可以列举人抗体、人源化抗体、嵌合抗体(例如人-小鼠嵌合抗体)、单链抗体、双特异性抗体等。这些抗体是重链和轻链的可变区源于人抗体的抗体；或重链和轻链的可变区包含源于非人的动物抗体的互补性决定区(CDR1、CDR2和CDR3)、和源于人抗体的框架区的抗体；或重链和轻链的可变区源于非人的动物抗体、且重链和轻链的恒定区源于人抗体的重组型抗体。优选的抗体是前2种抗体。这些重组型抗体可以如下制备。由杂交瘤等产生抗体的细胞克隆编码针对人CAPRIN-I的单克隆抗体(例如人单克隆抗体、小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、鸡单克隆抗体等)的DNA，将其作为模板利用RT-PCR法等来制备编码该抗体的轻链可变区和重链可变区的DNA,基于Kabat EU numbering system(Kabat等、Sequencesof Proteins of Immunological Interest,5thEd. Public Health Service, NationalInstitute of Health, Bethesda, Md. (1991))来确定轻链和重链的各可变区的序列或各CDR1、CDR2、CDR3 的序列。进一步地，使用基因重组技术(Sambrook等，Molecular Cloning A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))或 DNA 合成仪来制备编码这些各可变区的DNA或编码各CDR的DNA。其中，上述产生人单克隆抗体的杂交瘤可以通过在对产生人抗体的动物(例如小鼠)免疫人CAPRIN-I后，使从该免疫动物切除的脾细胞与骨髓瘤细胞融合来制备。与此分别地，根据需要使用基因重组技术或DNA合成仪来制备编码源于人抗体的轻链或重链的可变区和恒定区的DNA。对于人源化抗体的情况，制备将编码源于人抗体的轻链或重链的可变区的DNA中的CDR编码序列替换成与它们对应的源于人以外的动物(例如小鼠、大鼠、鸡等)的抗体的CDR编码序列而得的DNA，将由此得到的DNA分别与编码源于人抗体的轻链或重链的恒定区的DNA连接，由此可以制备编码人源化抗体的DNA。对于嵌合抗体的情况，通过将编码源于人以外的动物(例如小鼠、大鼠、鸡等)的抗体的轻链或重链的可变区的DNA，分别与编码源于人抗体的轻链或重链的恒定区的DNA连接，可以制备编码嵌合抗体的DNA。对于单链抗体的情况，该抗体是将重链可变区和轻链可变区通过接头(linker)以直线状连接而成的抗体，通过将编码重链可变区的DNA、编码接头的DNA、和编码轻链可变区的DNA结合，可以制备编码单链抗体的DNA。其中，重链可变区和轻链可变区都源于人抗体，或者源于仅CDR被源于人以外的动物(例如小鼠、大鼠、鸡等)的抗体的CDR替换而得的人抗体。另外，接头包含12 19个氨基酸，可以列举例如15个氨基 酸的(G4S) 3(G.-B.Kim 等，Protein Engineering Design and Selection 2007,20(9) :425-432)。对于双特异性抗体(diabody)的情况,该抗体是可与2个不同的表位特异性地结合的抗体，例如可以通过将编码重链可变区A的DNA、编码轻链可变区B的DNA、编码重链可变区B的DNA、和编码轻链可变区A的DNA以该顺序进行结合(其中编码轻链可变区B的DNA与编码重链可变区B的DNA可通过编码如上所述的接头的DNA来结合)，来制备编码双特异性抗体的DNA。其中，重链可变区和轻链可变区都源于人抗体，或者源于仅CDR被源于人以外的动物(例如小鼠、大鼠、鸡等)的抗体的CDR替换而得的人抗体。将如上所述制备的重组DNA整合到I个或多个合适的载体中，将其导入宿主细胞(例如哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞等)，进行(共)表达，由此可以制备重组型抗体(P. J. Delves.，ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.，1997WILEY、P. Shepherdand C. Dean.，Monoclonal Antibodies.，20000XF0RD UNIVERSITY PRESS ；J. ff. Goding.,Monoclonal Antibodies !principles and practice. ,1993ACADEMIC PRESS)。由上述方法制备的本发明的抗体可以列举例如以下(a)、(b)或(C)的抗体。(a)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含序列编号40、41和42，所述轻链可变区包含序列编号44、45和46 (例如由序列编号43的重链可变区和序列编号47的轻链可变区构成的抗体)。(b)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含序列编号40、41和42，所述轻链可变区包含序列编号48、49和50 (例如由序列编号43的重链可变区和序列编号51的轻链可变区构成的抗体)。(c)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含序列编号60、61和62,所述轻链可变区包含序列编号64、65和66 (例如由序列编号63的重链可变区和序列编号67的轻链可变区构成的抗体)。其中，序列编号40、41和42，序列编号60、61和63所示的氨基酸序列是小鼠抗体重链可变区的⑶R1XDR2和⑶R3，另外，序列编号44、45和46，序列编号48、49和50，序列编号64、65和66所示的氨基酸序列分别是小鼠抗体轻链可变区的⑶R1、⑶R2和⑶R3。另外，本发明的人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或双特异性抗体例如是以下的抗体(用抗体(a)例示)。(i)重链的可变区包含序列编号40、41和42的氨基酸序列和源于人抗体的框架区的氨基酸序列，且轻链的可变区包含序列编号44、45和46的氨基酸序列和源于人抗体的框架区的氨基酸序列的抗体(优选为重链可变区中包含序列编号43的氨基酸序列、且轻链可变区中包含序列编号47的氨基酸序列的抗体)。(ii)重链的可变区包含序列编号40、41和42的氨基酸序列和源于人抗体的框架区的氨基酸序列，且 重链的恒定区包含源于人抗体的氨基酸序列，以及轻链的可变区包含序列编号44、45和46的氨基酸序列和源于人抗体的框架区的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含源于人抗体的氨基酸序列的抗体(优选为重链的可变区包含序列编号43的氨基酸序列，且重链的恒定区包含源于人抗体的氨基酸序列，以及轻链的可变区包含序列编号47的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含源于人抗体的氨基酸序列的抗体)。并且，人抗体重链和轻链的恒定区和可变区的序列例如可以由NCBI (美国GenBank, UniGene等)获得，例如对于人IgGl重链恒定区，可以参照注册编号J00228的序列，对于人IgG2重链恒定区，可以参照注册编号为J00230的序列，对于人IgG3重链恒定区，可以参照注册编号为X03604的序列，对于人IgG4重链恒定区，可以参照注册编号为K01316的序列，对于人轻链K恒定区，可以参照注册编号为V00557、X64135、X64133等的序列，对于人轻链λ恒定区，可以参照注册编号为Χ64132、Χ64134等的序列。上述抗体优选具有细胞毒活性，由此可以发挥抗肿瘤效果。另外，可以明确上述抗体中的重链和轻链的可变区、CDR的特定序列仅仅是用于例示，并不限于特定的序列。制备可产生针对人CAPRIN-I的其它人抗体或非人的动物抗体(例如小鼠抗体)的杂交瘤，回收由杂交瘤产生的单克隆抗体，以与人CAPRIN-I的免疫结合性和细胞毒活性作为指标，来判定是否为目的抗体。由此识别目的的产生单克隆抗体的杂交瘤后，如上所述，由该杂交瘤制备编码目的抗体的重链和轻链的可变区的DNA，进行序列确定，将该DNA用于其他抗体的制备。进一步地，本发明的上述抗体只要具有特异性地识别CAPRIN-I这样的特异性，则上述(a) (C)的各抗体的特别是框架区的序列和/或恒定区的序列中可以有I个或数个氨基酸的替换、缺失或添加。其中，数个是指优选2 5个、更优选2个或3个。本发明进一步还提供编码本发明的上述抗体的DNA、编码上述抗体的重链或轻链的DNA、或编码上述抗体的重链或轻链的可变区的DNA。例如在抗体(a)的情况下，这样的DNA包含包含编码序列编号40、41和42的氨基酸序列的碱基序列的、编码重链可变区的DNA，包含编码序列编号44、45和46的氨基酸序列的碱基序列的、编码轻链可变区的DNA
