用于病毒载体纯化的可扩缩生产平台和用于基因治疗中的如此纯化的病毒载体的制作方法

专利名称：用于病毒载体纯化的可扩缩生产平台和用于基因治疗中的如此纯化的病毒载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产质量管理规范和病毒载体纯化的领域。更特别地，组合物和方法促进用于基因治疗方案的高度纯化的重组AAV的制备。
背景技术：
在本说明书各处引用若干出版物和专利文件以描述本发明所从属的领域的状态。这些引用各自通过引用如同全部陈述那样结合于本文中。基因递送是用于获得性疾病和遗传性疾病的治疗的充满前景的方法。已描述了用于基因转移目的的许多基于病毒的系统，包括基于腺相关病毒(AAV)的系统。AAV为属于依赖病毒属的依赖辅助病毒的DNA细小病毒。AAV需要与无关的辅助病毒(例如腺病毒、疱疫病毒或牛痘)共感染，以便发生生产性感染。在辅助病毒不存在的情况下，AAV通过将其基因组插入宿主细胞染色体中建立潜伏状态。通过辅助病毒的随后感染拯救整合的病毒基因组，其可接着复制以产生感染性的病毒子代。AAV具有广泛的宿主范围并且能够在存在合适的辅助病毒下在来自任何物种的细胞中复制。例如，人AAV在与犬腺病毒共感染的犬细胞中复制。AAV不与任何人或动物的疾病相关并且当整合时似乎并不改变宿主细胞的生物学性质。对于AAV的综述，参见例如 Berns 和 Bohenzky (1987) Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.)32:243-307。已描述了感染性重组AAV (rAAV)毒粒的构建。参见，例如，美国专利第5，173，414号和第5，139，941号；国际公布号WO 92/01070 (于1992年I月23日公布)和WO 93/03769(于 1993 年3 月 4 日公布)；Lebkowski 等· (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996 ；Vincent 等.(1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press) ；Carter,B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539 ；Muzyczka, N. (1992)Current Topics in Microbiol, and Tmmunol · 158:97-129 和 Kotin, R. M. (1994)Human Gene Trephy 5:793-801。可改造AAV载体以通过全部或部分缺失AAV基因组的内在部分并将目标DNA序列插入ITR之间来携带异源的目标核苷酸序列(例如编码治疗蛋白的选定基因、反义核酸分子、核酶、miRNA等)。所述ITR在此类载体中仍有功能，允许包含异源的目标核苷酸序列的rAAV的复制和包装。所述异源的核苷酸序列还典型地与能够在某些条件下在患者的靶细胞中驱动基因表达的启动子序列连接。终止信号，例如聚腺苷酸化位点，也可包含于所述载体中。
虽然完全消除病毒载体的免疫原性并非现实的目标，但将制备用于人基因治疗的AAV载体的免疫原性最小化是高度所需的。本发明的一个目标是提供实现该目标的组合物和方法。发明简述
依照本发明，提供了用于从包含AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质的AAV制备物中纯化包含编码治疗蛋白或其片段的转基因的真正的AAV载体颗粒，从而提供基本不含AAV空衣壳的AAV产物的方法。示例性纯化方案包括收获转导了 AAV的细胞；经由切向流过滤浓缩所述细胞；以及通过微射流裂解所述细胞以形成裂解液。接着将裂解液过滤并澄清。澄清后，AAV颗粒通过离子交换柱层析法纯化并任选通过切向流过滤进一步浓缩。接着将如 此产生的洗脱液在等密度梯度上分层并进行超速离心，收获包含病毒颗粒的层并通过切向流过滤进行缓冲液交换。接着纯化的AAV颗粒用表面活性剂配制，并将所得制剂过滤以移除任何残留杂质，从而产生高度纯化的AAV产物，其中所述真正的AAV载体颗粒在所述AAV产物中以至少95%的量，优选大于98%的量存在。在一个优选的实施方案中，AAV产物包含IO15个颗粒/mL浓度的AAV颗粒，更优选颗粒以IO16个颗粒/mL浓度存在并且最优选，颗粒以IO17个颗粒/mL浓度存在。如此纯化的AAV载体可为多种血清型的，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9。在又一个实施方案中，公开了一种AAV载体制剂，其在药学上可接受的载体中包含使用上述方法纯化的AAV颗粒。本发明的纯化的AAV颗粒包含编码所需基因产物的异源核酸。此类产物包括但不限于SiRNA、反义分子、miRNA、核酶等。其它产物包括编码可用于修正先天性代谢缺陷的激素、生长受体、配体和蛋白的核酸。在特别优选的实施方案中，载体编码选自RPE65、因子VIII和因子IX的蛋白。附图
简述
