改变的抗体及其使用方法

专利名称：改变的抗体及其使用方法
技术领域：
广义上，本发明涉及包含用于治疗肿瘤疾病的改变的免疫球蛋白的改进的组合物和方法。更特别地，本发明包含具有改进的肿瘤定位以及良好的生理学特征的改变的免疫球蛋白在恶性肿瘤免疫治疗中的用途。本公开的方法和组合物特别用于治疗因化疗剂、外部辐射或放射免疫疗法所致骨髓损伤的癌症患者。
背景技术：
在过去的几十年中，罹患不同恶性肿瘤的患者已经受益于癌症治疗的进展。不幸的是，在现代疗法充分增加治愈率和存活期的同时，大多数患者还是最终死于他们的疾病。获得更佳结果的障碍在于肿瘤细胞的抗药性和现有疗法难以接受的毒性(例如骨髓毒性)，限制了最佳的细胞毒素剂量，并经常使免疫损害、虚弱和年老的患者不能接受现有疗法。在试图治疗以前经过治疗或者复发的患者时，这些限制特别明显。因此，开发低毒、高效、靶向治疗仍是挑战。
增强该治疗有效性的尝试包括使用治疗性抗体来降低不良的交叉反应并增强一种或多种细胞毒性剂的肿瘤细胞定位。利用抗体治疗肿瘤疾病的想法追溯到至少1953年，当时证明抗体可以用来特异性靶向肿瘤细胞。然而，正是Kohler和Milstein在杂种瘤技术方面的开创性工作，才能够持续供给特异性靶向特定抗原的单克隆抗体。到1979年，单克隆抗体(MAbs)已经用于治疗人类患者的恶性肿瘤。最近，已经批准三种非缀合的单克隆抗体，Rituxan，Campath和Herceptin，分别用于治疗非霍奇金氏(non-Hodgkins)淋巴瘤、CLL和乳癌。目前，许多缀合多种细胞毒性剂(例如放射性同位素或蛋白质毒素)的单克隆抗体用于与多种恶性肿瘤疾病治疗相关的临床试验。在过去的十年中，开发了大量肿瘤特异性抗体及抗体片段，将抗体与药物、毒素、放射性核素或其它物质缀合并将缀合物给予患者的方法。这些努力产生了光明的前景，但是很多不可预料的难题限制了目前开发的一些药物的诊断和治疗应用。
最难以处理的问题是由人体免疫系统自身引起的，其将靶向缀合物应答为外来抗原。例如，使用与小鼠单克隆抗体(其曾是最常用的人用靶向抗体)复合的药物或放射性核素治疗的患者，产生了循环的人抗小鼠抗体(HAMAs)，以及针对结合物抗体部分的全身性急性III型超敏反应。此外，即使在副作用最小(例如单次给药)时，循环中的HAMAs也降低了患者体内靶向剂的有效浓度，从而限制了诊断或治疗剂到达靶部位。
多种问题一直限制RIT的临床应用。最常见的是，放射性标记的单克隆抗体免疫治疗(RIT)的剂量受限于循环中放射性标记的免疫缀合物(IC)照射红骨髓内正常血细胞产生的骨髓毒性。以前经过系统化疗的患者，由于先前广泛的药物治疗而红骨髓储量减少，特别脆弱。这限制了RIT与细胞毒性药物的联合使用，已知其中很多可以促进照射的肿瘤细胞的抗肿瘤反应。例如已经证明，在小鼠肺癌异种移植模型中，联合给予131I标记的抗CEA MAb和阿霉素，增强了每种制剂的治疗效果。然而这种联合使用的毒性大于单独使用每种成分。联合使用RIT和顺铂也得到类似结果。显示与RIT协同作用的其它药物包括但不限于代谢酶抑制剂(例如MTX，Tomudex)，包括拓扑异构酶抑制剂(鬼臼毒素(podohylotoxin)如鬼臼亚乙苷(etoposide))，抗代谢物(如氟尿嘧啶)，卟啉(德克萨斯卟啉钆(gadolinium-texaphyrin))或DNA intercolators(如蒽环类、喜树碱等)。
另外，具有广泛骨髓转移的癌症患者，红骨髓受到邻近由放射性标记的IC靶向的肿瘤细胞的另外照射，因而特别危险。例如，使用钇标记的Zevalin或者131I标记的Bexxar治疗的非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)患者以及使用Lym-1治疗的慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者，具有严重的骨髓转移，比未累及骨髓的患者更容易产生剂量限制性毒性。因此，这些患者群体在联合使用细胞毒药物治疗时，会进一步增加骨髓毒性的风险。
增强RIT治疗效果的一种方法应该增加RIT的给药剂量，从而增加由MAb传递或靶向到肿瘤上的同位素数量。先前的研究使用酶消化或遗传工程的MAb片段，其与靶向的肿瘤细胞保持高亲和力，并从血液中快速清除以降低对骨髓的毒性。例子包括单价(如scFV和Fab片段)和多价(如F(ab’)2，反向F(ab’)2和双链Fv片段)抗体片段。在小鼠动物模型和人体临床实验中已经证明，这些构建体与传统的IC相比，都能快速从血液中清除。快速的血液清除伴随着降低的骨髓照射以及低水平的毒性。不幸的是，与传统的完整MAb相比，这种构建体也更快速地从肿瘤上清除，将同位素靶向到肿瘤群体上的能力较低。因此，使用MAb片段与抗癌药物联合治疗所具有的快速血液清除和低毒性的潜在优势，皆因其不能有效将同位素靶向到肿瘤位点而抵消。
因此，本发明的目的之一在于提供可用于靶向肿瘤细胞的低毒性化合物。
本发明另一目的在于提供可有效用于治疗骨髓抑制患者的化合物。
发明概述本发明提供的这些及其它目的，广义上涉及治疗肿瘤疾病的方法、化合物和组合物。为此，本发明提供了可用于治疗罹患各种癌症患者的改变的抗体。在这方面，本发明改变的抗体或免疫球蛋白令人吃惊地发现具有特别用于治疗骨髓抑制患者的生物化学特征。更特别地，意外发现此处所述改变的抗体在提供有效的肿瘤定位的同时，可以快速从血液中清除。因此，本公开的化合物可用于充分降低与常规免疫缀合物非特异性分布有关的毒性，而仍然在肿瘤部位提供治疗有效水平的所选择的细胞毒素。当改变的抗体用作放射性免疫缀合物时尤其如此。
因此，本发明的一个重要方面包含改变的抗体作为放射性免疫缀合物在治疗肿瘤疾病中的用途。即，改变的抗体可结合治疗性放射性同位素如90Y或131I，并给予罹患任一癌症的患者。本公开化合物的惊人特性(即快速的血液清除和有效的肿瘤定位)充分降低了对健康器官(特别是骨髓)的相关毒性，而直接将治疗有效剂量传递给肿瘤。这种表现出的骨髓毒性下降使本发明特别用于治疗骨髓抑制或其它骨髓损伤的患者。
骨髓抑制是化学治疗例如放射或给予毒性药物很常见的副作用。因此，本发明另一重要方面在于，本公开的化合物(有或无结合的放射性同位素)结合化疗或放射的用途。特别用于那些复发或先前经过化疗而致骨髓抑制状态的患者。在这些患者中(以及经常在相对健康的患者中)，放射性标记抗体的剂量限制性毒性是循环中的放射性同位素照射正常骨髓细胞所致骨髓毒性。本发明降低了这种照射及相应的毒性，从而能更有效、更高的剂量给药。然而，不同于现有技术降低毒性的化合物，本发明改变的抗体仍显示有效的肿瘤定位，从而更有益于患者。
更应理解，上述特性使得本发明的化合物和组合物特别适于诊断方法，例如肿瘤的放射成像(radioimaging)。即，本发明改变的抗体可以结合诊断用放射性同位素(即111In)，用于诊断或监控肿瘤或其它的疾病。在这方面，快速清除未结合的改变的抗体以及高效快速的肿瘤定位，将提供信噪比大大好于常规放射成像剂的增强的影像。当然本领域技术人员很容易确定何种类型的成像(例如MRI、放射成像、超声等)以及何种特定成像剂能够与此处公开的化合物有效使用。
本领域技术人员考虑到以下详述的优选说明性实施方案，显而易见本发明的其它目的、特征和优点。
附图简述

图1A和1B分别显示完整C2B8重链的氨基酸序列以及衍生的结构域缺失的C2B8构建体(其中缺失CH2结构域)的氨基酸序列。
图2A和2B分别显示完整C2B8重链的核苷酸序列以及衍生的结构域缺失的C2B8构建体(其中缺失CH2结构域)的核苷酸序列。
图3A和3B分别显示C2B8轻链的核苷酸序列以及该轻链对应的氨基酸序列。
图4A和4B分别显示huCC49结构域缺失的重链(其中缺失CH2结构域)的氨基酸序列以及该重链对应的核苷酸序列。
图5A和5B分别显示huCC49轻链的核苷酸序列以及该轻链对应的氨基酸序列。
图6A和6B分别显示完整C5E10重链的氨基酸序列以及衍生的结构域缺失的C5E10构建体(其中缺失CH2结构域)的氨基酸序列。
图7A和7B分别显示完整C5E10重链的核苷酸序列以及衍生的结构域缺失的C5E10构建体(其中缺失CH2结构域)的核苷酸序列。
图8A和8B分别显示C5E10轻链的核苷酸序列以及该轻链对应的氨基酸序列。
图9是不同放射性同位素标记的完整huCC49和huCC49.ΔCH2在LS147T带瘤小鼠中的血液清除速率图。
图10A，10B和10C分别是放射性同位素标记的完整C2B8、C2B8.F(ab’)2和C2B8.ΔCH2在小鼠Daudi(CD20+)肿瘤异种移植模型中测定的血液清除和肿瘤定位速率图。
图11表明与单独使用抗肿瘤剂比较，联合使用放射性标记的huCC49.ΔCH2和鬼臼亚乙苷产生的协同特性。
发明详述尽管本发明可以体现为多种不同形式，此处公开的是用于举例说明本发明实质的特定说明性实施方案。应当强调，本发明并不限于所说明的特定实施方案。
本发明至少部分依据以下事实，对肿瘤细胞相关抗原具有免疫反应性的抗体可以修饰或改变，以便在用于骨髓抑制患者的治疗方案时，提供增强的生物化学特征并提高效率。改变的抗体优选与细胞毒性剂(例如放射性核素或抗肿瘤剂)结合。在这方面令人惊奇地发现，本发明改变的抗体可有利地用于为红骨髓储量减少的患者提供放射性免疫治疗。更特别的是，本发明改变的抗体似乎显示出相对于具有相同结合特异性的完整抗体更有效的肿瘤定位以及更短的血清半寿期。因此，其特别用于靶向细胞毒素(例如放射性核素)到恶性细胞或肿瘤上，同时使对正常细胞(如血细胞)的不必要照射减至最小。这种提高的效力使得可以更积极地治疗骨髓抑制患者(例如过去或正在经受化疗的患者)的恶性肿瘤。
此处所用术语“改变的抗体”是指与肿瘤相关抗原具有免疫反应性的任何抗体、或结合片段或其重组体，其中一个或多个恒定区结构域的至少一个部分缺失或改变，以提供所需的生物化学特征，例如与具有大致相同结合特异性的完整的、未改变的抗体相比，增强的肿瘤定位或者减少的血清半寿期。在优选实施方案中，本发明改变的抗体缺失至少一个恒定结构域的一部分。为了本公开内容，这样的构建体称为“结构域缺失”。优选缺失改变的抗体恒定区的一个完整结构域，更优选缺失完整的CH2结构域。如下文详述，容易利用众所周知的方法，从完整的前体或者亲本抗体制备或构建所需的每种变体。