坐寸ο由这些序列的DNA编码的互补决定区(CDR)是决定抗体的特异性的区域，因此编码抗体的这以外的区域(即，恒定区和框架区)的序列可以是源于其它抗体的序列。这里，其它抗体也包含源于人以外的生物的抗体，但从降低副作用的观点出发，优选源于人的抗体。即，在上述DNA中，编码重链和轻链的各框架区和各恒定区的区域优选包含编码源于人抗体的对应氨基酸序列的碱基序列。进一步地，作为编码本发明的抗体的DNA的其它例子，例如对于抗体(a)的情况，有包含编码序列编号43的氨基酸序列的碱基序列的编码重链可变区的DNA、编码轻链可变区的区域含有编码序列编号47的氨基酸序列的碱基序列的DNA等。这里，编码序列编号43的氨基酸序列的碱基序列的例子是序列编号52的碱基序列。另外，编码序列编号47的氨基酸序列的碱基序列的例子是序列编号53的碱基序列。在这些DNA中，编码重链和轻链的各恒定区的区域优选包含编码源于人抗体的对应氨基酸序列的碱基序列。这些抗体的DNA例如可以用上述的方法或以下的方法得到。首先，由与本发明的抗体相关的杂交瘤，使用市售的RNA提取试剂盒制备总RNA，使用随机引物等通过逆转录酶合成cDNA。接着通过使用在已知的小鼠抗体重链基因和轻链基因的各可变区中分别保守的序列的寡核苷酸作为引物的PCR法，扩增编码抗体的cDNA。对于编码恒定区的序列，可以通过利用PCR法扩增已知的序列来得到。DNA的碱基序列可以整合到序列确定用质粒或噬菌体中等通过常规方法来确定。认为本发明中使用的抗CAPRIN-I抗体对表达CAPRIN-I的癌细胞的抗肿瘤效果，是由以下的机制引起的。表达CAPRIN-I的细胞的效应器细胞抗体依赖的细胞毒性(ADCC)、和表达CAPRIN-I的细胞的补体依赖的细胞毒性(⑶C)。因此，本发明中使用的抗CAPRIN-I抗体的活性评价，如以下实施例中具体所示的那样，可以通过在生物体外对表达CAPRIN-I的癌细胞测定上述ADCC活性或⑶C活性来进行评价。认为本发明中使用的抗CAPRIN-I抗体，与癌细胞上的CAPRIN-I蛋白质结合，通过上述活性而表现抗肿瘤作用，因此在癌的治疗或预防中是有用的。即，本发明提供以抗CAPRIN-I抗体为有效成分的、用于癌的治疗和/或预防的药物组合物。在以将抗CAPRIN-I抗体施与人体的目的(抗体治疗)使用时，为了使免疫原性降低，优选为人抗体和/或人源化抗体。并且，抗CAPRIN-I抗体与癌细胞表面上的CAPRIN-I蛋白质的结合亲和性越高，越可得到由抗CAPRIN-I抗体产生的更强的抗肿瘤活性。因此，如果可以获得与CAPRIN-I蛋白质具有高的结合亲和性的抗CAPRIN-I抗体，则可以期待更强的抗肿瘤效果，可以适合作为以癌的治疗和/或预防为目的的药物组合物。作为高的结合亲和性，如上所述，结合常数(亲和常数)Ka(IvzXff)优选至少为IO7M'至少为IO8M'至少为5X IO8M'至少为IO9M'至少为5X IO9M'至少为IO10M'至少为5X IO10M'至少为IO11M'至少为5X IO11M'至少为IO12M'或至少为IO13M'
<对表达抗原的细胞的结合>抗体与CAPRIN-I结合的能力可以利用如实施例中所述的使用了例如ELISA、蛋白质印迹法、免疫荧光和流式细胞仪分析等的结合分析来特定。<免疫组织化学染色>识别CAPRIN-I的抗体，可以利用本领域技术人员公知的方法中的免疫组织化学，使用由外科手术期间从患者得到的组织、或从担载了接种有自然地或在转染后表达CAPRIN-I的细胞系的异种移植组织的动物得到的组织进行低聚甲醛或丙酮固定而得的冷冻切片或用低聚甲醛固定并进行石蜡包埋而得的组织切片，关于与CAPRIN-I的反应性进行试验。为了进行免疫组织化学染色，可以将对CAPRIN-I具有反应性的抗体用各种方法进行染色。例如通过与辣根过氧化物酶复合山羊抗小鼠抗体或山羊抗鸡抗体反应，能够可视化。
<药物组合物>本发明另外提供用于癌的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于，含有与由序列编号2 30中偶数的序列编号表示的CAPRIN-I的部分多肽具有免疫反应性的抗体或其片段作为有效成分，所述CAPRIN-I的部分多肽具有序列编号37所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。本发明的用于癌的治疗和/或预防的药物组合物的靶只要是表达CAPRIN-I基因的癌(细胞)即可，没有特别限定。本说明书中使用的“肿瘤(瘤)”和“癌”这样的术语是指恶性新生物，可以互换使用。作为在本发明中成为对象的癌，是表达编码具有序列编号2 30中偶数的序列编号的氨基酸序列的CAPRIN-I蛋白质的基因的癌，优选是乳癌、脑瘤、白血病、肺癌、淋巴瘤、 肥大细胞瘤、肾癌、宫颈癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大肠癌、卵巢癌、前列腺癌和纤维肉瘤。这些特定的癌中，包含例如乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合肿瘤、乳管内乳头状腺癌、肺腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞癌、作为神经上皮组织性肿瘤的神经胶质瘤、室管膜瘤、神经元肿瘤、胎儿型的神经外胚层肿瘤、神经鞘瘤、纤维神经瘤、脑脊膜瘤、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、消化道淋巴瘤、消化器官淋巴瘤、小 中细胞型淋巴瘤、盲肠癌、升结肠癌、降结肠癌、横结肠癌、乙状结肠癌、直肠癌、卵巢上皮癌、胚细胞瘤、间质细胞瘤，但不限于此。另外，成为对象的优选的受试者是哺乳动物，是包含例如灵长类、宠物、家畜类、竞技用动物等的哺乳动物，特别优选是人、狗和猫。当将本发明中使用的抗体作为药物组合物使用时，可以利用本领域技术人员公知的方法进行制剂化。例如，可以以与水或水以外的药学上可接受的液体的无菌性溶液、或悬浮液剂的注射剂的形式非经口地使用。例如，认为可以与药理学上可接受的载体或介质、具体来说为灭菌水和/或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、媒介物(vehicle)、防腐剂、结合剂等适当组合，通过以一般被认为是制药实施所要求的单位用量方式混和来进行制剂化。这些制剂中的有效成分量是可得到指示范围的适合用量的量。用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水这样的媒介物按照通常的制剂实施来处方。作为注射用的水溶液，可以列举例如生理盐水、含有葡萄糖和/或其它辅助剂、例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠的等渗液，也可以与适当的溶解助剂、例如醇、具体为乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇、非离子性表面活性剂例如聚山梨醇酯80 (TM)、HC0-60合并使用。作为油性液可以列举芝麻油、大豆油，其可以与作为溶解助剂的苯甲酸苄酯、苄醇合并使用。另外，还可以与缓冲剂例如磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液、镇痛剂例如盐酸普鲁卡因、稳定剂例如苄醇、苯酚、抗氧化剂配合。制备的注射液通常填充到合适的安瓿中。施与为经口或非经口，优选非经口施与，具体来说，可以列举注射剂型、经鼻施与剂型、经肺施与剂型、经皮施与型等。作为注射剂型的例子，可以通过例如静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部性地施与。
另外，可以根据患者的年龄、体重、性别、症状等选择合适的施与方法。作为含有抗体或编码抗体的多核苷酸的药物组合物的施与量，可以例如在一次每Ikg体重为O. OOOlmg至IOOOmg的范围中选择。或者可以例如在每个患者O. 001 IOOOOOmg/个体的范围中选择施与量，但未必限于这些数值。施与量、施与方法根据患者的体重、年龄、性别、症状等不同而变化，只要是本领域技术人员就可以适当选择。通过将含有本发明的抗体或其片段的上述药物组合物施与受试者，可以治疗和/或预防癌、优选乳癌、脑瘤、白血病、肺癌、淋巴瘤、肥大细胞瘤、肾癌、宫颈癌、膀胱癌、食道癌、胃癌和大肠癌。进一步地，本发明还包含癌的治疗和/或预防方法，该方法包括以下步骤将本发明的药物组合物与上述例示的抗肿瘤剂或包含抗肿瘤剂的药物组合物组合，合并使用施与受试者。本发明的抗体或其片段与抗肿瘤剂可以同时施与受试者，或者分别施与受试者。分别施与时，任一药物组合物可以在先也可以在后，它们的施与间隔、施与量、施与途径和施 与次数可由专业医师适当选择。同时施与的其它药物剂型还包含例如将本发明的抗体或其片段与抗肿瘤剂在药理学上可接受的载体(或介质)中混合并进行制剂化而得的药物组合物。另外，对于含有抗肿瘤剂的上述药物组合物和剂型的任一者，可以适用对于含有本发明的抗体的药物组合物和剂型的处方、制剂化、施与途径、用量、癌等的说明。因此，本发明还提供用于癌的治疗和/或预防的组合药物，其包含本发明的药物组合物、和含有上面例示的抗肿瘤剂的药物组合物。另外，本发明还提供用于癌的治疗和/或预防的药物组合物，其在含有本发明的抗体或其片段、和抗肿瘤剂的同时，含有药理学上可接受的载体。< 多肽和 DNA >本发明进而还提供与上述抗体(a)、(b)或(C)相关的以下多肽和DNA。(i)包含序列编号43和序列编号63的氨基酸序列的多肽、和编码该多肽的含有序列编号52和序列编号68的碱基序列的DNA。(ii)包含序列编号47、序列编号51和序列编号67的氨基酸序列的多肽、和编码该多肽的含有序列编号70、序列编号53和序列编号69的碱基序列的DNA。(iii)选自序列编号40、41和42、序列编号60、61和62所示的氨基酸序列中的重链CDR多肽、和编码该多肽的DNA。(iv)选自序列编号44、45和46、序列编号48、49和50、序列编号64、65和66所不的氨基酸序列中的轻链CDR多肽、和编码该多肽的DNA。这些多肽和DNA如上所述，可以使用基因重组技术来制作。<本发明的要点>以下归纳上述说明的本发明。(I)用于癌的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于，含有与由序列编号2 30中偶数的序列编号表示的CAPRIN-I的部分多肽具有免疫反应性的抗体或其片段作为有效成分，所述CAPRIN-I的部分多肽具有序列编号37所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。(2)如上述(I)所述的药物组合物，其中，上述癌是乳癌、脑瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、肥大细胞瘤、肾癌、宫颈癌、膀胱癌、食道癌、胃癌或大肠癌。