图I.重组AAV产生期间产生的AAV颗粒的类型的图解，包括使用当前工业标准的可扩缩纯化工艺达到的纯化(真正的载体和载体相关杂质的混合物)，和使用我们的可扩缩纯化方法达到的纯化(载体相关杂质的基本移除)的示意图，我们的可扩缩纯化方法掺有梯度超速离心步骤，根据所用纯化步骤的顺序使所述梯度超速离心步骤“可扩缩”。图2.显示本发明的载体纯化工艺步骤的流程图。图3.通过梯度超速离心的代表性工业标准可扩缩纯化工艺(genl-Chr)-纯化的AAV载体的分析。显示了表面上‘纯的’载体中的AAV颗粒的相对量和异质性，以及在真正的AAV载体自载体相关杂质的分离中梯度超速离心的有效性。‘genl-Chr’代表了当前“工业标准”可扩缩纯化工艺。发明详述
本发明提供了一种AAV载体纯化平台，其包含两个将其与当前‘工业标准’的可扩缩AAV载体纯化工艺区别的独特特征1)提供高的载体纯度的可用于不同AAV血清型/衣壳变体的纯化的模块化平台方法，所述方法包括载体相关杂质的有效移除；和2)方法步骤的独特顺序(包括柱层析法、之后的切向流过滤和接着的梯度超速离心的关键‘核心’顺序)，其赋予对重要的超速离心步骤的意外的可扩缩性。
AAV载体产生和纯化方法的最优化确保了载体产物可有效地将其遗传有效负载递送至靶细胞，并使有害的免疫应答的激活的可能性最小化。由于载体相关杂质对于预期的人受者是非自身且免疫刺激的，其应在人胃肠外产品的纯化期间最小化或消除。载体相关杂质在细胞培养中的载体产生期间典型地以比真正的载体高得多的量产生，并且由于它们结构相似在纯化期间难以与载体分离。在载体产生后的粗制细胞收获物中，载体相关杂质通常占>50%，典型地约80%，并且可占生物合成的总AAV颗粒的>80%。这在使用迄今为止开发用于产生AAV载体的各细胞培养系统中已观察到。纯化作为治疗人类疾病的产品的重组AAV的生产方法的开发必须实现以下目标I) 一致的载体纯度、效价和安全性；2)生产方法的可扩缩性；和3)生产的可接受成本。当前‘工业标准’的可扩缩AAV载体纯化工艺并不足以实现载体相关杂质的移除，其对于满足以上列出的第一目标(一致的载体纯度、效价和安全性)是重要的。此外，已出现使用当前工业标准的可扩缩纯化工艺不能充分地移除载体相关杂质的情况，这是由于1)用于除疫苗(其中通常寻求而非避免免疫应答)之外的应用的病毒产物(例如重组AAV)的纯化工艺的开发是相对不成熟的；2)涉及用于AAV载体的可扩缩纯化工艺的开发的许多小组未意识到载体相关杂质的高水平和/或假定此类杂质不会促进载体免疫原性的临床显著性 增加；和3)开发用于从载体相关杂质中分离真正的载体的可扩缩纯化工艺在技术上有挑战，因为这些AAV颗粒就物理-化学特征(例如粒径、颗粒表面分子拓扑学和静电荷分布)而言彼此极为相似，典型地利用所述特征以实现生物分子在可扩缩方法步骤中的纯化。 提供以下定义以有利于本发明的实践。至于“载体”意指任何的遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、毒粒等，当与合适的控制元件结合时其能够复制并且其可在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包括克隆载体和表达载体，以及病毒载体。至于“AAV载体”意指来源于腺相关病毒血清型的载体，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8。AAV载体可具有一个或多个全部或部分缺失的AAV野生型基因(优选rep和/或cap基因)，但保留了有功能的侧翼ITR序列。有功能的ITR序列对于AAV毒粒的拯救、复制和包装是必需的。因此，本文定义的AAV载体包含至少对于病毒复制和包装顺式所需的那些序列(例如有功能的ITR)。ITR不需要为野生型核苷酸序列，并且只要序列提供有功能的拯救、复制和包装，可例如通过核苷酸的插入、缺失或取代来改变。同样至于“AAV载体”意指蛋白外壳或衣壳，其提供了载体核酸递送至靶细胞的核的有效载体。“AAV辅助功能”是指可表达以提供AAV基因产物的AAV衍生的编码序列，所述AAV基因产物反过来对于生产性AAV复制反式起作用。因此，AAV辅助功能包括主要AAV开放阅读框(ORF) rep和cap两者。已显示Rep表达产物具有许多功能，其中包括DNA复制的AVV起点的识别、结合和切口 ；DNA解旋酶活性和AAV (或其它异源)启动子的转录的调节。Cap表达产物供应必需的包装功能。AAV辅助功能在本文用于反式补充AAV载体中缺失的AAV功能。术语“AAV辅助构建体”通常是指包含提供AAV载体中缺失的AAV功能的核苷酸序列的核酸分子，所述AAV载体用于产生用于目标核苷酸序列的递送的转导载体。AAV辅助构建体通常用于提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达以补充缺失的AAV复制必需的AAV功能；然而，辅助构建体缺少AAV ITR并且自身不可复制或包装。AAV辅助构建体可呈质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或毒粒的形式。已描述了许多AAV辅助构建体，例如编码R印和Cap表达产物两者的常用质粒pAAV/Ad和pM29+45。