本领域的技术人员应当理解，本发明的化合物、组合物和方法可用于治疗任何具有肿瘤相关抗原的肿瘤疾病、肿瘤或恶性肿瘤。如上所述，本发明改变的抗体与一种或多种的肿瘤相关抗原免疫反应。即，本公开的改变的抗体的抗原结合部分(即可变区、或免疫反应性片段或其重组体)可结合恶性肿瘤处选定的肿瘤相关抗原。考虑到报道的肿瘤相关抗原的数目以及相关抗体的数目，本领域技术人员应当理解，此处公开的改变的抗体因而可来自于许多完整抗体中的任何一种。更一般而言，本发明所用改变的抗体可得自或来自与肿瘤相关抗原反应的任何抗体(包括过去文献中报道的)。另外，用于产生本公开的改变的抗体的亲本或前体抗体、或其片段，可以是小鼠的、人的、嵌合的、人源化的、非人灵长类的或灵长类源化的。在其它优选实施方案中，本发明改变的抗体可包含具有此处所述改变的恒定结构域的单链抗体构建体(例如美国专利号5,892.019中所公开，此处引入供参考)。因此，按照此处说明所改变的任何这些抗体类型，均符合本发明。
此处所用“肿瘤相关抗原”表示通常与肿瘤细胞相关的任何抗原，即在其上存在或与正常细胞相比达到更大程度。更一般而言，肿瘤相关抗原包含在肿瘤细胞上为免疫反应性抗体提供定位的任何抗原，而不管其在非恶性细胞上的表达。这种抗原可能具有相对的肿瘤特异性，其表达限于恶性细胞表面，或者显示其在恶性群体细胞表面的表达比非恶性组织提高。与CEA、MUC-1和TAG-72反应的单克隆抗体即是实例。另外，这些抗原在恶性细胞或者非恶性细胞中均可以组成型表达。例如，CD20是在恶性细胞和非恶性细胞表面均有发现的pan B抗原，已经证实是免疫治疗抗体治疗非霍奇金氏淋巴瘤的非常有效的靶物。在此方面，pan T细胞抗原例如CD2、CD3、CD5、CD6和CD7也包含本发明意义上的肿瘤相关抗原。其它典型的肿瘤相关抗原包含但不限于MAGE-1、MAGE-3、HPV16、HPV E6 & E7、L6-抗原、CD19、CD22、CD37、HLA-DR、EGF受体和HER2受体。在许多情况下，文献中已经报道了这些抗原中每一个的免疫反应性抗体。本领域技术人员应当理解，这些抗体中的每一个都可能作为符合本发明的改变的抗体的前体。
本发明改变的抗体优选结合并连接上述肿瘤相关抗原。因此，如下文某些细节所述，本发明改变的抗体可以从与肿瘤相关抗原反应的任何一种抗体中衍生、形成或制备。在优选实施方案中，使用通常的遗传工程方法衍生出改变的抗体，使一个或多个恒定区结构域的至少一个部分缺失或改变，以获得所需的生物化学特征，例如降低的血清半寿期。更特别而言，如下文例示，本领域技术人员容易分离本发明抗体可变和/或恒定区对应的遗传，并缺失或改变适当的核苷酸，以提供本发明的改变的抗体。更应理解，利用已经建立的方法，可以在临床和商用规模表达并制备这些改变的抗体。
在选择的实施方案中，本发明所用改变的抗体来自肿瘤相关抗原的已知抗体。通过获得亲本抗体的核苷酸或者氨基酸序列，如此处所述进行修饰改造，这很容易实现。在其它实施方案中，可能只需要使用已知抗体的抗原结合区(例如可变区或者补体决定区)，并与改变的恒定区结合，以产生所需的改变的抗体。可以通过类似方法产生相容的单链构建体。在任何情况下，应当理解也可以如本领域所常见，改造本发明的抗体，以提高亲和力或降低免疫原性。例如，本发明改变的抗体可以从人源化或嵌合的抗体衍生或制备。因此，符合本发明的改变的抗体可以来自和/或包含天然存在的小鼠、灵长类(包括人)或其它哺乳动物的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、灵长类源化抗体、双特异性抗体或单链抗体构建体以及每种类型的免疫反应性片段。
上文提及，可以如此处所述改变先前报道的与肿瘤相关抗原反应的抗体，以提供本发明的改变的抗体。可以用来提供抗原结合区、形成或衍生本公开改变的抗体的典型抗体包括但不限于，Y2B8和C2B8(ZevalinTM& Rituxan，IDEC Pharmaceuticals Corp.，SanDiego)，Lym 1和Lym 2(Techniclone)，LL2(ImmunomedicsCorp.，New Jersey)，HER2(Herceptin，Genentech Inc.，South San Francisco)，B1(Bexxar，Coulter Pharm.，SanFrancisco)，MB1，BH3，B4，B72.3(Cytogen Corp.)，CC49(National Cancer Institute)和5E10(University of Iowa)。在优选实施方案中，本发明的改变的抗体结合与上文刚刚列举的抗体相同的肿瘤相关抗原。在特别优选的实施方案中，改变的抗体来自Y2B8、C2B8、CC49和C5E10或结合与其相同的抗原，更优选将包含结构域缺失的抗体(即ΔCH2抗体)。如下文讨论和实施例中所见，这种改变的抗体特别用于治疗骨髓抑制患者或用于联合化疗。
在第一个优选实施方案中，改变的抗体与Rituxan结合相同的肿瘤相关抗原。Rituxan(也称为Rituximab，IDEC-C2B8和C2B8)是第一个FDA批准的用于治疗人B细胞淋巴瘤的单克隆抗体(参见美国专利号5,843,439；5,776,456和5,736,137，均在此引入供参考)。Y2B8是C2B8的小鼠亲本。Rituxan是嵌合的抗CD20的单克隆抗体(MAb)，它可以抑制生长，据报道它可以使某些淋巴瘤细胞系对化疗剂体外引起的细胞凋亡更敏感。该抗体有效结合人的补体，具有强的FcR结合，在体外可以通过补体依赖(CDC)以及抗体依赖(ADCC)的机制有效杀伤人淋巴细胞(Reff等人，Blood 83435-445(1994))。本领域技术人员应当理解，根据本发明改变的C2B8或Y2B8的变体，可以以缀合或未缀合的形式用于有效治疗呈现CD20+恶性肿瘤的患者。更一般而言，应当理解此处公开的改变的抗体可能以“裸的”或未缀合状态、或缀合细胞毒性剂的状态使用，以有效治疗任何一种瘤形成疾病。
在本发明的其它优选实施方案中，改变的抗体来自CC49或结合与其相同的肿瘤相关抗原。前已述及，CC49结合肿瘤相关抗原TAG-72，TAG-72与人源的某些肿瘤细胞表面结合，特别是LS174T肿瘤细胞系。LS174T[美国典型培养物保藏中心(此处记为ATCC)No.CL188]是LS180(ATCC No.CL 187)结肠腺癌细胞系的变种。
更应理解，已经开发了众多具有TAG-72结合特异性的小鼠单克隆抗体。这些单克隆抗体之一称作B72.3，是杂交瘤B72.3(ATCC No.HB-8108)产生的小鼠IgG1。B72.3是利用人乳癌提取物作为免疫源产生的第一代单克隆抗体(参见Colcher等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，783199-3203(1981)；以及美国专利号4,522,918和4,612,282，均在此引入供参考)。针对TAG-72的其它单克隆抗体称为“CC”(为结肠癌)。如Schlom等人所述(U.S.P.N 5,512,443，在此引入供参考)，CC单克隆抗体是利用B72.3纯化的TAG-72制备的第二代小鼠单克隆抗体家族。由于其对TAG-72的结合亲和力相对较好，下列CC抗体保藏于ATCC，一直要求限制使用CC49(ATCCNo.HB 9459)；CC83(ATCC No.HB 9453)；CC46(ATCC No.HB9458)；CC92(ATCC No.HB 9454)；CC30(ATCC No.HB 9457)；CC11(ATCC No.HB 9455)和CC15(ATCC No.HB 9460)。U.S.P.N5,512,443进一步指明，公开的抗体可以通过替换改变为其嵌合形式，例如利用本领域已知的重组DNA技术将小鼠的恒定区替换为人的恒定区(Fc)。除了公开小鼠及嵌合的抗TAG-72抗体，Schlom等人还制备了PCT/US99/25552中公开的人源化CC49抗体的变体，以及美国专利号5,892,019中公开的单链构建体，均在此引入供参考。本领域技术人员应当理解，前述每种抗体、构建体或重组体、及其变体都可以根据本发明进行改变并使用。
除了上述抗TAG-72抗体，不同小组也报道了结构域缺失的CC49和B72.3抗体的构建及部分特征(例如Calvo等人CancerBiotherapy，8(1)95-109(1993)，Slayin-Chiorini等人Int.J.Cancer 5397-103(1993)以及Slavin-chiorini等人Cancer.Res.555957-5967(1995))。应当理解，这些公开的构建体提供了符合本发明的方法和组合物的改变的抗体。所引用的参考文献表明，结构域缺失的构建体与完整的亲本抗体相比，其清除时间加快，但未能如本申请所述，暗示公开的构建体对经受过或正在经受化疗的骨髓抑制患者的治疗证明特别有效。另外，这些参考文献似乎提出，构建体的快速清除使其特别用于诊断方法，而非用于本发明所提供的联合化疗方案。
本发明的其它优选实施方案还包含来自C5E10或与其结合相同肿瘤相关抗原的改变的抗体。如共同未决申请U.S.P.N 6,207,805所述，C5E10是识别似乎对前列腺肿瘤细胞系(例如DU145，PC3或ND1)特异的约115kDa糖蛋白决定簇的抗体。因此，根据本发明，能够制备特异性结合由C5E10抗体所识别的相同肿瘤相关抗原的改变的抗体(例如CH2结构域缺失抗体)，并以缀合或未缀合形式用于治疗肿瘤疾病。在特别优选的实施方案中，改变的抗体来自或包含由ATCC登录号PTA-865的杂交瘤细胞系分泌的C5E10抗体的全部或部分抗原结合区。获得的改变的抗体然后如下文所述缀合放射性核素，并按照此处方法给予罹患前列腺癌的患者。