(3)如上述(I)或⑵所述的药物组合物，其中，上述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。(4)如上述(I) (3)中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗体为人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或双特异性抗体。(5)抗体，其与多肽具有免疫反应性，所述多肽具有序列编号37所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。(6)如上述(5)所述的抗体，其对表达CAPRIN-I蛋白质的癌细胞具有细胞毒活性。(7)抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，且与CAPRIN-I蛋白质具有免疫反应性，所述重链可变区包含序列编号40、41和42，所述轻链可变区包含序列编号44 、45和46。(8)抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，且与CAPRIN-I蛋白质具有免疫反应性，所述重链可变区包含序列编号40、41和42，所述轻链可变区包含序列编号48、49和50。(9)抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，且与CAPRIN-I蛋白质具有免疫反应性，所述重链可变区包含序列编号60、61和62,所述轻链可变区包含序列编号64、65和66。(10)如上述(5) (9)中任一项所述的抗体，其为人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或双特异性抗体。(11)用于癌的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于，含有上述(5) (10)中任一项所述的抗体或其片段作为有效成分。(12)如上述(11)所述的药物组合物，其中，上述癌为乳癌、脑瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、肥大细胞瘤、肾癌、宫颈癌、膀胱癌、食道癌、胃癌或大肠癌。(13)用于癌的治疗和/或预防的组合药物，其包含上述(I) (4)中任一项所述的药物组合物、或上述(11)或(12)所述的药物组合物；和含有抗肿瘤剂的药物组合物。(14)癌的治疗和/或预防方法，其包括以下步骤将上述(5) (10)中任一项所述的抗体或其片段、或上述(11)或(12)所述的药物组合物施与受试者。(15)癌的治疗和/或预防方法，其包括以下步骤对受试者合并使用上述(13)所述的组合药物的各药物组合物。实施例以下，基于实施例更为具体地说明本发明，但本发明的范围不限于这些具体例。实施例I利用SEREX法的新的癌抗原蛋白的鉴定(l)cDNA文库的制作通过酸胍-酹-氯仿方法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)从健常狗的精巢组织提取总RNA,并且使用01igotex-dT30mRNA纯化试剂盒(宝酒造社制)，按照试剂盒附带的说明书纯化多聚A RNA。使用如此获得的mRNA (5 μ g)合成狗精巢cDNA噬菌体文库。在cDNA噬菌体文库的制作中使用cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning试剂盒(STRATAGENE公司制)，按照试剂盒中附带说明书制作文库。制作的cDNA噬菌体文库的大小是7. 73X 105pfu/mlo(2)利用血清的cDNA文库的筛选使用上述制作的狗精巢cDNA噬菌体文库进行免疫筛选。具体地，感染宿主大肠杆菌(XLl-Blue MRF’)使得Φ90Χ 15mm的NZY琼脂糖平板上形成2210个克隆，在42°C培养3 4小时，形成溶菌斑(噬斑)，用渗透了 IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的硝酸纤维素膜(Hybond C Extra GE Healthcare Bio-Scinece 公司制)在 37°C覆盖该平板 4 小时，由此使蛋白质诱导、表达，在该膜上转印蛋白质。然后回收该膜，并浸入到含有O. 5%脱脂奶粉的TBSdOmM Tris-HCl，150mM NaCl pH值7. 5)中，在4°C振摇过夜，由此抑制非特异性反应。使该滤膜与稀释了 500倍的患病狗血清在室温下反应2 3小时。作为上述患病狗的血清，使用由患有乳癌的狗中收集的血清。这些血清在_80°C保存，在即将使用前进行前处理。血清的前处理方法利用以下的方法。即，使宿主大肠杆菌(XLl-Blure MRF’)感染没有插入外来基因的λ ZAP表达噬菌体后，在NZY平板培养基上于37°C培养过夜。接着在平板中加入含有O. 5M NaCl的O. 2M NaHCO3PH值8. 3的缓冲液，在4°C静置15小时后，将上清液作为大肠杆菌/噬菌体提取液回收。接着，使回收的大肠杆菌/噬菌体提取液流经NHS-柱(GE Healthcare Bio-Science公司制)，将源于大肠杆菌 噬菌体的蛋白质固定化。使患病狗的血清流经固定了该蛋白质的柱进行反应，将吸附在大肠杆菌和噬菌体上的抗体从血清中除去。将直接流过该柱的血清级分用含有O. 5%脱脂奶粉的TBS稀释500倍。将所得物用作免疫筛选材料。
将该处理血清和印迹了上述融合蛋白的膜用TBS-T (O. 05% Tween20/TBS)洗涤4次，然后与作为二抗的已经用含有O. 5%脱脂奶粉的TBS稀释5000倍的山羊抗狗IgG (Goatanti Dog IgG-h+I HRP conjugated BETHYL Laboratories 公司制)在室温反应 I 小时，通过使用了 NBT/BCIP反应液(Roche公司制)的酶显色反应来检测，从Φ90χ15πιπι的NZY琼脂糖平板上收集与显色反应阳性部位相对应的菌落，并将其溶解于500 μ I的SM缓冲液(IOOmM NaCl，IOmM MgClSO4, 50mM Tris-HCl，0. 01 % 明胶，pH值 7. 5)中。以与上述同样的方法重复二次、三次筛选，直至显色反应阳性菌落单一化，从而筛选30940个与血清中的IgG反应的噬菌体克隆，并分离了 5个阳性克隆。(3)分离的抗原基因的同源性检索为了对通过上述方法分离的5个阳性克隆进行碱基序列分析，进行将噬菌体载体转换成质粒载体的操作。具体地，将宿主大肠杆菌(XLl-Blue MRF’)调制成吸光度0D_为I. O的溶液，将该溶液200 μ I与250 μ I纯化的噬菌体溶液、以及I μ I ExAssist辅助噬菌体(STRATAGENE公司制)混合，随后在37°C反应15分钟，然后添加3ml LB培养基，在37°C培养2. 5 3小时，立即用70°C的水浴保温20分钟，进行4°C、1000Xg、15分钟的离心分离，收集上清液作为噬菌粒溶液。随后，将噬菌粒宿主大肠杆菌(SOLR)调制成吸光度0D_为I. O的溶液，将该溶液200 μ I与10 μ I纯化的噬菌体溶液混合，随后在37 V反应15分钟。将50 μ I接种于含有氨苄青霉素(终浓度50 μ g/ml)的LB琼脂培养基，并且在37°C培养过夜。收集转换的SOLR单菌落，在含有氨苄青霉素(终浓度50 μ g/ml)的LB培养基中在37°C培养后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit(QIAGEN)纯化具有目的插入物的质粒 DNA。使用序列编号31记载的T3引物和序列编号32记载的T7引物，通过引物步移法，对纯化的质粒进行插入物全长序列的分析。通过该序列分析，获得了序列编号5、7、9、11、13所记载的基因序列。使用该基因的碱基序列和氨基酸序列(序列编号6、8、10、12、14)来进行同源性检索程序BLAST检索(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/),从而进行与已知基因的同源性检索，结果判明获得的5个基因均是编码CAPRIN-I的基因。