参见例如Samulski等.(1989)J. Virol. 63:3822-3828 ;和 McCarty 等.(1991) J. Virol. 65:2936-2945。已描述了编码Rep和/或Cap表达产物的许多其它载体。参见，例如，美国专利第5，139，941号和第6，376，237 号。术语“载体相关杂质”是指除真正的重组AAV颗粒之外的AAV颗粒的所有类型。载体相关杂质包括空的AAV衣壳(也被称作“空物”或“空颗粒”)以及包含除预期载体基因组之外的多核苷酸序列的AAV颗粒(也被称作“AAV包衣壳的核酸杂质”或“AAV包衣壳的DNA杂质”)。术语“附加功能(accessory function) ”是指AAV复制所依赖的非AAV来源的病毒功能和/或细胞功能。因此，该术语涵盖AAV复制所需的蛋白和RNA，AAV复制包括涉及AAV基因转录的激活、阶段专一的AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物的合成和AAV 衣壳装配的那些部分。基于病毒的附加功能可来源于已知的辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒(除I型单纯疱疹病毒之外)和痘苗病毒)中的任一种。术语“附加功能载体”通常是指包含提供附加功能的核苷酸序列的核酸分子。附加功能载体可转染至合适的宿主细胞中，其中载体则能够支持AAV毒粒在宿主细胞中产生。该术语中明确除外的是感染性病毒颗粒，因为其存在于自然中，例如腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒颗粒。因此，附加功能载体可呈质粒、噬菌体、转座子或粘粒的形式。具体而言，已证明腺病毒基因的完全互补物并非为附加的辅助功能所需。例如，已显示不能DNA复制和晚期基因合成的腺病毒突变体可供AAV复制。Ito等.，(1970) J. Gen. Virol. 9:243;Ishibashi等，(1971) Virology 45:317。类似地，已显示出E2B和E3区内的突变体支持AAV复制,提示E2B和E3区很可能不涉及提供附加功能。Carter等.，(1983) Virology126:505。然而，El区内缺陷或者具有缺失E4区的腺病毒不能支持AAV复制。因此，ElA和E4区很可能为AAV复制直接或间接所需。Laughlin等，(1982) J. Virol. 41:868;Janik等，(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925; Carter等，(1983) Virology126:505。其它表征的Ad突变体包括ElB (Laughlin等(1982)，见上文Janik等(1981)，见上文；Ostrove 等，(I98O) Virology 104:502) ；E2A (Handa 等，(I975) J. Gen.Virol. 29:239; Strauss 等，(1976) J. Virol. 17:140; Myers 等，(1980) J. Virol.35:665; Jay 等，(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Myers 等，(1981) J.Biol. Chem. 256:567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions,载于 I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen 编辑，1990)) ；E3 (Carter 等(1983)，见上文)和E4 (Carter等(1983)，见上文；Carter (1995))。尽管在ElB编码区中有突变的腺病毒提供的附加功能的研究已产生了矛盾的结果，Samulski等，(1988) J. Virol.62:206-210，但近来报道对于AAV毒粒产生而言ElB55k是需要的，而ElB19k是不需要的。此外，国际公布 WO 97/17458 和 Matshushita 等，(1998) Gene Therapy 5:938-945 描述了编码不同的Ad基因的附加功能载体。特别优选的附加功能载体包含腺病毒VA RNA编码区、腺病毒E4 0RF6编码区、腺病E2A 72 kD编码区、腺病毒ElA编码区和缺少完整ElB55k编码区的腺病毒ElB区。此类载体描述于国际公布号WO 01/83797中。