除了上述抗体，还提供来自或包含利用免疫接种和常用的免疫学技术得到的新抗体的抗原结合区的改变的抗体。利用本领域已知的方法，优选在哺乳动物中通过皮下或腹膜内多次注射相关抗原(例如纯化的肿瘤相关抗原或包含该抗原的细胞或细胞提取物)和佐剂产生抗体。该免疫接种一般引起免疫应答，包含从活化的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应活性的抗体。尽管可以从动物血清中收集所得抗体以提供多克隆制剂，但通常需要从脾、淋巴结或外周血中分离单个淋巴细胞以提供单克隆抗体(MAbs)的均一制剂。优选从脾中获得淋巴细胞。
在此众所周知的程序(Kohler等人，Nature，256495(1975))中，来自注射抗原的哺乳动物的相对短命或常寿的淋巴细胞，与永生的肿瘤细胞系(例如骨髓瘤细胞系)融合，从而形成永生的并能够产生B细胞遗传编码的抗体的杂交细胞或“杂交瘤”。得到的杂交细胞经过筛选、稀释并重新生长，分离为单个遗传株，每株包含形成单个抗体的特定基因。它们因而产生抗目标抗原的均一抗体，鉴于其纯的遗传起源，称为“单克隆”。
如此制备的杂交瘤细胞接种并生长于优选包含抑制未融合亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质的合适培养基。本领域技术人员应当理解，用于杂交瘤形成、筛选和生长的试剂、细胞系和培养基可以从多种来源商业获得，标准方法已经建立。通常，生长杂交瘤细胞的培养基需分析其产生抗目标抗原的单克隆抗体。优选利用免疫沉淀或者体外分析，例如放射性免疫分析实验(RIA)或酶联免疫吸附测试(ELISA)，测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。在确定杂交瘤细胞产生所需特异性、亲和力和/或者活性的抗体以后，将克隆通过有限稀释方法进行亚克隆，并按照标准方法生长(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，59-103页(Academic Press，1986))。更应理解，利用常规纯化方法，例如Protein A、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，可以从培养基、腹水或血清中分离亚克隆分泌的单克隆抗体。
在其它相似的实施方案中，利用常规方法(例如使用能够与编码小鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，可以很容易分离并测序编码目的单克隆抗体的DNA。分离并亚克隆的杂交瘤细胞作为该DNA的优选来源。DNA一旦分离，便可以插入表达载体，然后转染不产生免疫球蛋白的原核或真核宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。更特别而言，分离的DNA(可如上所述进行改变)可用于克隆供制备抗体的恒定和可变区序列，如Newman等人，U.S.P.N5,658,570所述，在此引入以供参考。这一般需要从所选细胞中提取RNA，转变为cDNA，再利用IgG特异性引物通过PCR扩增。如下文详述，表达目的抗体的转化细胞可以较大量生长，以提供临床及商用免疫球蛋白。
本领域技术人员还应理解，编码抗体或抗体片段的DNA也可以来自抗体噬菌体文库，例如EP368 684 B1和U.S.P.N 5,969.108所述，均在此引入以供参考。若干出版物(例如Marks等人，Bio/Technology 10779-783(1992))已经描述了通过链改组以及联合感染和体内重组策略构建大的噬菌体文库，制备高亲和力的人抗体。这些方法提供了传统杂交瘤技术之外的不同选择，以分离然后克隆单克隆抗体，同样明确位于本发明范围之内。
本发明的其它实施方案还包含在不能生成内源性免疫球蛋白的转基因动物(如小鼠)中产生大量人抗体(例如参见美国专利号6,075,181，5,939,598，5,591,669和5,589,369，均在此引入以供参考)。例如，已经描述纯合缺失嵌合及种系突变小鼠的抗体重链连接区，引起内源性抗体生成完全抑制。将人免疫球蛋白的基因阵列转入该种系突变小鼠中，将使其在抗原激发下产生人的抗体。共同拥有的、共同未决申请美国专利5,811,524公开了利用SCID小鼠产生人抗体的另一优选方法，在此引入以供参考。应当理解，与这些人抗体有关的遗传物质也可如此处所述进行分离和操作。
Newman，Biotechnology，101455-1460(1992)公开了产生重组抗体的另一高效方法。具体而言，该技术可以产生包含猴可变区和人恒定序列的灵长类源化抗体。此参考文献在此全文引入以供参考。此外，共同转让美国专利5,658,570、5,693,780和5,756,096也描述了该技术，均在此引入以供参考。
本说明书显而易见，可以从多种不同来源获得用于产生本发明的改变的抗体的遗传序列。例如，如上文广泛所述，以可公开获取的保藏物形式可以得到许多人抗体基因。已经公布了许多抗体和抗体编码基因的序列，可以如前所述从这些序列中合成合适的抗体基因。另外，可以利用熟练技术人员所熟知的技术选择并培养产生抗体的细胞系。许多实验室手册和原始出版物都描述了这种技术。在这方面，如下所述适于本发明使用的技术描述于Current Protocols inImmunology，Coligan等人，Green Publishing Associates andWiley-Interscience，John Wiley and Sons，New York(1991)，在此全文(包括附录)引入以供参考。
更应理解，本发明的范围包括此处所述DNA序列的所有等位基因、变异体和突变体。
众所周知，可以利用标准技术，例如异硫氰酸胍抽提然后离心沉淀或层析，从原始杂交瘤细胞或其它转化细胞中分离RNA。如果需要，可以利用标准技术，例如OligodT纤维素层析，从总RNA中分离mRNA。适用于此目的的技术为本领域所熟悉，并描述于上述参考文献中。
可以根据熟知的方法，利用反转录酶和DNA聚合酶同时或分别合成编码抗体轻链和重链的cDNA。可利用共有恒定区引物或基于发表的重链和轻链DNA和氨基酸序列设计的更特异性引物起始。如上所述，也可使用PCR分离编码抗体轻重链的DNA克隆。在此情况下，可以利用共有引物或较大的同源性探针(例如小鼠恒定区探针)筛选文库。
可以按照前文与重组DNA技术相关的文献详述的众所周知的标准技术，从此处所述细胞中分离DNA、一般为质粒DNA，进行限制性图谱分析并测序。当然，可以在分离过程或随后的分析中的任何时候，根据本发明改变DNA。
此处公开了优选的抗体序列。符合本发明这一方面的寡核苷酸合成技术为熟练技术人员所公知，并可以利用多种可购买到的自动合成仪中任何一种进行。另外，可以通过商业DNA合成提供商的服务得到此处公开的编码几种类型重链和轻链的DNA序列。可以变更或改变利用前述任何方法得到的遗传物质，以提供符合本发明的抗体。
尽管根据本发明可以获得并改变多种不同类型的抗体，本发明的改变的抗体具有各种共同的特性。为此，术语“免疫球蛋白”应该是指四聚体(2个重链和2个轻链)或其聚集体，无论其是否具有任何相关的特异免疫活性。“抗体”是指对抗原(例如肿瘤相关抗原)具有显著已知的特异免疫活性的分子，其包含其间有或没有共价连接的轻链和重链。如上所述，根据本发明“改变的抗体”是指抗体、或其免疫反应性片段或重组体，其中缺失或改变一个或多个恒定区的至少一个部分，以提供所需的生物化学特征，例如与具有大致相同的免疫原性的完整的未改变抗体相比，具有增强的肿瘤定位或降低的血清半寿期。为了本发明目的，改变或缺失的恒定区结构域的免疫反应性单链抗体构建体也可以认为是改变的抗体。如上所述，本发明优选的改变的抗体缺失一个恒定结构域的至少一个部分。更优选缺失改变的抗体恒定区的一个完整结构域，进一步优选缺失整个CH2结构域。
对脊椎动物系统基本免疫球蛋白结构的理解相对清楚。如下文所详述，一般术语“免疫球蛋白”包含在生物化学上可以区分的五种不同类型的抗体。尽管所有五种类型都明确包括在本发明的范围之内，下文所述一般是指IgG类型的分子。就IgG而言，免疫球蛋白包含两条分子量约为23,000道尔顿的相同的多肽轻链和两条分子量约为53,000-70,000道尔顿的相同的重链。四条链通过二硫键连接成“Y”形，其中轻链从“Y”的开口一直到可变区与重链在一起。
更具体而言，轻链和重链都分成结构区和功能同源区。术语“恒定”和“可变”用于功能上。在这方面应当理解，轻链(VL)和重链(VH)的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1，CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物学特性，例如分泌、穿胎盘移动性，Fc受体结合、补体结合等。按照常规，恒定区结构域的数目增加，则更远离抗体的抗原结合位点或氨基端。这样，CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
轻链分为kappa或者lambda(κ，λ)。每一类重链都可结合κ或者λ轻链。一般而言，杂交瘤、B细胞或遗传工程的宿主细胞产生的免疫球蛋白，轻链和重链彼此共价连接，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键结合。然而，如果链之间能够按正确的几何学有效地非共价结合，非二硫键连接链的聚集体仍然能够与抗原反应。重链氨基酸序列从位于“Y”形叉端的N端一直到每条链底部的C端。N端为可变区，C端为恒定区。本领域技术人员应当理解，重链分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ，μ，α，δ，ε)，其中还有一些亚类。正是这些链的本质决定抗体的类型分为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。免疫球蛋白亚类(亚型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等的特征清楚，并已知其赋予专门的功能。熟练技术人员根据此处公开内容，容易识别其中每种类型和亚型的变体，因此其均属于本发明的范围之内。