就被翻译为蛋白质的区域而言，这五个基因之间的序列同一性为100%的碱基序列同一性、99%的氨基酸序列同一性。就被翻译为蛋白质的区域而言，与编码该基因的人同源因子的基因的序列同一性为94%的碱基序列同一性、98%的氨基酸序列同一性。人同源因子的碱基序列示于序列编号1、3，氨基酸序列示于序列编号2、4。此外，就被翻译为蛋白质的区域而言，与编码所获得的狗基因的牛同源因子的基因的序列同一性为94%的碱基序列同一性、97%的氨基酸序列同一性。牛同源因子的碱基序列示于序列编号15，氨基酸序列显示于序列编号16。另外，就被翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源因子的基因与编码牛同源因子的基因之间的序列同一性为94%的碱基序列同一性、93% 97%的氨基酸序列同一性。此外，就被翻译为蛋白质的区域而言，与编码所获得的狗基因的马同源因子的基因的序列同一性为93%的碱基序列同一性、97%的氨基酸序列同一性。马同源因子的碱基序列示于序列编号17，氨基酸序列示于序列编号18。另外，就被翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源因子的基因与编码马同源因子的基因之间的序列同一性为93%的碱基序列同一性、96%的氨基酸序列同一性。此外，就被翻译为蛋白质的区域而言，与编码所获得的狗基因的小鼠同源因子的基因的序列同一性为87% 89%的喊基序列同一性、95% 97%的氣基酸序列同 一性。小鼠同源因子的碱基序列示于序列编号19、21、23、25、27，氨基酸序列示于序列编号20、22、24、26、28。另外，就被翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源因子的基因与编码小鼠同源因子的基因之间的序列同一性为89% 91%的碱基序列同一性、95% 96%的氨基酸序列同一性。此外，就被翻译为蛋白质的区域而言，与编码所获得的狗基因的鸡同源因子的基因的序列同一性为82%的碱基序列同一性、87%的氨基酸序列同一性。鸡同源因子的喊基序列不于序列编号29,氣基酸序列不于序列编号30。另外，就被翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源因子的基因与编码鸡同源因子的基因之间的序列同一性为81% 82%的核苷酸序列同一'I"生、86%的氨基酸序列同一'丨生。(4)各组织中的基因表达分析对由上述方法得到的基因，利用RT-PCR法研究狗和人的正常组织和各种细胞株中的表达。逆转录反应如下进行。S卩，使用TRIZOL试剂(invitrogen公司制)并按照附带的说明书从各组织50 IOOmg和各细胞株5 IOX IO6个细胞中提取总RNA。使用该总 RNA,利用 Superscript First-Strand Synthesis System for RT_PCR(invitrogen 公司制)按照附带的说明书合成cDNA。PCR反应使用取得的基因特异性引物(在序列编号33和34中记载)如下进行。即，以使通过逆转录反应制备的样品为0.25 μ 1，上述引物为各2 μ M，dNTP为各O. 2mM、ExTaq聚合酶(宝酒造社制)为O. 65U的方式添加各试剂和附带的缓冲液，调节至总量25 μ 1，使用Thermal Cycler (BIO RAD公司制)，将94°C -30秒、600C -30秒、72°C -30秒的循环重复30次。此外，上述基因特异性引物是扩增序列编号5的碱基序列(狗CAPRIN-I基因)中的第206 632位碱基的区域和序列编号I的碱基序列(人CAPRIN-I基因)中的第698 1124位碱基的区域的引物。为了进行比较对照，同时使用GAPDH特异性引物(在序列编号35和36中记载)。其结果如图I所示，在健常的狗组织中，在精巢中发现强的表达，另一方面在狗乳癌和腺癌组织中有表达。进一步地，还一并确认了所获得的基因的人同源因子的表达，结果与狗CAPRIN-I基因同样地，在正常组织中能够确认表达的仅为精巢，但在癌细胞的情况下，在乳癌、脑瘤、白血病、肺癌、食道癌细胞株等多种的癌细胞株中检测到表达，尤其在大量乳癌细胞株中确认了表达。由这些结果可确认，CAPRIN-I在除精巢之外的正常组织中观察不到表达，另一方面，在大量癌细胞中表达，尤其在乳癌细胞株中表达。此外，在图I中，纵轴的参照编号I表示上述鉴定的基因的表达图谱，参照编号2表示作为比较对照的GAPDH基因的表达图谱。(5)针对源于CAPRIN-I的肽的多克隆抗体的制作为了得到与CAPRIN-I结合的抗体，合成序列编号37所示的源于CAPRIN-I的肽。以该肽Img为抗原，与等容量的弗氏不完全佐剂(IFA)溶液混合，将其每2周4次在兔的皮下进行施与。然后采集血液，得到含有多克隆抗体的抗血清。进一步使用蛋白G载体(GE 7 > 7* /SM才寸4工> 7社制)将该抗血清纯化，得到针对源于CAPRIN-I的肽的多克隆抗体。另外，将没有施与抗原的兔的血清与上述同样地使用蛋白G载体进行纯化而得到抗体，将该得到的抗体作为对照抗体。
(6)癌细胞上的抗原蛋白的表达分析接着对于确认了较多表达CAPRIN-I基因的乳癌细胞株7种(MDA_MB_157，T47D，MRK-nu-1, MDA-MB-231V, BT20, SK-BR-3, DA-MB-231T)，研究在其细胞表面上是否表达CAPRIN-I蛋白质。在I. 5ml容量的微量离心管中分别离心分离在上述确认了基因表达的各人乳癌细胞株IO6细胞。向其中添加上述(5)中制备的针对源于CAPRIN-I的肽的多克隆抗体2μ8(5μ 1)，进一步用含有95 μ I的O. I %胎牛血清的PBS悬浮后，在冰上静置I小时。在用PBS洗涤后，用含有5μ I的FITC标记山羊抗大鼠IgG抗体(寸 > 夕^ >文社制)和95 μ I的O. I %胎牛血清(FBS)的PBS悬浮，在冰上静置I小时。在用PBS洗涤后，使用夕卜> y >株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。另一方面，使用上述(5)中制备的对照抗体代替针对源于CAPRIN-I的肽的多克隆抗体进行与上述同样的操作，制备阴性对照。作为其结果，添加了抗人CAPRIN-I抗体的细胞与对照相比，荧光强度均增强。具体地，MDA-MB-231V表现193%的荧光强度的增强，SK-BR-3表现169%的荧光强度的增强。由此可以确认，CAPRIN-I蛋白质在上述各种人癌细胞株的细胞膜表面上表达。并且，上述荧光强度的增强率利用各细胞的平均荧光强度(MFI值)的增加率表示，通过以下算式来算出。 平均荧光强度的增加率(荧光强度的增强率)(％ )=((与抗人CAPRIN-I抗体反应的细胞的MFI值)-(对照MFI值))+ (对照MFI值)X 100。另外，使用同样的上述方法，对于肾癌细胞株3种(Caki-1，Caki_2，A498)、卵巢癌细胞株(SK0V3)、肺癌细胞株(QG56)、前列腺癌细胞株(PC3)、宫颈癌细胞株(Hela)、纤维肉瘤细胞株(HT1080)、脑肿瘤细胞株2种(T98G，U87MG)、小鼠大肠癌细胞株2种(CT26，colon26)、小鼠乳癌细胞株I种(4T1)、小鼠嵌合细胞株I种(B16)、小鼠神经胶质瘤细胞株2种(N1E-115，Neuro2a)，分析CAPRIN-I的表达，结果确认了在任一细胞株中都有CAPRIN-I的表达。并且，本结果在使用实施例3中获得的具有序列编号43的重链可变区和序列编号47的轻链可变区的针对CAPRIN-I的单克隆抗体(单克隆抗体# I)、具有序列编号43的重链可变区和序列编号51的轻链可变区的针对CAPRIN-I的单克隆抗体(单克隆抗体# 2)或具有序列编号63的重链可变区和序列编号67的轻链可变区的针对CAPRIN-I的单克隆抗体(单克隆抗体# 3)时，也是同样的。(7)免疫组织化学染色