至于“重组病毒”意指已遗传改变的病毒，例如通过异源的核酸构建体添加或插入至颗粒中来进行遗传改变。至于“AAV毒粒”意指完全的病毒颗粒，例如野生型(Wt)AAV病毒颗粒(包含与AAV衣壳蛋白外壳关联的线性、单链AAV核酸基因组)。在该方面，任一互补有义物的单链AAV核酸分子，例如“有义”链或“反义”链，可包装至任一种AAV毒粒中并且两条链是同等感染性的。术语“重组AAV毒粒”、“rAAV毒粒”、“AAV载体颗粒”、“完全衣壳”和“完全颗粒”在本文定义为感染性的、复制缺陷的病毒，其包含对被AAV ITR在两侧侧接的异源的目标核苷酸序列包衣壳的AAV蛋白外壳。rAAV毒粒在具有规定引入其中的AAV载体、AAV辅助功能和附加功能的序列的合适宿主细胞中产生。以该方式，使宿主细胞能够编码将AAV载体(包含重组的目标核苷酸序列)包装至感染性重组毒粒颗粒用于随后的基因递送所需的AAV多肽。术语“空衣壳”和“空颗粒”是指这样的AAV毒粒，其包含AAV蛋白外壳但全部或部·分地缺少包含被AAV ITR在两侧侧接的异源的目标核苷酸序列的多核苷酸构建体。因此，所述空衣壳并不起转移目标基因至宿主细胞的功能。术语“宿主细胞”表示例如微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其可为或已用作AAV辅助构建体、AAV载体质粒、附加功能载体或其它的转移DNA的受体。术语包括已转染的原始细胞的子代。因此，本文所用“宿主细胞”通常是指已转染外源DNA序列的细胞。应理解的是由于自然的、偶然的或刻意的突变，单个亲代细胞的子代可能不一定与原始亲代在形态学或基因组DNA互补物或总DNA互补物方面完全相同。术语“转染”用于指外来DNA被细胞的摄取，并且当外源DNA已引入细胞膜内时细胞已被“转染”。许多转染技术为本领域通常已知的。参见，例如Graham等(1973)Virology, 52 :456, Sambrook 等(1989) Molecular Cloning, a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis 等(1986) Basic Methods inMolecular Biology, Elsevier,和 Chu 等(1981) Gene 13:197。此类技术可用于引入一种或多种外源DNA部分至合适的宿主细胞中。本文所用术语“细胞系”是指能够在体外持续或延长生长和分裂的一群细胞。细胞系往往为来源于单个祖细胞的克隆群体。本领域还已知的是在此类克隆群体的储藏或转移期间染色体组型中可发生自发或诱导的变化。因此，来源于所提及的细胞系的细胞可能不为与祖细胞或培养物精确相同，并且所提及的细胞系包括此类变体。当储液中存在的毒粒的至少约50%_99%或更多为具有包装基因组(即AAV载体颗粒)的rAAV毒粒时，包含AAV载体颗粒(包装的基因组)的rAAV毒粒的储液或制备物“基本不含”AAV空衣壳。优选地，AAV载体颗粒占储液中存在的毒粒的至少约75%-85%、更优选约90%，甚至更优选储液中存在的毒粒的重量的至少约95%、或甚至99%或更多，或这些范围之间的任何整数。因此，当所得储液中的约40%-约1%或更少、优选约25%-约15%或更少、更优选约10%或更少、甚至更优选约5%-约1%或更少包含空衣壳时，储液基本不含AAV空衣壳。当储液中存在的毒粒的至少约90%_99%或更多为具有包装的真正基因组(即AAV载体颗粒)的rAAV毒粒时，包含AAV载体颗粒(包装的基因组)的rAAV毒粒的储液或制备物“基本不含“AAV包衣壳的核酸杂质”。优选地，AAV载体颗粒占储液中存在的毒粒的至少约95%-98%、更优选约99%，甚至更优选储液中存在的毒粒的重量的至少约>99%或更多，或这些范围之间的任何整数。因此，当所得储液中的约10%-约1%或更少、优选约2%或更少、更优选约1%或更少、甚至更优选约O. 5%或更少包含AAV包衣壳的核酸杂质时，储液基本不含AAV包衣壳的核酸杂质。“核酸”序列是指DNA序列或RNA序列。该术语涵盖包含DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列，所述碱基类似物例如但不限于4_乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺嘌呤、吖丙啶胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧 啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶-、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、I-甲基腺嘌呤、I-甲基假尿嘧啶、I-甲基鸟嘌呤、I-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖辫苷(β-D-mannosylqueosine)、5’-甲氧基羰基甲基尿卩密唳、5-甲氧基尿卩密唳、2-甲硫基-N6-异戍烯基腺嘌呤、尿卩密唳-5-乙醇酸甲酯、尿卩密唳-5-乙醇酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2_硫胞嘧啶、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2_硫尿嘧啶、4_硫尿嘧啶、