如上所示，可变区使抗体选择性识别并特异性结合免疫反应性抗原的表位。即，抗体的VL结构域与VH结构域相结合，形成确定三维抗原结合位点的可变区。这种四聚体抗体结构在其Y的每条臂的末端提供抗原结合位点。更具体而言，由每条VH和VL链的三个互补决定区(CDRs)确定抗原结合位点。
假定抗体在水相环境中形成三维构型，这六个CDRs是特定定位形成抗原结合位点的短的、不相连的氨基酸序列。重链和轻链可变结构域其余部分的氨基酸序列显示很低的分子间变异性，称为框架区。框架区主要采用β片层构象，CDRs形成环状连接，有时形成部分β片层结构。因此，这些构架区形成支架，通过链间非共价作用使六个CDRs在正确方向上定位。在任何情况下，由定位的CDRs形成的抗原结合位点确定一个与免疫反应性抗原的表位互补的表面。该互补表面促进了抗体和免疫反应性抗原表位的非共价结合。
为了本发明应当理解，本公开的改变的抗体可包含供抗体与所选肿瘤相关抗原结合的任何类型的可变区。在这方面，可变区可包含或来自于可诱导产生体液应答并产生抗目的肿瘤相关抗原的免疫球蛋白的任何类型哺乳动物。因此，改变的抗体的可变区可能来源于例如人、小鼠、非人灵长类(如猕猴、恒河猿等)或狼(lupine)。在特别优选的实施方案中，改变的免疫球蛋白的可变区和恒定区都是人的。在其它选择的实施方案中，可以改造或特制相容抗体(通常是非人来源的)的可变区，以提高结合特性或降低分子的免疫原性。在此方面，用于本发明的可变区可以人源化或通过包含引入的氨基酸序列而改变。
“人源化抗体”是指非人来源的抗体，一般是小鼠抗体，其保持或基本保持亲本抗体的抗原结合特性，但对人的免疫原性较低。可以利用各种方法实现，包括(a)将整个非人可变结构域移植到人的恒定区，产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人互补决定区(CDRs)的至少一部分移植到人的构架和恒定区，保留或不保留关键的构架残基；或(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基利用类人部分来“遮蔽”。该方法公开于Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-5(1984)；Morrison等人，Adv.Immunol.4465-92(1998)；Verhoeyen等人，Science 2391534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31169-217(1994)以及美国专利5,585,089，5,693,761和5,693,762，均在此全文引入以供参考。
本领域技术人员应当理解，上文选项(a)所示技术将产生“典型的”嵌合抗体。在本发明上下文中，术语“嵌合抗体”是指其中免疫反应区或位点得自或来源于第一个物种、而恒定区(可以是完整的、部分的或根据本发明改变的)得自另一个物种的任何抗体。在优选实施方案中，抗原结合区或位点是非人来源的(例如小鼠)，而恒定区是人的。尽管可变区的免疫原性特异性一般不受其来源影响，与非人来源的恒定区相比，人的恒定区不大可能引发人的免疫应答。
优选地，通过至少部分替换一个或多个CDRs，如有必要，替换部分框架区并改变序列，从而改变重链和轻链的可变区。虽然CDRs可以来自与框架区所来源的抗体相同类型甚或亚类的抗体，但是CDRs可来自不同类型的抗体，优选来自不同物种的抗体。必须强调，利用来自供体可变区的完整CDRs替换所有的CDRs，以将一个可变结构域的抗原结合能力转移到另一个，这是不必要的。相反，只需转移那些为保持抗原结合位点的活性所必需的残基。根据美国专利5,585,089、5,693,761和5,693,762的所述说明，本领域技术人员能通过常规实验抑或通过尝试与错误试验获得免疫原性降低的功能性抗体。
本领域技术人员应当理解，不管可变区如何变化，本发明的改变的抗体包含抗体或其免疫活性片段，其中一个或多个恒定区结构域的至少一个部分被缺失或改变，以提供所需的生物化学特征，例如与包含天然或未改变的恒定区、免疫源性大致相同的抗体相比，具有增强的肿瘤定位或降低的血清半寿期。在优选实施方案中，改变的抗体的恒定区包含人的恒定区。符合本发明的恒定区的改变包含添加、缺失或替换一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸。即，此处公开的改变的抗体可包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)中的一个或多个和/或轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。如下文详述及实施例所示，本发明优选实施方案包含其中一个或多个结构域部分或完全缺失的改变的恒定区。在特别优选的实施方案中，改变的抗体包含结构域缺失的构建体或变体，其中去除了整个CH2结构域(ΔCH2构建体)。在其它优选实施方案中，由短的氨基酸间隔区(例如10个残基)替换所去除的恒定区结构域，以提供一般由缺失的恒定区产生的某些分子柔性。
如上所指，不同免疫球蛋白类型的恒定区的亚基结构和三维构象是已知的。例如，人IgG Fc区的CH2结构域一般从按常规编号方法的231残基延伸到340残基。CH2结构域的特征在于不与其它结构域严格配对。此外，两条N-连接的分支糖链插入完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。已经清楚证明，CH3结构域从CH2结构域延伸到IgG分子的C端，包含大约108个残基，而IgG分子的铰链区将CH2结构域与CH1结构域相连。这个铰链区包括大约25个残基，是柔性的，从而允许两个N端抗原结合区自由移动。
除构象以外，本领域已知恒定区介导一些效应器功能。例如，将补体的C1成分与抗体结合，活化补体系统。补体活化在调理作用和细胞病原体的裂解中非常重要。补体活化也刺激炎症反应，可能还涉及自身免疫过敏反应。另外，抗体通过Fc区与细胞结合，是利用抗体Fc区的Fc受体位点结合细胞的Fc受体(FcR)。有很多特异性针对不同抗体类型的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(eta受体)、IgA(α受体)和IgM(mu受体)。抗体与细胞表面Fc受体的结合引发许多重要的多种生物学反应，包括内吞和破坏抗体包被的颗粒、清除免疫复合物、通过杀伤细胞裂解抗体包被的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、释放炎症介质、胎盘转移以及控制免疫球蛋白合成。虽然对多种Fc受体和受体位点已经进行了一些研究，关于其定位、结构和功能仍很不了解。
不限制本发明的范围，相信包含如此处所述改变的恒定区的抗体提供改变的效应器功能，并依次影响所给予抗体的生物学特征。例如，缺失或失活(通过点突变或其它方法)恒定区结构域可以降低循环中改变的抗体与Fc受体的结合，从而增强肿瘤定位。在其它情况下，符合本发明的恒定区的改变可减缓补体结合，从而降低血清半寿期以及与缀合的细胞毒素的非特异性结合。恒定区的其它改变可用于消除二硫键的连接或寡糖成分，因提高抗原特异性和抗体柔性而增强定位。更一般而言，本领域技术人员应当了解，此处所述改变的抗体可能产生很多已知或未知的微妙作用。然而，如以下实施例所述，利用公知的免疫学技术无需过多实验，很容易测定和定量该改变所引起的生理学特性、生物可利用度以及其它生物化学效应，例如肿瘤定位和血清半寿期。
类似的，熟练技术人员利用公知的生物化学和分子工程技术，容易进行符合本发明的恒定区的改变。在这方面，所附实施例提供了具有按照本发明改变的恒定区的各种构建体。更具体而言，示例的构建体包含具有改造为缺失CH2结构域的人恒定区的嵌合及人源化抗体。本领域技术人员应当理解，因CH2结构域对抗体代谢速率具有调节特性而特别优选此种构建体。
实施例和附图所示ΔCH2结构域缺失的抗体，来自对CD20 pan B细胞抗原具有免疫特异性的嵌合C2B8抗体以及特异性针对TAG-72抗原的人源化CC49抗体。如下文详述，两种结构域缺失的构建体都来自编码人IgG1恒定结构域的专门载体(IDEC Pharmaceuticals，San Diego)。本质上，将该载体改造为缺失CH2结构域，得到可表达结构域缺失的IgG1恒定区的改变的载体。然后将编码小鼠C2B8抗体可变区或人源化CC49抗体可变区的基因插入该改造的载体中并克隆。在转化细胞中表达时，这些载体分别产生huCC49.ΔCH2或C2B8.ΔCH2。如此处所示，这些构建体显示出很多特性，使其成为特别引人注目的候选药物，用于骨髓抑制的癌症患者，或用于正在经受有骨髓抑制可能的联合治疗的癌症患者。
应当注意，前述示例的构建体被改造为CH3结构域直接融合各个改变的抗体的铰链区。其它构建体可能需要在铰链区和改变的CH2和/或CH3结构域之间提供肽间隔区。例如可以表达类似的构建体，其中CH2结构域缺失，剩下的CH3结构域(改变或未改变的)通过5-20个氨基酸的间隔区与铰链区相连。在这方面，优选的间隔区具有氨基酸序列IGKTISKKAK(Seq.ID No.1)。例如，可以添加这样的间隔区，以保证恒定区的调节元件保持自由并可以接近、或铰链区保持柔性。然而应当注意，在某些情况下证实氨基酸间隔区具有免疫原性，引发不必要的针对构建体的免疫应答。因此，优选添加到构建体的任何间隔区均相对没有免疫原性，或者如果可以保持该改变的抗体的所需生物化学性质，则更优选完全忽略。