(7)-I小鼠和狗正常组织中的CAPRIN-I的表达将小鼠(Balb/c，雌性)和狗(比格犬，雌性)在乙醚麻醉下和氯胺酮/异氟烷麻醉下放血，开腹后，将各器官(胃、肝、眼球、胸腺、肌肉、骨髓、子宫、小肠、食道、心脏、肾、唾液腺、大肠、乳腺、脑、肺、皮肤、肾上腺、卵巢、胰腺、脾脏和膀胱)分别转移至加入有PBS的10-cm平皿中。在PBS中切开各器官，用含有4%低聚甲醛(PFA)的O. IM磷酸盐缓冲液(pH值7. 4)回流固定过夜。弃去回流液，用PBS漂洗各器官的组织表面，将含有10%蔗糖的PBS溶液添加入50ml容量的离心管中。然后将各组织置于管中，使用转子在4°C振摇2小时。替换成含有20%蔗糖的PBS溶液，在4°C静置直至组织沉降，然后替换成含有30%蔗糖的PBS溶液，在4°C静置直至组织沉降。取出组织并使用手术刀切下所需的部分。接着，力口入OCT化合物(Tissue Tek公司制)使其浸润组织表面，随后将组织置于Cryomold (冷冻切片包埋模具)上。将Cryomold置于干冰上使其迅速冷冻，然后使用低温恒温器(LEICA公司制)将组织切成10 20 μ m薄片，并且用电吹风对每个载玻片风干30分钟，由此制备置有薄切片组织的载玻片。接着，将载玻片置于充满PBS-T(含有O. 05% Tween20的生理盐水)的染色瓶，将每隔5分钟更换PBS-T的操作进行3次。使用Kimwipes擦掉切片周围 的多余水分，用DAKOPEN(DAK0公司制)包围后，作为封闭液，对小鼠组织施用MOM小鼠Ig封闭试剂(VECTASTAIN公司制)，对狗组织施用含有10% FBS的PBS-T溶液，置于保湿室中在室温静置I小时。接着，将上述(5)制备的与癌细胞表面反应的、针对源于CAPRIN-I的肽(序列编号37)的多克隆抗体用封闭液调制成10 μ g/ml溶液，将该溶液施加于载玻片，在保湿室中于4°C静置过夜。在用PBS-T洗涤3次，每次10分钟后，向载玻片中施加用封闭液稀释250倍的MOM生物素标记抗IgG抗体(VECTASTAIN公司制)，在保湿室中于室温静置I小时。在用PBS-T洗涤3次，每次10分钟后，向载玻片上施加抗生物素蛋白-生物素ABC试剂(VECTASTAIN公司制)，在保湿室中于室温静置5分钟。在用PBS-T洗涤3次，每次10分钟后，向载玻片上施加DAB显色液(DAB 10mg+30% H2O2IO μ 1/0. 05MTris_HCl (pH值7. 6)，50ml)，在保湿室中于室温静置30分钟。用蒸馏水淋洗，然后施加苏木精试剂(DAK0公司制)，于室温静置I分钟后，用蒸馏水淋洗。载玻片依次地放入70 %、80 %、90 %、95%和100%的各乙醇溶液中各I分钟，随后使其在二甲苯中静置过夜。取出载玻片，用Glycergel Mounting Medium(DAK0公司制)封片，随后观察。其结果是,在唾液腺、肾、结肠和胃的各组织中仅在细胞内观察到微弱程度的CAPRIN-I表达；然而在细胞表面上没有观察到CAPRIN-I表达。此外，在来自其它器官的组织中完全没有观察到表达。此外，本结果在使用实施例3获得的具有序列编号43的重链可变区和序列编号47的轻链可变区的针对CAPRIN-I的单克隆抗体(单克隆抗体# I)、具有序列编号43的重链可变区和序列编号51的轻链可变区的针对CAPRIN-I的单克隆抗体(单克隆抗体# 2)或具有序列编号63的重链可变区和序列编号67的轻链可变区的针对CAPRIN-I的单克隆抗体(单克隆抗体# 3)时，也是同样的。(7) -2狗乳癌组织中的CAPRIN-I的表达使用在病理诊断中诊断为患有恶性乳癌的狗的冷冻乳癌组织108份样本，用与上述同样的方法制备冷冻切片载玻片，并进行使用了在上述(5)中制备的针对源于CAPRIN-I的肽(序列编号37)的多克隆抗体的免疫组织化学染色。作为其结果，在108个样本中，确认有100个样本(92. 5% )表达CAPRIN-I，特别是在异型度高的癌细胞表面有强烈表达。此夕卜，本结果在使用实施例3中获得的单克隆抗体# 1、# 2或# 3时，也是同样的。(7) -3人乳癌组织中的CAPRIN-I的表达使用石蜡包埋的人乳癌组织阵列(ΒΙ0ΜΑΧ公司制)的188个乳癌组织样本，进行免疫组织化学染色。将人乳癌组织阵列在60°C处理3小时后，放入装满了二甲苯的染色瓶中，将每隔5分钟替换二甲苯的操作进行3次。接着用乙醇和PBS-T代替二甲苯，进行同样的操作。在装满了含有O. 05% Tween20的IOmM柠檬酸缓冲液(pH值6. O)的染色瓶中加入人乳癌组织阵列，在125°C处理5分钟后，在室温下静置40分钟以上。将切片周围的多余水分用Kimwipes擦去，用DAKOPEN包围，适当滴加Peroxidase Block(DAK0公司制)。在室温下静置5分钟后，加入到装满了 PBS-T的染色瓶中，将每隔5分钟替换PBS-T的操作进行3次。作为封闭液，加入含有10% FBS的PBS-T溶液，在保湿室内、在室温下静置I小时。接着加入将上述(5)中制作的针对源于CAPRIN-I的肽(序列编号37)的多克隆抗体用含有5% FBS的PBS-T溶液调制成10 μ g/ml而得的溶液，在保湿室内、在4°C静置过夜，用PBS-T洗漆3次，每次 10分钟后，滴加适量的Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAK0公 司制)，在保湿室内、在室温下静置30分钟。利用PBS-T洗涤3次每次10分钟后，加入DAB显色液(DAK0公司制)，在室温下静置10分钟左右后，丢弃显色液，用PBS-T洗涤3次每次10分钟后，用蒸馏水冲洗，依次加入到70 %、80 %、90 %、95 %、100 %的各乙醇溶液中各I分钟，然后在二甲苯中静置过夜。取出载玻片，用Glycergel Mounting Medium(DAK0公司制)封片后，进行观察。作为其结果，在全部188份乳癌组织样本中，确认有138份样本(73% )较强地表达CAPRIN-I。此外，本结果在使用实施例3中获得的单克隆抗体# 1、# 2或# 3时，也是同样的。(7) -4人恶性脑瘤中的CAPRIN-I的表达使用石蜡包埋的人恶性脑瘤组织阵列(ΒΙ0ΜΑΧ公司制)的247份恶性脑瘤组织样本，利用与上述(7)-3同样的方法进行使用了上述(5)中制作的针对源于CAPRIN-I的肽(序列编号37)的多克隆抗体的免疫组织化学染色。作为其结果，在全部247份恶性脑瘤组织样本中，227份样本(92% )观察到强烈的CAPRIN-I表达。并且，本结果在使用实施例3中获得的单克隆抗体# 1、# 2或# 3时，也是同样的。(7)-5人乳癌转移淋巴结中的CAPRIN-I表达使用石蜡包埋的人乳癌转移淋巴结组织阵列(BIOMAX)的150份人乳癌转移淋巴结组织样本，利用与上述(7)-3同样的方法进行使用了上述(5)中制作的针对源于CAPRIN-I的肽(序列编号37)的多克隆抗体的免疫组织化学染色。作为其结果，在全部150份乳癌转移淋巴结组织样本中，136份样本(90% )观察到强烈的CAPRIN-I表达。S卩，判定CAPRIN-I在由乳癌转移的癌组织中也强烈地表达。此外，本结果在使用实施例3中获得的单克隆抗体# 1、# 2或# 3时，也是同样的。 (7) -6人各种癌组织中的CAPRIN-I的表达使用石蜡包埋的人各种癌组织阵列(ΒΙ0ΜΑΧ公司制)的样本，利用与上述同样的方法进行使用了上述(5)中制作的针对源于CAPRIN-I的肽(序列编号37)的多克隆抗体的免疫组织化学染色。作为其结果，确认了 CAPRIN-I在食道癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、肾癌、膀胱癌和宫颈癌中有强的表达。此外，本结果在使用实施例3中获得的单克隆抗体# I、
#2或# 3时，也是同样的。
实施例2人CAPRIN-I的制备(I)重组蛋白质的制备 基于实施例I中获得的序列编号I的基因通过以下方法制备人CAPRIN-I的重组蛋白质。PCR如下进行以由实施例I中制作的源于人的各种组织 细胞cDNA通过RT-PCR法可以确认表达的cDNA I μ I、含有SacI和XhoI限制性酶切割序列的两种引物(序列编号38和39中记载)各O. 4 μ M、0. 2mM dNTP、I. 25U PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造社制))的方式添加各试剂和附带的缓冲液，使总量为50 μ 1，使用Thermal Cycler (BIO RAD公司制)，将98°C -10秒、68°C -2. 5分钟的循环重复30次。此外，上述2种引物是扩增编码序列编号2的氨基酸序列全长的区域的引物。PCR后，将扩增的DNA利用1%琼脂糖凝胶进行电泳，使用 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN 公司制)纯化约 2. Ikbp 的 DNA 片段。将纯化的DNA片段连接到克隆载体pCR-Blunt (Invitrogen)中。将其转化大肠杆菌，然后回收质粒，通过测序确认扩增的基因片段与目的序列一致。用SacI和XhoI限制性酶处理与目的序列一致的质粒，然后用QIAquick Gel Extraction Kit纯化后,将目的基因序列插入到用SacI、XhoI限制性酶处理后的大肠杆菌用表达载体pET30a (Novagen公司制)中。通过使用该载体能够产生His标签融合型的重组蛋白质。将该质粒转化表达用大肠杆菌BL21(DE3)中，用ImM IPTG诱导表达，由此在大肠杆菌中表达目的蛋白质。(2)重组蛋白质的纯化将上述得到的表达序列编号I的基因的各重组大肠杆菌在含有30μ g/ml卡那霉素的LB培养基中在37°C培养，直至在600nm的吸光度达到O. 7左右，然后添加异丙基-β -D-I-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度ImM，在37°C培养4小时。此后，以4800转/分钟离心10分钟收集菌体。将该菌体颗粒悬浮在磷酸缓冲生理盐水中，进一步以4800转/分钟离心10分钟，进行菌体的洗涤。将菌体悬浮在磷酸缓冲生理盐水中，然后在冰上超声破碎。将大肠杆菌超声破碎液以6000转/分钟离心分离20分钟，将所得的上清液作为可溶性级分，将沉淀物作为不溶性级分。将可溶级分添加至根据常规技术制备的镍螯合柱(载体ChelateingSepharose (商标)Fast Flow (GE Health Care 社)；柱体积5ml ;50mM 盐酸缓冲液(pH值8. O)作为平衡缓冲液)。