5-甲基尿嘧啶、Buraci 1-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。“编码序列”或“编码”所选多肽的序列为一种核酸分子，其当置于合适的调节序列控制下时在体内被转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽。编码序列的范围通过5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子来确定。转录终止序列可位于编码序列的3’。术语DNA “控制序列”统指启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等，其共同供用于受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。并非全部这些控制序列需要始终存在，只要所选编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和翻译即可。术语“启动子”在本文以其普通含义使用，是指包含DNA调节序列的核苷酸区，其中所述调节序列来源于能够结合RNA聚合酶并起始下游(3’-方向)编码序列转录的基因。转录启动子可包括“诱导型启动子”(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达被分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)、“阻抑型启动子”(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达被分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)和“组成型启动子”。“可操作地连接的”是指元件的排列，其中配置如此描述的组分以便执行其通常的功能。因此，与编码序列可操作地连接的控制序列能够影响编码序列的表达。控制序列不需要与编码序列邻接，只要其起指导其表达的功能即可。因此，例如，插入的不翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间并且启动子序列仍可被认为与编码序列“可操作地连接”。出于描述本申请书各处特定的核酸分子中核苷酸序列的相对位置的目的，例如当特定的核苷酸序列被描述为位于相对于另一序列的“上游”、“下游”、“ 3 ”或“ 5 ”时，应理解的是，其是在如本领域常规地提及的DNA分子的“有义”链或“编码”链中的序列位置。术语“异源的”在其涉及核酸序列例如编码序列和控制序列时，表示通常不连接在一起的序列，和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区为另一核酸分子内或与另一核酸分子连接的核酸区段，所述另一核酸分子在自然中未发现与其它分子相关。例如，核酸构建体的异源区可包含被在自然中未发现与编码序列相关的序列侧接的编码序列。异源的编码序列的另一实例为这样的构建体，其中编码序列本身不存在于自然中(例如具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。类似地，对于本发明的目的而言，转化了通常不存在于细胞中的构建体的细胞可被认为是异源的。等位基因变异或天然存在的突变事件不产生本文所用的异源DNA。包含异源核酸的转基因可编码许多有用的产物。这些可包括例如siRNA、反义分子和miRNA。或者，转基因可编码激素和生长和分化因子，包括但不限于胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素(angiopoietin)、制管张素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子a (TGF α )、血小板衍生生长因子(TOGF)、胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II (IGF-I和IGF-II)、转化生长因子β超家族中的任何一种(包 括TGFii )、激活蛋白、抑制素、或者骨形态发生蛋白(BMP)中的任何一种(BMP 1_15)、生长因子的调蛋白(heregluin)/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族中的任何一种、神经生长因子(NGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白NT-3和NT4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、神养蛋白、聚集蛋白、脑信号蛋白/瓦解蛋白家族中的任何一种、导蛋白-I和导蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、音感刺猬蛋白(sonic hedgehog)和酪氨酸轻化酶。其它有用的转基因产物包括调节免疫系统的蛋白，包括但不限于细胞因子和淋巴因子，例如血小板生成素(ΤΡ0)、白细胞介素(IL-1至IL-17)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β、干扰素α、干扰素β和干扰素Y、干细胞因子、flk-2/flt3配体。免疫系统产生的基因产物也可用于本发明。