应当理解，除缺失全部恒定区结构域以外，本发明的抗体可通过部分缺失或替换几个或单个氨基酸而提供。例如，在CH2结构域的选定区域中突变单个氨基酸，可能足以充分降低Fc的结合，从而增强肿瘤定位。类似地，可能需要仅仅缺失控制所要调节的效应器功能(例如补体CLQ结合)的一个或多个恒定区结构域的一部分。恒定区的这种部分缺失可以改进抗体的选定特性(血清半寿期)，并使与该恒定区结构域完整有关的其它所需功能保持不变。此外，如上文提及，通过突变或替换可增强所得构建体性能的一个或多个氨基酸，可以改变本公开抗体的恒定区。在这方面，有可能破坏由保守的结合位点提供的活性(例如Fc结合)，同时基本保持改变的抗体的构型和免疫原性特征。在其它优选实施方案中，可以包含在恒定区添加一个或多个氨基酸，以增强所需的特征(例如效应器功能)、或提供更高的细胞毒性、或附着糖类。在这些实施方案中，可能需要插入或复制来自所选恒定区结构域的特定序列。
为了提供上述改变的抗体而操作所分离的遗传物质以后，将基因插入用于引入宿主细胞的表达载体中，用来产生所需数量的改变的抗体。
此处为了本说明书和权利要求书的目的使用术语“载体”或“表达载体”，是指按照本发明使用的载体，作为在细胞中引入并表达目的基因的运载工具。如本领域技术人员所知，这些载体可以很容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。一般而言，适于本发明的载体包含选择标记、合适的限制性位点以便于克隆目的基因、以及能够进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。
为了本发明目的，可以使用很多表达载体系统。例如，一类载体利用来自动物病毒的DNA元件，例如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其它包括使用内部核糖体结合位点的多顺反子系统。另外，通过引入能筛选转染的宿主细胞的一个或多个标记，可以选择将DNA整合进染色体的细胞。这些标记可以提供原养型给营养缺陷型宿主，提供杀生物剂抗性(例如抗生素)或对铜等重金属的抗性。选择标记基因可以直接连接待表达的DNA序列，或通过共转染引入相同细胞中。为最适mRNA合成，可能还需要其它元件。这些元件包括拼接信号、转录启动子、增强子和终止信号。
在特别优选的实施方案中，将克隆的可变区基因连同上述改变的重链和轻链恒定区基因(优选人的)一起插入表达载体。优选利用IDEC，Inc.名为NEOSPLA的专门表达载体进行。该载体包含巨细胞病毒的启动子/增强子、小鼠β球蛋白的主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素多聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因以及前导序列。如以下实施例所见，发现该载体在插入可变区和恒定区基因、转染CHO细胞、然后利用含有G418的培养基进行筛选并利用甲氨喋呤扩增之后，产生很高的抗体表达水平。该载体系统已经充分公开于共同转让的美国专利5,736,137和5,658,570中，均在此全文引入以供参考。这个系统可提供高表达水平，即＞30pg/细胞/天。
在其它优选实施方案中，本发明的改变的抗体可以利用多顺反子构建体进行表达，例如在2001年11月16日申请的共同未决美国临时申请60/331,481所公开的构建体，在此全文引入。在这些新的表达系统中，可以用单个多顺反子构建体产生多个目的基因产物，例如抗体的重链和轻链。这些系统有利地利用了内部核糖体进入位点(IRES)，在真核宿主细胞中提供相对高水平表达的改变的抗体。U.S.P.N 6,193,980公开了适宜的IRES序列，也在此引入。本领域技术人员应当理解，该表达系统可用于有效产生本发明公开的所有改变的抗体。
更一般而言，一旦制备了包含改变的抗体的载体或DNA序列，便可以将表达载体引入合适的宿主细胞。即，可以转化宿主细胞。可以利用本领域技术人员公知的多种技术，将质粒引入宿主细胞。这些技术包括但不限于，转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、细胞与包裹的DNA融合、微注射以及全病毒感染。参见Ridgway，A.A.G.“Mammalian Expression Vectors”，第24.2章，470-472页，Vectors，Rodriguez和Denhardt，Eds.(Butterworths，Boston，Mass.1988)。最优选通过电穿孔将质粒引入宿主细胞。转化细胞在适于产生轻链和重链的条件下生长，并测试重链和/或轻链的合成。典型的测试技术包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)、或荧光活化细胞分选分析(FACS)、免疫组织化学等。
此处所用术语“转化”应当用其广义，是指任意将DNA引入受体宿主细胞，改变基因型并因而导致受体细胞发生改变。
类似的，“宿主细胞”是指由利用重组DNA技术构建的含有至少一个异源基因的载体转化的细胞。如此处定义，宿主细胞产生的抗体或改变的抗体就是依靠这种转化。在从重组宿主分离抗体过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可以互换使用，表示抗体的来源，除非另外清楚指明。换句话说，从“细胞”中回收抗体是指从离心下来的完整细胞或从包含培养基和悬浮细胞的细胞培养物中回收。
用于表达蛋白质的宿主细胞系最优选哺乳动物来源；相信本领域技术人员有能力优先确定最适于在其中表达目的基因产物的特定宿主细胞系。典型的宿主细胞系包括但不限于，DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR缺陷)、HELA(人宫颈癌细胞)、CVI(猴肾细胞系)、COS(CVI与SV40 T抗原的衍生物)，R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤细胞)、P3.times.63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤细胞)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾细胞)。特别优选CHO细胞。宿主细胞系一般得自商业来源、美国组织培养物保藏中心或从所发表的文献。
体外生产可以放大，以得到大量的目的抗体。在组织培养的条件下的哺乳动物细胞培养技术为本领域已知，包括均匀悬浮培养，例如在气升反应器或持续搅拌反应器中，或者固定化或俘获细胞培养，例如在中空纤维、微囊中、琼脂糖微粒或陶瓷芯上。为了分离改变的抗体，首先将培养上清中的免疫球蛋白浓缩，例如通过硫酸铵沉淀、对吸湿物质例如PEG进行透析、利用选择性滤膜过滤等。如果必要和/或需要，将浓缩的抗体利用通常的层析方法进行纯化，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE纤维素层析或(免疫)亲和层析。
改便的免疫球蛋白基因也可以在非哺乳动物细胞例如细菌和酵母中表达。在这方面应当理解，也可以转化多种非哺乳动物的单细胞微生物，例如细菌；即能够在培养或发酵中生长的微生物。适于转化的细菌包括肠杆菌(Enterobacteriaceae)，例如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株；沙门氏菌(Salmonella)；芽胞杆菌(Bacillaceae)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。更应理解，在细菌中表达时，免疫球蛋白的重链和轻链一般成为包涵体的部分。这些链必须分离、纯化然后组装成功能性免疫球蛋白分子。
除了原核生物，也可以使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是最常用的真核微生物，尽管通常可得到许多其它菌株。例如，在酿酒酵母中表达常用质粒YRp7(Stinchcomb等人，Nature，28239(1979)；Kingsman等人，Gene，7141(1979)；Tschemper等人，Gene，10157(1980))。该质粒已经包含trp1基因，为丧失在色氨酸培养基中生长能力的突变菌株提供选择标志，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics，8512(1977))。酵母宿主细胞基因组特征性存在的trp1基因损伤，因而为通过在无色氨酸存在下生长进行转化检测提供了有效环境。
不管如何获得临床用量，可能以任何一种缀合(即免疫缀合物)或未缀合的形式使用本发明的改变的抗体。具体而言，本发明的抗体可缀合细胞毒素如放射性同位素、治疗剂、抑制细胞剂、生物学毒素或前体药物。另外，本发明的改变的抗体可能以未缀合或“裸”形式使用，以利用受治疗者自身的防御机制包括补体依赖性的细胞毒性(CDC)以及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)消除恶性细胞。在特别优选的实施方案中，改变的抗体可使用任何一种公知的螯合剂或通过直接标记与放射性同位素相结合，例如90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。在其它的实施方案中，本公开的组合物可包含与药物、药物前体、或生物反应调节剂如氨甲蝶呤、阿霉素以及淋巴因子如干扰素结合的改变的抗体。本发明其它的实施方案还包含与特定生物毒素例如蓖麻毒素或白喉毒素(diptheria)相缀合的改变的抗体的用途。在另外的实施方案中，改变的抗体可与其它免疫学活性的配体(例如抗体或其片段)复合，其中所得分子结合肿瘤细胞以及效应细胞，例如T细胞。选择使用哪种缀合或未缀合的改变的抗体取决于癌症的类型和阶段、使用的联合治疗(例如化疗或外部照射)以及患者状态。应当理解，本领域技术人员根据此处指导，能够很容易作出这种选择。