用10倍柱体积的50mM盐酸缓冲液(pH值8. O)和含有20mM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液(pH值8. O)洗去未吸附的级分，然后立即用含有IOOmM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液(pH值8. O)溶出6个床。将通过考马斯染色法确认了目的蛋白质的溶出的含有IOOmM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液(pH值8. O)溶出级分添加至强阴离子交换柱(载体Q Sepharose (商标)Fast Flow (GE Health Care 社)；柱体积5ml ;以及 20mM磷酸缓冲液(pH值8. O)作为平衡缓冲液)。用10倍柱体积的20mM磷酸缓冲液(pH值7. 0)和含有200mM氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH值7. 0)洗去未吸附的级分，然后立即用含有400mM氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH值7. 0)溶出5个床，获得具有序列编号2所示氨基酸序列的各蛋白质的纯化级分。将200 μ I通过上述方法获得的各纯化样品分注到Iml的反应用缓冲液(20mMTris-HCl, 50mM NaCl,2mM CaCl2, pH 值 7· 4)中，然后添加 2 μ I 肠激酶(Novagen 公司制)后，在室温静置过夜进行反应，切除His标签,使用Enterokinase Cleavage CaptureKit (Novagen公司制)按照附带的说明书进行纯化。随后，使用超滤NANOSEP IOKOMEGA(PALL社制)，将1.2ml由上述方法获得的纯化样品用生理用磷酸缓冲液(日水制药社制)置换，然后用0·22μηι HT Tuffryn Acrodisc (PALL公司制)实施无菌过滤,将所得物用于以下实验。实施例3针对CAPRIN-I的小鼠单克隆抗体的制备将实施例2中制备的具有序列编号2所示的氨基酸序列的抗原蛋白质(人CAPRIN-1) 100 μ g与等量的MPL + TDM佐剂(Sigma公司制)混合，将该混合物用作I只小鼠的抗原溶液。将抗原溶液施与6周龄的Balb/c小鼠(日本SLC公司制)的腹腔内后，每I周施与7次，完成免疫。从最后免疫起3天后分别取出脾脏，然后将其在两片无菌的载玻片之间磨碎，将用PBS (-)(日水社制)洗涤并以1500转/分钟离心10分钟移除上清液的操作重复3次，获得脾脏细胞。将获得的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(由ATCC购入)以10 : I的比例混合，向其中添加通过使加热至37°C的200 μ I含有10% FBS的RPMI1640培养基与800 μ I PEG1500 (>力'一社制)混合而制得的PEG溶液，静置5分钟以进 行细胞融合。以1700转/分钟离心5分钟，移除上清液后，将细胞用150ml添加了 2%当量的Gibco公司制的HAT溶液的含有15% FBS的RPMI1640培养基(HAT选择培养基)悬浮，并且以每孔各100 μ I接种于15块96孔板(Nunc公司制)中。在37°C、5% CO2的条件下培养7天，获得由脾脏细胞与骨髓瘤细胞的融合而产生的杂交瘤。以由制备的杂交瘤产生的抗体对人CAPRIN-I的结合亲和力作为指标来筛选杂交瘤。将实施例2中制备的CAPRIN-I蛋白溶液(I μ g/ml)以每孔100 μ I的量添加至96孔板，并使该板在4°C静置18小时。各孔用PBS-T洗涤3次后，以每孔400 μ I的量添加O. 5%牛血清白蛋白(BSA)溶液(SIGMA公司制)，使该板在室温静置3小时。移除溶液，用每孔400 μ I的PBS-T洗涤各孔3次后，以每孔100 μ I的量添加上述获得的杂交瘤的各培养上清液，使该板在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次，然后以每孔100 μ I的量添加用PBS稀释5000倍的HRP标记抗小鼠IgG (H + L)抗体(Invitrogen公司制)，并且在室温静置I小时。用PBS-T洗涤孔3次后，以每孔100 μ I的量添加TMB底物溶液(Thermo公司制)，并且静置15 30分钟，进行显色反应。在颜色显现后，以每孔100 μ I的量添加IN硫酸以终止反应，使用吸光度计测定在450nm的吸光度值和在595nm的吸光度值。作为其结果，选出了数个产生吸光度值高的抗体的杂交瘤。将选出的杂交瘤以每孔O. 5个的量添加至96孔板并培养。I周后，观察到在孔中形成单个集落杂交瘤。进一步培养这些孔中的细胞，以从克隆的杂交瘤产生的抗体对人CAPRIN-I的结合亲和力作为指标，选择杂交瘤。将实施例3中制备的CAPRIN-I蛋白溶液(I μ g/ml)以每孔100 μ I的量添加至96孔板，并在4°C静置18小时。将各孔用PBS-T洗涤3次，然后以每孔400 μ I的量添加O. 5% BSA溶液，并在室温静置3小时。移除溶液，用每孔400μ I的PBS-T洗涤孔3次后，以每孔100μ I的量添加上述获得的杂交瘤的各培养上清液，并在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，以每孔100 μ I的量添加用PBS稀释5000倍的HRP标记抗小鼠IgG (H + L)抗体(4 > '卜α -7'工 > 社制)，并且在室温静置I小时。用PBS-T洗涤孔3次后，以每孔100 μ I的量添加TMB底物溶液(Thermo公司制)，并且静置15 30分钟，进行显色反应。在颜色显现后，以每孔100 μ I的量添加IN硫酸以终止反应，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。作为其结果，获得了 50个产生与人CAPRIN-I显示免疫反应性的单克隆抗体的杂交瘤株。接下来，在这些单克隆抗体当中选出与表达人CAPRIN-I的乳癌细胞的表面显示反应性的单克隆抗体。具体地，在I. 5ml容量的微量离心管中离心分离IO6个人乳癌细胞株MDA-MB-231V，向其中添加上述各杂交瘤的培养上清液100 μ 1，在冰上静置I小时。在用PBS洗涤后，添加用含有O. 1% FBS的PBS稀释500倍的FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体(4 > '卜口夕工 >社制)，并在冰上静置I小时。在用PBS洗涤后，使用《” O] ”今> 乂 >株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。另一方面，使用将没有任何处理的6周龄的Balb/c小鼠的血清用杂交瘤培养用培养基稀释500倍而得的物质代替抗体进行与上述同样的操作，制备对照的样品。作为其结果，选出了与对照相比荧光强度强、即与乳癌细胞的细胞表面反应的单克隆抗体3个(# 1、# 2和# 3)。实施例4选出的抗体所具有的特征
(I)抗人CAPRIN-I小鼠单克隆抗体的可变区基因的克隆从分别产生实施例3中选出的3个单克隆抗体的各杂交瘤株中提取mRNA，通过使用了对于源于小鼠FRl的序列和源于小鼠FR4的序列为特异性的引物的RT-PCR法，获得全部的抗CAPRIN-I单克隆抗体的重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的基因。为了确定序列，将这些基因克隆到PCR2. I载体(4 > '卜口 y'工 >社制)中。(2) RT-PCR使用High Pure RNA Isolation Kit (Roche公司制)从IO6个的各杂交瘤株提取总 RNA 后，使用 PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara 公司制)将所得mRNA逆转录来合成cDNA。这些操作按照各试剂盒所附带的说明书来进行。使用所得的cDNA通过PCR法扩增抗体基因。为了获取VH区的基因，使用了对小鼠重链FRl序列为特异性的引物(序列编 号54)和对小鼠重链FR4序列为特异性的引物(序列编号55)。另外为了获取VL区的基因，使用了对小鼠轻链FRl序列为特异性的引物(序列编号56)和对小鼠轻链FR4为特异性的引物(序列编号 57)。这些引物参考 Jones, S. T. and Bending, Μ. Μ. Bio/Technology9, 88-89(1991)进行设计。PCR使用了 Ex-taq(夕力 人才社制)。在 10XEX Taq Buffer5 μ l.dNTP Mixture (2. 5mM)4y I、引物(I. ΟμΜ)各 2μ 1、Εχ Taq (5U/ μ 1)0. 25 μ I 中加入cDNA样品，用灭菌水使总量为50 μ I，将在94 V处理2分钟后，将在94 V变性I分钟、在58 °C退火30秒、在72°C进行I分钟的延伸反应的组合作为I个循环，进行30个循环。⑶克隆使用上述得到的各PCR产物，利用琼脂糖凝胶进行电泳，切出VH区和VL区各自的DNA带。