这些包括但不限于免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、MHC I类分子和MHC II类分子，以及改造的免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因产物还包括调节蛋白例如补体调节蛋白、膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(0么的、0 1、0 2和0059。其它可用的基因产物包括可修正先天性代谢缺陷的那些。此类转基因可编码例如氨甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α -I抗胰蛋白酶、葡糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、因子V、因子VIII、因子IX、胱硫醚(cystathione) β -合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β -葡糖苷酶、丙酮酸羧酸酯(pyruvate carboxylate)、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-蛋白、囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)序列和肌营养蛋白cDNA序列。当指核苷酸序列时“分离的”意指在相同类型的其它生物大分子基本不存在的情况下存在所指分子。因此，“编码特定多肽的分离的核酸分子”是指基本不含不编码主题多肽的其它核酸分子的核酸分子；然而，所述分子可包含不会有害地影响组合物的基本特征的一些另外的碱基或部分。本发明涉及包含于AAV毒粒的纯化储液内的AAV载体相关杂质(例如空衣壳和AAV包衣壳的核酸杂质)的数量的减少或消除，且使其中包含的AAV载体颗粒损失最小化。不管其中产生rAAV毒粒的方法如何，都可使用本发明的方法。存在本领域熟知的用于产生rAAV毒粒的数种方法例如,利用载体和AAV辅助序列的转染结合与AAV辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒)之一的共感染或用重组AAV载体、AAV辅助载体和附加功能载体的转染。关于产生rAAV毒粒的方法的详细描述，参见美国专利第6，001，650号和第6，004, 797号，两者通过引用以其整体结合于本文中。rAAV毒粒的纯化
重组AAV复制(即细胞培养系统中的载体产生)之后，rAAV毒粒可使用许多常规的纯化方法例如柱层析法、氯化铯梯度法等从宿主细胞中纯化出来。例如可使用多个柱层析步·骤，例如在阴离子交换柱、亲和柱和/或阳离子交换柱上纯化。参见，例如，国际公布号WO02/12455。此外，若利用感染以表达附加功能，残留的辅助病毒可使用已知方法灭活。例如，腺病毒可通过加热至约60°C的温度达例如20分钟或更久来灭活。该处理仅使辅助病毒有效地灭活，因为AAV极其热稳定而辅助腺病毒是热不稳定的。包含许多报告基因的重组AAV载体可用于确定感染效价。例如可使用碱性磷酸酶、β_半乳糖苷酶(LacZ)、绿色荧光蛋白或萤光素酶。在收获转染的宿主细胞后，通过使用适合大规膜生产的技术(例如微射流)破碎转染的宿主细胞来形成裂解液。接着过滤裂解液(例如通过O. 45 μ m滤器)，并使用如本文所述的柱层析法纯化。也已报道其它技术以确定任何AAV载体的感染效价。参见例如Zhen等，〃An Infectious Titer Assayfor Adeno-associated Virus (AAV) Vectors with Sensitivity Sufficient to DetectSingle Infectious Events." Hum. Gene Ther. (2004) 15:709-715。将澄清的细胞裂解液使用柱层析技术进行一个或多个纯化工艺步骤技术以纯化AAV颗粒(包含真正的载体和载体相关杂质)。在优选方法中，AAV颗粒使用涉及阳离子和/或阴离子交换层析的一个或多个序贯步骤来纯化。在本发明特别优选的方法中，rAAV制备物通过经由易于可扩缩的方法裂解转染的细胞得到粗制细胞裂解液而获得。接着粗制细胞裂解液可通过本领域熟知的技术(例如过滤、离心等)澄清以移除细胞碎片，从而提供澄清的细胞裂解液。粗制细胞裂解液或澄清的细胞裂解液，包含AAV颗粒(真正的AAV载体、AAV空衣壳和AAV载体相关杂质)和一系列非AAV载体相关杂质(例如来自感染的宿主细胞的可溶性细胞组分)两者。这些可包含非所需的细胞蛋白、脂类和/或核酸，以及细胞培养基组分(例如牛血清)。将裂解液上样至第一阳离子交换柱上。所述第一阳离子交换柱起将AAV颗粒与细胞裂解液制备物中存在的细胞组分和其它组分进一步分离的作用。用于进行细胞裂解液的最初纯化的方法是已知的。一种代表性方法描述于美国专利第6，593，123号中，其通过引用以其整体结合于本文中。柱层析法的使用可实现AAV颗粒自在重组AAV载体于细胞培养中产生之后的粗制收获物中存在的大多数其它杂质的有效纯化。例如一个或多个离子交换层析步骤可顺序使用以将AAV颗粒与杂质逐步分离。阴离子交换层析树脂和阳离子交换层析树脂以及层析树脂的其它类型可以不同的组合使用，视特定的目标AAV血清型优化不同的组合。可在用于以下重组AAV血清型的纯化的单个层析步骤中使用以下层析树脂