此处所用“细胞毒素或细胞毒性剂”是指对细胞生长和增殖有害、并在接触恶性细胞时可使其被减弱、抑制或破坏的任何药剂。典型的细胞毒素包括但不限于，放射性核素、生物毒素、抑制细胞或细胞毒性的治疗剂、前体药物、免疫学活性的配体以及生物反应调节剂，例如细胞因子。如下文详述，本发明特别优选使用放射性核素细胞毒素。然而，可阻碍或延缓恶性细胞生长、或消除恶性细胞并且可与此处公开的改变的抗体相结合的任何细胞毒素都属于本发明范围之内。
应当理解，先前的研究已经在动物模型和某些人类病例中使用同位素标记的抗肿瘤抗体，成功消灭实体瘤、淋巴瘤/白血病细胞。放射性核素通过产生电离辐射起作用，导致细胞核DNA发生多处链断裂，引起细胞死亡。用于生成治疗用缀合物的同位素一般产生具有治疗有效路径长度的高能量α，γ或者β粒子。此种放射性核素可以杀死与其紧密接近的细胞，例如该缀合物进入或附着的肿瘤细胞。它们一般对未定位的细胞有很少或没有作用。放射性核素基本没有免疫原性。
关于与本发明联合使用放射性标记的缀合物，改变的抗体可以直接标记(例如通过碘化作用)，或通过使用螯合剂间接标记。此处所用词语“间接标记”和“间接标记方法”都是指螯合剂与抗体共价结合，并结合至少一种放射性核素。此种螯合剂一般是指既结合多肽又结合放射性同位素的双功能螯合剂。特别优选的螯合剂包括1-异硫氰酸苄基-3-甲基(1-isothiocycmatobenzyl-3-methyl)二亚乙基三胺五乙酸(“MX-DTPA”)和二乙烯三胺五乙酸环己酯(“CHX-DTPA”)的衍生物。其它螯合剂包含P-DOTA和EDTA的衍生物。特别优选的用于间接标记的放射性核素包括111In和90Y。
这里所用的“直接标记”和“直接标记方法”都指放射性核素直接共价结合到抗体上(一般是通过氨基酸残基)。更具体的，这些连接技术包括随机标记和定点标记。在后一种情况中，可以在二聚体或者四聚体的特定位点上标记，例如只在缀合物的Fc部分存在的N连接糖基。另外，多种直接标记技术和方法都可以用于本发明。例如，可以通过下列方法制备锝-99m标记的抗体通过配体交换方法，通过用二价锡离子溶液还原高锝酸盐(TcO-4)，再将还原后的锝螯合到葡聚糖柱上，并将抗体置于该柱上，或者通过批量标记技术，例如通过将高锝酸盐、还原剂如SnCl2、缓冲液如邻苯二甲酸钠-钾溶液和抗体一起温育。在任何情况下，优选的用于直接标记抗体的放射性核素在本领域已是熟知的，特别优选的适于直接标记的放射性核素是通过酪氨酸残基共价结合的131I。本发明的改变的抗体可以与如放射性的碘化钠或碘化钾和化学氧化剂(如次氯酸钠，氯胺T等)或者酶氧化剂(如乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶)和葡萄糖一起产生。但是，为了本发明的目的，特别优选间接标记方法。
在本领域已知有关螯合剂和螯合剂缀合物的专利。例如，Gansow的U.S.Patent.No.4,831,175专利涉及多取代的二亚乙基三胺亚乙酸螯合剂和包含它的蛋白质缀合物及其制备方法。Gansow的U.S.Patent.No.5,099,069、5,246,692、5,286,850、5,434,287和5,124,471也涉及多取代的DTPA螯合剂。这些专利在这里全文引入。其它适宜的金属螯合剂的例子有乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DPTA)，1，4，8，11-四氮杂十四烷，1，4，8，11-四氮杂十四烷-1，4，8，11-四乙酸，1-氧杂-4，7，12，15-四氮杂十七烷-4，7，12，15-四乙酸等。环己基-DTPA或者CHX-DTPA是特别优选的，并在下面作为例证。其它适宜的螯合剂，包括那些将被发现的，本领域技术人员会容易确定，并且很明显是在本发明的范畴之内的。
适宜的螯合剂，包括用于促进共同未决的申请Serial Nos.08/475,813、08/475,815和08/478,967中的螯合的特异的双功能螯合剂是特别优选的，为三价金属提供高亲和力，具有增加的肿瘤与非肿瘤的比例，降低的骨摄取，以及放射性核素在靶位点(如B细胞淋巴肿瘤位点)体内滞留的延长。但是，其它有或者没有所有这些特性的双功能螯合剂在本领域也是已知的，而且也可以在肿瘤治疗中起作用。
还应理解的是，依照这里的教导，为了诊断和治疗目的，改变的抗体可以缀合不同放射性标记。在这点上，上述未决的申请，在这里全文引入以供参考，公开了放射标记的治疗缀合物用于在给予治疗抗体前肿瘤的诊断成像。“In2B8”缀合物包含小鼠的单克隆抗体，2B8，特异性针对人的CD20抗原。它通过双功能螯合剂如MX-DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)连接到111In上，MX-DTPA包含1-异硫氰酸苄基-3-甲基-DTPA和1-甲基-3-异硫氰酸苄基-DTPA 1∶1的混合物。111In特别优选作为诊断用放射性核素，因为可以安全地使用大约1到10mCi的剂量而不会有可探测到的毒性；成像数据通常预示了90Y标记的抗体的分布。大部分的成像研究使用了5mCi的111In标记的抗体，因为这个剂量与低剂量相比既安全又有增强的成像效果，而且最佳成像出现在施用抗体后三到六天。例如参见，Murray，J.Nuc.Med.263328(1985)和Carraguillo等，J.Nuc.Med.2667(1985)。
如上所示，很多种放射性核素都适用于本发明，本领域的技术人员能在不同情况下选择最合适的放射性核素。例如，131I是一个众所周知的用于靶向免疫治疗的放射性核素。但是，131I的临床应用受到几个因素的限制，包括物理半寿期8天；碘化抗体在血液中和肿瘤位点的脱卤化；和放射特性(即大γ成分)使之不适宜用于在肿瘤的局部剂量沉积。随着高级螯合剂的出现，将金属螯合基团连接到蛋白上的能力增加了使用其它放射性核素如111In和90Y的机会。90Y在放射性免疫治疗应用方面有多个好处90Y 64小时的半寿期有足够长的时间使抗体积累到肿瘤上，而且不像131I，90Y是纯粹的高能量β射线，在其衰变时没有γ射线，在组织中直径为100到1000个细胞。而且，少量的穿透辐射能使门诊病人施用90Y标记的抗体。另外，杀死细胞不需要标记抗体的内在化，而且离子射线的局部辐射应该对于邻近的缺乏靶抗原的肿瘤细胞也是致死的。
90Y标记的改变的抗体的一次治疗的有效剂量(即治疗有效量)为大约5到约75mCi之间，更优选为大约10至约40mCi之间。131I标记抗体一次治疗的有效无骨髓分离(non-marrow ablative)剂量为大约5到约70mCi之间，更优选为约5到约40mCi之间。131I标记抗体一次治疗的有效骨髓分离剂量(也就是需要自体骨髓移植)为大约30到约600mCi之间，更优选的是在约50到少于约500mCi之间。当与嵌合抗体缀合后，由于相对于小鼠抗体的更长的循环半寿期，131I标记的嵌合抗体的一次有效治疗的骨髓无分离剂量在大约5到40mCi之间，更优选的是少于大约30mCi。如111In的成像标准一般是大约5mCi。
在使用131I和90Y获得大量临床经验的同时，本领域已知其它的放射性标记并用于类似的目的。其它的放射性同位素也被用于成像。例如，与本发明的范围相符合的其它放射性同位素包括，但并不局限于123I，125I，32P，57Co，64Cu，67Cu，77Br，81Rb，81Kr，87Sr，113In，127Cs，129Cs，132I，197Hg，203Pb，206Bi，177Lu，186Re，212Pb，212Bi，47Sc，105Rh，109Pd，153Sm，188Re，199Au，225Ac，211At和213Bi。从这点来看，α，γ和β射线都可使用于本发明中。另外，根据本发明内容，可以认为本领域的技术人员可以轻易地决定哪一种放射性核素是适用于选定的治疗过程，而不需要额外的实验。为此，已经被用于临床诊断的其它放射性核素包括125I，123I，99Tc，43K，52Fe，67Ga，68Ga，和111In。已经用多种放射性核素标记抗体用于靶向免疫治疗中，Peirersz等，Immunol.Cell Biol.65111-125(1987)。这些放射性核素包括188Re和186Re以及较少使用的199Au和67Cu。在U.S.Patent No.5,460,785中提供了与这些放射性同位素有关的另外的数据，在此引入以供参考。
除了放射性核素，本发明的改变抗体还可以缀合或结合许多生物反应调节剂、药物制剂、毒素或者免疫活性配体中的任一种。本领域的技术人员应知道根据所选的细胞毒素可通过很多技术制备这些无放射性的缀合物。例如，带有生物素的缀合物可以通过改变的抗体与如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯等生物素活性酯反应来制备。类似的，带有荧光标记的缀合物可以在如以上所列的偶联试剂存在下，或者通过与异硫氰酸酯、优选荧光素-异硫氰酸酯反应来制备。本发明中嵌合抗体与抑制细胞/细胞毒性物质还有金属螯合剂的缀合物可以通过类似的方式进行制备。