DNA片段使用QIAquick Gel purification kit (QIAGEN公司制)并按照附带的说明书来进行。纯化的各DNA使用TA克隆试剂盒(4 > '卜a y' 二 >社制)克隆到PCR2. I载体中。将连接的载体利用常规方法转化到DH5a感受态细胞(Τ0Υ0Β0公司制)中。将各个转化体的各10个克隆在培养基(100 μ g/ml氨苄青霉素)中、在37°C培养过夜后，将各质粒DNA使用Qiaspin Miniprep kit (QIAGEN公司制)进行纯化。(4)序列确定上述得到的各质粒中的VH区和VL区的基因序列分析，使用M13正向引物(序列编号58)和M13反向引物(序列编号59)，利用荧光测序仪(ABI公司制DNA测序仪3130XL)，并使用ABI公司制的BigDye Terminator Ver3. I循环测序试剂盒,按照其附带的说明书来进行。其结果可以确定各基因序列(在10个克隆中分别一致)。编码得到的单克隆抗体的重链可变区的基因序列示于序列编号52和序列编号68，其氨基酸序列示于序列编号43和序列编号63，编码轻链可变区的基因序列示于序列编号70、序列编号53和序列编号69，其氨基酸序列示于序列编号47、序列编号51、序列编号67。S卩，单克隆抗体# I包含序列编号43的重链可变区和序列编号47的轻链可变区，单克隆抗体# 2包含序列编号43的重链可变区和序列编号51的轻链可变区，单克隆抗体# 3包含序列编号63的重链可变区和序列编号67的轻链可变区。实施例5抗CAPRIN-I单克隆抗体# I、# 2和# 3所识别的CAPRIN-I表位的鉴定使用实施例3中获得的、与癌细胞的细胞表面反应的针对CAPRIN-I的单克隆抗体
#U# 2和# 3，进行由这些抗体识别的CAPRIN-I表位区域的鉴定。 合成93个包含人CAPRIN-I蛋白质的氨基酸序列中的12 16个氨基酸的候选肽，分别以lmg/ml的浓度用DMSO溶解。将各肽溶解在O. IM碳酸钠缓冲液(pH值9. 6)中，使其形成30 μ g/ml的浓度，向96孔板(Nunc公司制、制品编号436006)的每孔中各添加100μ 1，在4°C静置一夜。丢弃液体，每孔各添加200 μ I的IOmM乙醇胺/0. IM碳酸钠缓冲液(PH值9. 6)，在室温下静置I小时后，舍弃液体，利用含有O. 5% Tween20的PBS(PBST)洗涤2次，由此制作固相化有各肽的板。向其中以每孔50μ I的量添加实施例3中所得的含有小鼠单克隆抗体(# 1、# 2、
#3)的细胞培养上清液，在室温振摇I小时后，除去液体，利用PBST洗涤3次。接着，将在小鼠单克隆抗体中分别添加2次抗体溶液各50 μ I，然后除去液体，用PBST洗涤6次，所述2次抗体溶液是将标记了 HRP的抗小鼠IgG (Invitrogen公司制)抗体利用PBST稀释3000 4000倍而得的。以每孔100 μ I的量添加TMB底物溶液(Thermo公司制)，并静置15 30分钟，进行显色反应。在颜色显现后，以每孔100μ I的量添加IN硫酸以终止反应，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。作为其结果，作为抗CAPRIN-1单克隆抗体# 1和# 2都识别的CAPRIN-I的部分序列，鉴定了含有序列编号37的氨基酸序列的多肽。因此，判断作为人CAPRIN-I的部分序列的、序列编号37的多肽包含抗CAPRIN-I抗体# 1、# 2和#3的表位区域。实施例6使用了抗CAPRIN-I抗体# I、# 2和# 3的各种癌细胞表面的CAPRIN-1的表达接着对于确认表达CAPRIN-I基因的乳癌细胞株7种(MDA_MB_157，T47D，MRK-nu-1, MDA-MB-231V, BT20, SK-BR-3, DA-MB-231T)和其它乳癌细胞株 3 种(MDA-MB-231C, MCF-7，ZR75-1)、神经胶质瘤细胞株 5 种(T98G，SNB19, U251，U87MG，U373)、肾癌细胞株4种(Caki-l，Caki-2，A498，ACHN)、胃癌细胞株2种(MKN28，MKN45)、大肠癌细胞株 5 种(HT29, LoVo，Caco2, SW480, HCTl 16)、肺癌细胞株 3 种(A549、QG56、PC8)、白血病细胞株4种(AML5，Namalwa, BDCM、RPI1788)、宫颈癌细胞株I种(SW756)、膀胱癌细胞株I种(T24)、食道癌细胞株I种(KYSE180)和淋巴瘤细胞株I种(Ramos)，使用实施例3所得的含有# 1、# 2和# 3的培养上清液，研究在各细胞的细胞表面上的CAPRIN-I蛋白质的表达。在I. 5ml容量的微量离心管中离心分离各细胞株分别IO6细胞。向其中添加上述(2)中得到的分别含有# I、#2和# 3的各细胞培养上清液(ΙΟΟμ 1)，在冰上静置I小时。在用PBS洗涤后，添加用含有O. I % FBS的PBS稀释500倍的FITC标记山羊抗人IgG (H + L)抗体(SouthernBiotech公司制)，并在冰上静置I小时。在用PBS洗涤后，使用《” >r 4 y ^ >株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。在阴性对照中使用仅与二次抗体反应了的物质。作为其结果，添加了# I、#2和# 3的细胞与阴性对照相比，荧光强度均增强20%以上。由此可以确认，CAPRIN-I蛋白质在上述人癌细胞株的细胞膜表面上表达。并且，上述荧光强 度的增强率利用各细胞的平均荧光强度(MFI值)的增加率表示，通过以下算式来算出。平均荧光强度的增加率(荧光强度的增强率)(％) = ((与抗人CAPRIN-I抗体反应的细胞的MFI值)-(对照MFI值))+ (对照MFI值)X 100。实施例7针对CAPRIN-I的抗体对癌细胞的抗肿瘤效果(ADCC活性和⑶C活性)首先通过测定ADCC活性来研究针对CAPRIN-I的抗体是否能够损伤表达CAPRIN-I的癌细胞。使用实施例I中制备的针对源于人CAPRIN-I的肽(序列编号37)的多克隆抗体进行评价。将IO6个确认了表达CAPRIN-I的人乳癌细胞株MDA-MB-157收集到50ml容量的离心管中，加入IOOyCi的铬51，在37°C孵育2小时。然后用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基洗涤3次，向96孔V底板中每孔添加各IO3个。向其中添加上述针对源于人CAPRIN-I的肽的多克隆抗体I μ g，进一步各添加2X IO5个从兔末梢血分离的淋巴细胞，在37°C、5% CO2的条件下培养4小时。培养后，测定从受到损伤的肿瘤细胞中释放的培养上清液中的铬(Cr)51的量，算出由针对源于人CAPRIN-I的肽的多克隆抗体产生的对于癌细胞的ADCC活性。作为其结果，确认了对MDA-MB-157显示18. I %的ADCC活性(参考图2)。另一方面，使用由没有用抗原免疫的兔末梢血制备的对照抗体(实施例1(5))进行同样的操作时，和不添加抗体时，几乎没有发现活性(参照图2)。因此，明确了通过使用了针对CAPRIN-I的抗体的ADCC活性，能够损伤表达CAPRIN-I的癌细胞。其中，细胞毒活性显示如上所述，将本发明中使用的针对CAPRIN-I的抗体、兔淋巴细胞和摄取了铬51的IO3个各癌细胞株混合并培养4小时，测定培养后释放到培养基中的铬51的量，由以下算式*算出的针对癌细胞株的细胞毒活性的结果。*式细胞毒活性)=加入了针对CAPRIN-I的抗体和兔淋巴细胞时的来自癌细胞的铬51游离量+来自加入了 IN盐酸的靶细胞的铬51游离量X 100。进一步地，评价实施例3中得到的、针对CAPRIN-I的小鼠单克隆抗体# U# 2和#3的对癌细胞的细胞毒活性。将产生# I、# 2和#3的各细胞培养上清液用HitrapProteinA SepharoseFF(GE ^ ^ ^ ’ 7 社制)纯化，置换为 PBS(-)，将用 O. 22 μ m 的过滤器($ V 社制)过滤而得的产物用作活性测定用的抗体。将IO6个人乳癌细胞株MDA-MB-157收集到50ml容量的离心管中，加入100 μ Ci的铬51，在37°C孵育2小时。然后用含有10% FBS的RPMI1640培养基洗涤3次，向96孔V底板中每孔添加各IO3个，作为靶细胞。向其中分别添加上述纯化抗体I μ g，进一步地添加5X IO4个由6周龄BALB/C小鼠(日本SLC公司制)的脾脏按照常规方法分离的小鼠脾脏细胞，在37°C、5% CO2的条件下培养4小时。培养后，测定从受到损伤的肿瘤细胞中释放的培养上清液中的铬51的量，算出抗CAPRIN-I抗体对癌细胞的细胞毒活性。在阴性对照中，代替抗体，而使用添加了 PBS的样品、添加了同种型对照抗体的样品。作为其结果，# U# 2和#3的抗体对MDA-MB-157均显示25%以上的细胞毒活性。另一方面，作为阴性对照的添加了 PBS的样品、添加了同种型对照抗体的样品的活性分别为1.7%、3.0%。同样地，研究抗体# 1、#2和#3对其它癌细胞、神经胶质瘤细胞株T98G、U373、肺癌细胞株A549、QG56、肾癌细胞株Caki-1、ACHN、宫颈癌细胞株SW756、膀胱癌细胞株T24、食道癌细胞株KYSE180、胃癌细胞株MKN28、MKN45、大肠癌细胞株SW480、白血病细胞株AML5和淋巴瘤细胞株Ramos的细胞毒活性，结果抗体