权利要求
1.一种用于从包含AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质的AAV制备物中纯化包含编码治疗蛋白或其片段的转基因的真正的AAV载体颗粒，从而提供基本不含AAV空衣壳的AAV产物的方法，所述方法包括 a)收获包含重组AAV的细胞； b)经由切向流过滤浓缩所述细胞； c)通过微射流裂解所述细胞以形成裂解液； d)过滤，从而使步骤c)的裂解液澄清； e)通过离子交换柱层析法纯化AAV颗粒并任选通过切向流过滤浓缩柱洗脱液； f)混合所述洗脱液和氯化铯并将所述混合物进行离心； g)在步骤f)之后收集病毒颗粒并通过切向流过滤进行相同的缓冲液交换； h)用表面活性剂配制纯化的AAV颗粒以提供AAV颗粒制剂； i)过滤所述制剂以移除任何残留的杂质，其中所述AAV产物中存在的所述真正的AAV载体颗粒的量为至少95%。
2.权利要求I的方法，其中所述AAV载体颗粒以100mg/mL的浓度存在。
3.权利要求I的方法，其中步骤i)的所述AAV颗粒以IO15个颗粒/mL的浓度存在。
4.权利要求I的方法，其中步骤i)的所述AAV颗粒以IO16个颗粒/mL的浓度存在。
5.权利要求I的方法，其中步骤i)的所述AAV颗粒以IO17个颗粒/mL的浓度存在。
6.权利要求I的方法，其中所述AAV载体颗粒来源于选自以下的AAVAAVU AAV2、AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9。
7.—种AAV载体制剂，其在药学上可接受的载体中包含使用权利要求I的方法纯化的AAV颗粒。
8.权利要求I的方法，其中所述转基因编码选自以下的核酸SiRNA、反义分子、miRNA、核酶和 shRNA。
9.权利要求I的方法，其中所述转基因编码选自以下的基因产物胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、制管张素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子a (TGFa)、血小板衍生生长因子(TOGF)、胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II(IGF-I和IGF-II)、TGFi3、激活蛋白、抑制素、骨形态发生蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白NT-3和NT4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、神养蛋白、聚集蛋白、导蛋白-I和导蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、音感刺猬蛋白和酪氨酸羟化酶。
10.权利要求I的方法，其中所述转基因编码选自以下的基因产物血小板生成素(TPO)、白细胞介素(ILl至IL-17)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β、干扰素α、干扰素β和干扰素Y、干细胞因子、f lk-2/f lt3配体、IgG, IgM, IgA, IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、MHC I类分子和MHC II类分子。
11.权利要求I的方法，其中所述转基因包含编码可用于修正先天性代谢缺陷的蛋白的核酸，所述蛋白选自氨甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α -I抗胰蛋白酶、葡糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、因子V、因子VIII、因子IX、胱硫醚β -合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β -葡糖苷酶、丙酮酸羧酸酯、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、RPE65、H-蛋白、T-蛋白、囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)序列和肌营养蛋白cDNA序列。
12.权利要求11的方法，其中所述基因产物为因子VIII或因子IX。
全文摘要
本发明提供了用于制备高度纯化的AAV载体制剂的方法。本文所述非常纯的AAV制剂对于临床用途较优。
文档编号C12N7/02GK102947453SQ201180016616
公开日2013年2月27日 申请日期2011年1月25日 优先权日2010年1月28日
发明者J.F.赖特, G.屈, B.豪克, K.海 申请人:费城儿童医院