用于本发明的优选的试剂是细胞毒性药物，特别是那些用于肿瘤治疗的。这些药物一般包括，细胞抑制剂，烷化剂，抗代谢药物，抗增殖剂，微管结合剂，激素和激素的拮抗剂等。适于本发明的典型的细胞抑制剂包括烷基化物质，如盐酸氮芥，三亚乙基磷酰胺，环磷酰胺，异环磷酰胺，苯丁酸氮芥，白消安(busulfan)，苯丙氨酸氮芥或者triaziquone，以及亚硝基脲化合物，如卡氮芥(carmustine)，罗氮芥(lomustine)或者司莫司汀(semustine)。其它优选的细胞毒性剂类型包括，例如，蒽环家族的药物，长春花药物，丝裂霉素，博莱霉素，细胞毒性核苷，蝶啶家族的药物，diynenes和鬼臼毒素。优选的那些种类里特别有用的成员包括，阿霉素，洋红霉素，道诺红霉素(道诺霉素)，阿霉素，氨基蝶呤，氨甲喋呤，甲基叶酸，光辉霉素，链黑菌素，二氯氨甲喋呤，丝裂霉素C，放线菌素D，甲基丝裂霉素，5-氟尿嘧啶，5-氟尿苷，喃氟啶(ftorafur)，6-巯基嘌呤，阿糖胞苷，阿糖胞苷、鬼臼毒素或者鬼臼毒素的衍生物如鬼臼亚乙苷或者鬼臼亚乙苷磷酸盐，苯丙氨酸氮芥，长春花碱，长春花新碱，异长春碱，长春碱酰胺，环氧长春碱等。其它符合此处教导的细胞毒素还包括紫杉醇，taxane，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙啶，依米丁(emetine)，替尼泊苷(tenoposide)，秋水仙素，二羟基炭疽菌素二酮，米托蒽醌(mitoxantrone)，普鲁卡因，丁卡因(tetracaine)，利多卡因(lidocaine)，普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素及其类似物和同系物。激素和激素拮抗剂，如皮质类固醇类，例如强的松，孕酮类，例如羟基孕酮或甲孕酮(medroprogesterone)，雌激素类，如乙烯雌酚，抗雌激素类，例如他莫昔芬(tamoxifen)，雄激素类，例如睾丸素，和aromatase抑制剂如氨鲁米特(aminogluthetimide)也与这里指导的内容相符合。如以前提到的，本领域的技术人员可以对所需的化合物进行化学修饰以使这种化合物的反应更加易于制备本发明中的缀合物。
一特别优选的细胞毒素的例子包括抗肿瘤抗生素enediyne家族的成员或衍生物，包括加利车霉素(calicheamicin)、埃斯波霉素(esperamicins)或者dynemicins。这些毒素非常有潜力，并且可以断裂核DNA导致细胞死亡。不像蛋白质毒素那样在体内会被断裂产生很多无活性但是具有免疫原性的多肽片段，如加利车霉素、埃斯波霉素和其它enediynes的毒素是基本没有免疫原性的小分子。这些非肽类毒素通过曾经用于标记单克隆抗体和其它分子的技术化学连接成二聚体或者四聚体。这些连接技术包括通过只在缀合物的Fc部分出现的N连接糖基的定点连接。这种定点连接方法具有降低对缀合物的结合特性的可能的连接影响的好处。
如前所述，适宜的细胞毒素可能包含药物前体。这里所用的短语“药物前体”指药学活性物质的前体或者衍生形式，它比亲本药物对肿瘤细胞的毒性低，但可以被酶促活化或者转化成更有活性的亲本形式。适宜本发明的药物前体包括，但并不仅限于，含磷酸盐的药物前体，含硫代磷酸盐的药物前体，含硫酸盐的药物前体，含肽的药物前体，含β-内酰胺的药物前体，可选的取代的含苯氧基乙酰胺的药物前体，或者可选的取代的含苯基乙酰胺的药物前体，5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶药物前体，其可以转化成更加有活性的细胞毒性自由药物。可以衍生出用于本发明的药物前体形式的细胞毒素药物的更多的例子包括那些上面讨论的化疗剂。
在其它的细胞毒素中，应当理解抗体也能够与生物毒素相连，如篦麻毒蛋白亚基A，相思豆毒蛋白，白喉毒素，肉毒杆菌毒素，cyanginosin，蛤蚌毒素，志贺菌毒素，破伤风毒素，河豚毒素，单端孢菌霉素，青霉颤抖毒素或者有毒的酶。优选的，这些构建体将使用基因工程技术制备，可以直接表达抗体-毒素的构建体。可以连接到本发明中改变的抗体的其它生物反应调节物包括细胞因子，如淋巴因子和干扰素。而且，如上所述，类似的构建体也可以用来连接有免疫反应活性的配体(如抗体或者其片段)与本发明中的改变的抗体。优选的，这些免疫学活性的配体可能针对免疫活性效应细胞表面的抗原。在这些情况下，这些构建体可以用来将效应细胞，如T细胞或者NK细胞，带到有肿瘤相关抗原的肿瘤细胞附近，从而激发所需的免疫应答。根据本发明的内容，本领域的技术人员应该可以轻易地应用常规的技术形成该构建体。
另外一类可用于与所公开的改变的抗体缀合的适宜的细胞毒素是可以有效针对肿瘤细胞的辐射敏感药物。这些药物增强了对离子辐射的敏感性，从而增加了放射治疗的效果。被肿瘤细胞内在化的抗体缀合物可以将辐射敏化剂传送到靠近细胞核的地方，这里的辐射敏化将达到最大。那些未结合的辐射敏化剂连接的改变的抗体能很快地从血液中清除，而剩余的辐射敏化剂就定位在靶肿瘤上，并且正常组织吸收最小。在从血液中快速清除后，可以用以下三种方法之一给予辅助放射性治疗1.)特异针对肿瘤的外部射线，2.)直接植入肿瘤内的放射活性或者3.)用相同的靶向抗体的系统的放射性免疫治疗。这种方法的潜在的吸引人之处将是把治疗性放射性同位素附在放射敏化的免疫缀合物上，从而可以简便地给予患者一种药物。
无论本发明的抗体以缀合的或者未缀合的形式使用，应当理解到本发明的的主要优点是在骨髓抑制患者中，特别是在那些正在进行或者已经经历化疗和放疗等辅助治疗的患者中应用这些抗体。也就是，改变的抗体的更好的传递特性(即相对较短的血清滞留时间和增强的定位能力)使它们对于治疗红骨髓储量减少和骨髓毒性敏感的病人特别有利。在这点上，改变的抗体独特的传递特性使它们非常有效地对骨髓抑制癌症患者施用放射性标记缀合物。由此，缀合或非缀合形式的改变的抗体对于曾经经历过如外部射线照射或者化疗等辅助治疗的患者很有用。在其它优选实施方案中，改变的抗体(同样以结合的或者未结合的形式)可以与使用化疗剂一起用于联合治疗方案。本领域的技术人员应当理解这样的治疗方案可以包括有序的，同时的，共同的或者同时扩大的施用本发明的抗体与一种和多种化疗剂。本发明在这方面的特别优选的实施方案中将包括给予放射性标记的抗体。
就如上面刚刚提到的，当施用改变的抗体时，需要强调在其它实施方案中缀合的或者非缀合的改变的抗体可以作为一线治疗药物施用给健康癌症患者。在这样的实施方案中改变的抗体可以施用给具有正常或平均红骨髓储量和/或者未曾也不正在进行外部辐射或化疗等辅助治疗的患者。
但是，如上所述，本发明的选择的实施方案包含将改变的抗体给予骨髓抑制患者或与一种或多种如放疗或化疗的辅助治疗组合或结合施用(例如联合治疗方案)。如这里所运用的，改变的抗体与辅助性治疗组合或联合施用指的是有序的、同时的、同时扩大的、共同的、相伴随的或者同时期的给予或应用这些疗法与本发明的抗体。本领域的技术人员将理解到可以选择施用或应用联合治疗方案的各种组分以增加治疗的整体效果。例如，可以以标准的熟知的治疗程序施用化疗剂，然后几个星期内给予本发明的放射性免疫缀合物。相反的，可以静脉给予细胞毒素相联的改变的抗体，然后再使用肿瘤定位外部射线辐射。在其它实施方案中，改变的抗体可以跟一种或者多种选定的化疗剂在一次门诊时同时给予。本领域技术人员(有经验的肿瘤学家)可以很容易地根据所选的辅助治疗和本说明书的教导得出有效的联合治疗方案，不需要额外的实验。
从这方面来看，可以理解改变的抗体(有或没有细胞毒素)和化疗剂组合可以以任何顺序和在任何时间段内施用而给患者提供治疗好处。也就是，化疗剂和改变的抗体可以同时地或者以任何顺序施用。在选择的实施方案中，本发明的改变的抗体将被施用到曾经化疗过的患者体内。在其它实施方案中，改变的抗体和化学治疗将基本同时或者共同地施用。例如，患者将在化疗疗程的同时施用改变的抗体。在优选实施方案中，将在任何化疗剂或治疗的一年内施用改变的抗体。在其它优选的实施方案中，在使用任何化疗剂或治疗的10，8，6，4，或者2个月内施用改变的抗体。在另外的优选实施方案中，在使用任何化疗剂或治疗的4，3，2或者1个星期内施用改变的抗体。在另外的实施方案中，在使用选择的任何化疗剂或治疗的5，4，3，2或者1天内施用改变的抗体。还应理解到这两种药物或者治疗可以在几个小时或几分钟内给患者施用(即基本同时)。
而且，依据本发明骨髓抑制患者应该指血球数降低的任何患者。本领域的技术人员应知道有几种方便作为骨髓抑制临床指示的血球数参数，并且可以轻易地测量患者骨髓抑制程度。公认的骨髓抑制测量的例子是绝对嗜中性粒细胞数(Absolute Neutrophil Count)(ANC)或者血小板数。这样的骨髓抑制或者部分重度骨髓抑制可能是各种生物化学异常或者疾病或者，更可能的是，先前化疗或放疗的结果。在这方面，本领域技术人员应理解那些经过传统化疗的患者一般都存在红骨髓储量降低现象。如上所述，这样的病人通常不能用最佳水平的细胞毒素(即放射性核素)进行治疗，因为无法接受的贫血症或者免疫抑制等副作用，其导致死亡率和发病率增加。
更具体而言，本发明的缀合或者未缀合的改变的抗体可以用于有效地治疗ANC少于约2000/mm3或血小板数低于约少于150,000/mm3的患者。更优选地，本发明的改变的抗体可用于治疗ANC少于约1500/mm3、小于约1000/mm3或甚至更优选少于约500/mm3的患者。类似的，本发明改变的抗体可以治疗血小板数少于约75,000/mm3、少于约50,000/mm3，甚至少于约10,000/mm3的患者。从更一般的意义上来讲，本领域技术人员可以利用政府实施指南和步骤简易地确定病人是骨髓抑制。
如上指出的，很多骨髓抑制患者曾经经历过包括化疗、植入放疗或者外部射线放射治疗等治疗过程。在后者中，外部放射源用于恶性肿瘤的局部照射。对于放疗植入方法，放射活性试剂通过手术置入恶性肿瘤中，从而选择性辐射疾病处。在任何情况下，本发明的改变的抗体都可以用于治疗骨髓抑制患者中肿瘤疾病，无论致病原因是什么，而且，还可以与外部照射或者植入放疗联合使用。
在这点上，应进一步理解，本发明的改变的抗体可以与任何化疗剂或方案结合或者联合使用(即可以提供联合治疗方案)，以降低、减少、抑制或控制体内肿瘤细胞的生长。所述的这种试剂通常会引起红色骨髓储量的减少。通过消除本发明中化合物的骨髓毒性，可以全部的或者是部分的弥补这种减少，有利于对这样的患者的肿瘤更有效的治疗。在其它优选实施方案中，这里公开的放射性标记的免疫缀合物可以有效地与辐射敏化剂共同使用，其增加肿瘤细胞对放射性核素的敏感性。例如，辐射敏化化合物可以在放射标记的改变的抗体已经大部分从血流中清除但仍然在肿瘤位点保留治疗有效水平的时候施用。