#I的活性显示对T98G为13. 2% (同种型对照为2. 5% )、对U373为16. 0% (同种型对照为4. 3% )、对A549为12. 0% (同种型对照为4. 5% )、对QG56为12. 6% (同种型对照为5. 3% )、对Caki-I为10. 3% (同种型对照为4. 5 %)、对ACHN为9. O % (同种型对照为3. 8% )、对SW756为8. 6% (同种型对照为5. 1% )、对T24为13. 0% (同种型对照为3.8% )、对KYSE180为8.9% (同种型对照为5. 7 % )、对MKN28为16. 2 % (同种型对照为4. 2% )、对MKN45为12. 1% (同种型对照为4. 6% )、对SW480为13. 4% (同种型对照为6. 4% )、对AML5为8. 9% (同种型对照为4. 7% )、对Ramos为8. I % (同种型对照为2.5%)的活性。另外，抗体# 2和#3也显示同样的结果。由以上的结果表明，获得的抗 CAPRIN-I抗体# U# 2和#3通过ADCC活性损伤了表达CAPRIN-I的癌细胞。由以上的结果表明，获取的针对CAPRIN-I的小鼠单克隆抗体# U# 2和# 3通过ADCC活性损伤了表达CAPRIN-I的癌细胞。其中，细胞毒活性显示如上所述，将本发明中使用的针对CAPRIN-I的抗体、小鼠脾脏细胞和摄取了铬51的IO3个各癌细胞株混合并培养4小时，测定培养后释放到培养基中的铬51的量，由以下算式*算出的对癌细胞株的细胞毒活性的结果。*式细胞毒活性)=加入了针对CAPRIN-I的抗体和小鼠脾脏细胞时的来自癌细胞的铬51游离量+来自加入了 IN盐酸的靶细胞的铬51游离量X 100。接着，评价获得的针对CAPRIN-I的小鼠单克隆抗体# I和#2的对癌细胞的细胞毒活性(⑶C活性)。将从兔采集的血液放入Eppendorf管中，在室温静置60分钟后，以3000转/分钟离心分离5分钟，由此制备CDC活性测定用的血清。将IO5个作为人乳癌细胞的MDA-MB-231V收集到50ml容量的离心管中，加入100 μ Ci的铬51，在37°C孵育2小时后，用含有10% FBS的RPMI培养基洗涤3次。然后用含有50%的上述制备的兔血清的RPMI培养基悬浮，向96孔V底板中每孔添加各IO3个。向其中分别添加小鼠单克隆抗体# I和#2各I μ g，在37°C、5% CO2的条件下培养4小时。培养后，测定从受到损伤的肿瘤细胞中释放的培养上清液中的铬51的量，算出各抗体对MDA-MB-231V的⑶C活性。作为其结果，# I和# 2的抗体均显示20%以上的⑶C活性。另外，没有添加抗体的阴性对照组中没有观察到细胞毒活性。因此，可以明确# 1和# 2的抗体通过⑶C活性而能够损伤表达CAPRIN-I的肿瘤细胞。其中，细胞毒活性显示如上所述，将本发明中使用的针对CAPRIN-I的抗体、血清和摄取了铬51的IO3个各癌细胞株混合并培养4小时，测定培养后释放到培养基中的铬51的量，由以下算式*算出的对癌细胞株的细胞毒活性的结果。*式细胞毒活性)=加入了针对CAPRIN-I的抗体和血清时的来自癌细胞的铬51游离量+来自加入了 IN盐酸的靶细胞的铬51游离量X 100。接着，评价获取的针对CAPRIN-I的小鼠单克隆抗体# I和# 2在荷癌小鼠活体内的抗肿瘤效果。使用的抗体与上述同样，使用将产生# 1和# 2的各细胞的培养上清液进行柱纯化而得的抗体。使用移植了源于表达CAPRIN-I的小鼠的癌细胞株的荷癌小鼠，研究# I和# 2的抗体的抗肿瘤效果。在30只Balb/c小鼠(日本SLC社制)的背部皮下以每只5X IO5个的量移植4T1细胞(由ATCC购入)，使肿瘤生长至直径为5mm左右的大小。其中，对于20只荷癌小鼠，以每只各自200 μ g(200 μ I)的量腹腔内施与# I和# 2的抗体，对于I种抗体施与10只。然后，2天共计3次、向各荷癌小鼠的腹腔内施与等量的各抗体，每天测量肿瘤的大小，观察抗肿瘤效果。另一方面，对剩余的10只荷癌小鼠，施与PBS(-)来代替抗体，将其作为对照组。并且肿瘤的大小使用长径X短径X短径X0. 5的算式来算出体积。作为抗肿瘤效果的观察结果，对于施与了针对CAPRIN-I的小鼠单克隆抗体# I和
#2的研究组，到施与抗体后第16天肿瘤几乎完全萎缩。另一方面，对于施与了 PBS(-)的对照组，在第12天肿瘤大约增加至820%。由该结果表明，获取的针对CAPRIN-I的小鼠单克隆抗体# I和# 2对表达CAPRIN-I的癌细胞在生物体内发挥强的抗肿瘤效果。 产业可利用性本发明的抗体可用于癌的治疗和/或预防。将本说明书中引用的所有刊物、专利和专利申请直接作为参考引入本说明书中。序列表自由文本序列编号31:T3引物序列编号32:Τ7引物序列编号33、34、38、39、54 59 :引物序列编号35、36 =GAPDH引物
权利要求
1.用于癌的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于，含有与由序列编号2 30中偶数的序列编号表示的CAPRIN-I的部分多肽具有免疫反应性的抗体或其片段作为有效成分，所述CAPRIN-I的部分多肽具有序列编号37所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。
2.如权利要求I所述的药物组合物，其中，上述癌是乳癌、脑瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、肥大细胞瘤、肾癌、宫颈癌、膀胱癌、食道癌、胃癌或大肠癌。
3.如权利要求I或2所述的药物组合物，其中，上述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
4.如权利要求I 3中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗体为人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或双特异性抗体。
5.抗体，其与多肽具有免疫反应性，所述多肽具有序列编号37所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的抗体，其对表达CAPRIN-I蛋白质的癌细胞具有细胞毒活性。
7.抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，且与CAPRIN-I蛋白质具有免疫反应性，所述重链可变区包含序列编号40、41和42，所述轻链可变区包含序列编号44、45和46。
8.抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，且与CAPRIN-I蛋白质具有免疫反应性，所述重链可变区包含序列编号40、41和42，所述轻链可变区包含序列编号48、49和50。
9.抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，且与CAPRIN-I蛋白质具有免疫反应性，所述重链可变区包含序列编号60、61和62,所述轻链可变区包含序列编号64、65和66。
10.如权利要求5 9中任一项所述的抗体，其为人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或双特异性抗体。
11.用于癌的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于，含有权利要求5 10中任一项所述的抗体或其片段作为有效成分。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其中，上述癌为乳癌、脑瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、肥大细胞瘤、肾癌、宫颈癌、膀胱癌、食道癌、胃癌或大肠癌。
13.用于癌的治疗和/或预防的组合药物，其包含权利要求I 4中任一项所述的药物组合物、或权利要求11或12所述的药物组合物；和含有抗肿瘤剂的药物组合物。
14.癌的治疗和/或预防方法，其包括以下步骤将权利要求5 10中任一项所述的抗体或其片段、或权利要求11或12所述的药物组合物施与受试者。
15.癌的治疗和/或预防方法，其包括以下步骤对受试者合并使用权利要求13所述的组合药物的各药物组合物。
全文摘要
本发明涉及鉴定在癌细胞的表面特异性地表达的癌抗原蛋白质、以其为靶的抗体的作为癌的治疗和/或预防剂的用途，具体来说，本发明提供用于癌的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于，含有与由序列编号2～30中偶数的序列编号表示的CAPRIN-1的部分多肽具有免疫反应性的抗体或其片段作为有效成分，所述CAPRIN-1的部分多肽具有序列编号37所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列。
文档编号C12N15/09GK102822335SQ201180016730
公开日2012年12月12日 申请日期2011年2月4日 优先权日2010年2月4日
发明者小林真一, 冈野文义, 斋藤孝则 申请人:东丽株式会社