考虑到本发明的这些方面，适宜用于本发明的典型化疗剂包括烷化剂，长春花生物碱(如长春新碱和长春花碱)，甲基苄肼，氨甲蝶呤和强的松。四药物组合MOPP(盐酸氮芥(mechlethamine)(氮芥)，长春新碱(Oncovin)，甲基苄肼和强的松)对治疗各种类型的淋巴瘤非常有效，并且包括了本发明优选的实施方案。在MOPP抗性患者中，可以使用ABVD(即阿霉素，博来霉素，长春花碱和氮烯咪胺)、ChlVPP(苯丁酸氮芥，长春花碱，甲基苄肼和强的松)、CABS(洛莫司汀(lomustine)，阿霉素，博来霉素，链脲菌素)、MOPP加ABVD、MOPP加ABV(阿霉素，博来霉素和长春花碱)或者BCVPP(卡氮芥(carmustine)，环磷酰胺，长春花碱，甲基苄肼和强的松)组合。标准的剂量和流程见Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler，Malignant Lymphomas，in HARRISON’S PRINCIPLE OFINTERNAL MEDICINE 1774-1788(Kurt J.Isselbacher等，eds.，13thed.1994)和V.T.DeVita等，(1997)以及其中引用的参考文献。这些疗法可以完全不变或者针对特殊患者作一些变动，与此处所述的一种和多种改变抗体组合。
用于本发明文中的其它的方案包括使用单一的烷化剂，如环磷酰胺或者苯丁酸氮芥，或者下列组合如CVP(环磷酰胺，长春新碱和强的松)，CHOP(CVP和阿霉素)，C-MOPP(环磷酰胺，长春新碱，强的松和甲基苄肼)，CAP-BOP(CHOP加甲基苄肼和博来霉素)，m-BACOD(CHOP加上氨甲蝶呤，博来霉素和甲酰四氢叶酸)，ProMACE-MOPP(强的松，氨甲蝶呤，阿霉素，环磷酰胺，鬼臼亚乙苷和甲酰四氢叶酸加上标准的MOPP)，ProMACE-CytaBOM(强的松，阿霉素，环磷酰胺，鬼臼亚乙苷，阿糖胞苷，博来霉素，长春新碱，氨甲蝶呤和甲酰四氢叶酸)和MACOP-B(氨甲蝶呤，阿霉素，环磷酰胺，长春新碱，恒定剂量的强的松，博来霉素和甲酰四氢叶酸)。本领域技术人员将很容易确定每一种方案的标准剂量和程序。CHOP曾与博来霉素、氨甲蝶呤、甲基苄肼、氮芥、阿拉伯糖苷胞嘧啶和鬼臼亚乙苷组合。其它的适合化疗剂包括，但并不局限于2-氯脱氧腺苷(2-CDA)，2-脱氧助间型霉素和fludarabine。
对于中级和高级NHL患者，由于不能得到缓解或者容易复发，要使用补救治疗。补救治疗单独或者联合使用如阿拉伯糖苷胞嘧啶、顺铂、鬼臼亚乙苷和异环磷酰胺等药物。在复发型或者侵占型的某些肿瘤疾病中经常使用以下方法IMVP-16(异环磷酰胺，氨甲蝶呤和鬼臼亚乙苷)，MIME(甲基-gag，异环磷酰胺，氨甲蝶呤和鬼臼亚乙苷)，DHAP(地塞米松，高剂量阿糖胞苷和顺铂)，ESHAP(鬼臼亚乙苷，甲基强的松龙，HD阿糖胞苷和顺铂)，CEPP(B)(环磷酰胺，鬼臼亚乙苷，甲基苄肼，强的松和博来霉素)和CAMP(洛莫司汀，米托蒽酯(mitoxantrone)，阿糖胞苷和强的松)，每一种方法都有已知的剂量和程序。
与本发明中与改变的抗体组合使用的化疗剂的量可以根据受试者进行变化或者根据本领域已知的量来施用。请参见例如，Bruce AChabner等，Antineoplastic Agents，in GOODMAN&GILMAN’S THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287(Joel G.Hardman等，9thed.1996)。
如前所述，本发明的改变抗体、免疫活性片段或者其重组体可以以药物学有效剂量施用以治疗哺乳动物恶性肿瘤。在这方面，可以理解可以配制本发明的抗体以方便施用和促进活性因子的稳定性。优选地，依据本发明的药物组合物包含药物学上可以接受的、无毒性的、消过毒的载体，如生理盐水、无毒的缓冲液、防腐剂等等。为了本发明的目的，药学有效量的改变的抗体，免疫活性片段或者其重组体，缀合或者未缀合治疗剂，应该是指足以获得有效地结合选择的肿瘤细胞上的免疫活性抗原的并且可以促进这些细胞死亡的量。当然，本发明的药物组合物可以单一或者多剂量形式施用，以提供药学有效剂量的改变的抗体。
更具体而言，本发明的抗体和方法应能用于减小肿瘤大小，抑制肿瘤生长和/或者延长带肿瘤动物的生存时间。因此，本发明还涉及通过给予人和动物有效、无毒量的改变抗体来治疗人或者其它动物肿瘤的方法。本领域技术人员应能够通过例行实验确定治疗恶性肿瘤的改变的抗体的有效而无毒性量。例如，改变抗体的治疗活性量可以根据如疾病阶段(如第一阶段与第四阶段)、年龄、性别、医疗并发症(如免疫抑制情况或者疾病)和受试者的体重，以及抗体在受试者中引发所需反应的能力等因素进行改变。可以调整剂量方案以提供最适宜的治疗反应。例如，可以每天施用几次分开的剂量，或者该剂量可以依据治疗情况的紧急程度按比例减少。但是一般，有效剂量预期在0.05到100毫克每公斤体重每天；更优选的是在约0.5到10毫克每公斤体重每天。
根据本发明的范围，本发明的改变的抗体可以依据上述的治疗方法用以足以产生治疗或预防效果的剂量施用于人或者其它动物。本发明的抗体能够以根据已知的技术通过将本发明的抗体与常规的药学可接受的载体或者稀释剂相结合制备的常规的剂量形式施用于人体和其它动物。本领域技术人员应认识到药学可接受的载体或者稀释剂的形式和特性是由与其组合的活性成分的量、施用途径和其它已知的变量决定的。本领域技术人员将进一步理解包含一种或多种本发明的单克隆抗体的混合物将特别有效。
制备和施用抗体、免疫活性片段或者其重组体的缀合物的方法以及治疗剂对于本领域技术人员来说是熟知的或者很容易确定的。施用本发明的抗体(或者其片段)的途径可以是口腔、肠胃外，吸入或者局部用药。这里所说的肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或者阴道给药。优选静脉内、动脉内、肌内、和皮下形式的肠胃外给药方式。尽管所有的这些给药形式都很明确地包括在本发明的范围之内，优选的给药形式是用于注射的溶液，特别是用于静脉内或者动脉内注射或者滴注。通常，注射用的适宜的药物组合物包含缓冲液(如乙酸，磷酸或柠檬酸缓冲液)、表面活性剂(如聚山梨醇酯)、可选的稳定剂(如人白蛋白)等等。但是，在与此处教导相符合的其它方法里，改变的抗体可以直接被输送到恶性肿瘤位点，从而增加肿瘤组织暴露于治疗剂。
肠胃外给药的制剂包括无菌的水或非水溶液，悬浮液和乳浊液。非水的溶剂的例子有丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水，乙醇水溶液，乳浊液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在本发明中，药学可接受的载体包括但并不仅限于0.01-0.1M、优选0.05M的磷酸缓冲液或者0.8％的生理盐水。其它常用肠胃外载体包括磷酸钠溶液、Ringer’s葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、Ringer’s乳酸盐或者固定的油。静脉注射载体包括流体的营养补充物(replenisher)、电解质补充物，如那些基于Ringer’s葡萄糖的特质等。还存在防腐剂和其它的添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体等等。
更具体而言，适于注射应用的药学组合物包括无菌的水溶液(水溶性的)或者胶体溶液(dispersion)和用于临时制备灭菌的注射用溶液或胶体溶液的灭菌粉末。在这些情况下，这些组合物必须是无菌的而且应该是易于注射的液体。它应该在生产和保存条件下稳定，而且优选可以抵抗细菌和真菌等微生物的污染。载体可以是溶剂或者胶体介质，包含如水、乙醇、多元醇(如甘油，丙二醇和液态的聚乙二醇等等)和其合适的混合物。例如通过使用卵磷脂包衣、通过保持胶体溶液里的所需粒子的大小以及通过使用表面活性剂可保持合适的流动性。
可以通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞防止微生物的作用。在很多情况下，组合物中优选包括等渗剂，例如，蔗糖，多元醇，如甘露醇，山梨醇，或者氯化钠。通过在组合物中加入如单硬脂酸铝和明胶等延缓吸收的的试剂可以导致注射组合物的延迟吸收。
在任何情况下，无菌的可注射溶液可以通过这样的方法制备，在合适的溶剂中加入所需量的活性化合物(如改变的抗体自身或者与其它活性剂相结合)和根据需要的这里列举的成分中的一种或几种的组合，接着过滤灭菌。一般，胶体溶液是通过将活性化合物加入到无菌载体中来制备的，其包含基本的胶体溶液介质和以上列举的所需要的其它成分。在制备用于配制无菌可注射溶液的无菌粉末时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这样可以从预先过滤灭菌的溶液中生产出包含活性成分和任何另外所需的成分的粉末。根据本领域熟知的方法制备注射制剂，加入到安瓿、袋子、瓶子、注射器或者小瓶等容器里，在无菌条件下密封。此外，包装这些制剂，并以试剂盒的形式进行销售，如在未决的U.S.S.N. 09/259，337和U.S.S.N.09/259,338所描述的，这些在此引入以供参考。这样生产的商品优选具有标记或者药品说明书(package inserts)说明相关的组合物用于治疗患有或者易患癌症、恶性肿瘤或者肿瘤疾病的受试者。
如上详述，本发明提供了治疗有此需要的哺乳动物受试者肿瘤疾病的化合物、组合物、试剂盒和方法。优选的受试者是人。肿瘤疾病(如癌症和恶性肿瘤)可以包括实体瘤如黑素瘤、神经胶质瘤、肉瘤和癌以及骨髓或血液恶性肿瘤如淋巴瘤和白血病。一般讲，本发明可以用于预防或者治疗任何含有可使改变的抗体靶向癌细胞的抗原标记的肿瘤。典型的可以治疗的癌症包括，但并不局限于前列腺癌，结肠癌，皮肤癌，乳腺癌，卵巢癌，肺癌和胰腺癌。在优选的实施方案中本发明选择的改变的抗体(如CC49.ΔCH2)将被用于诊断或者治疗结肠癌或者胃癌。更特别的，本发明的抗体可以用于治疗卡波西(Kaposis)肉瘤，CNS肿瘤(毛细成血管细胞瘤，脑膜瘤和脑转移瘤)，黑素瘤，胃肠的和肾脏肉瘤，横纹肌肉瘤，成胶质细胞瘤(优选多形性成胶质细胞瘤)，平滑肌肉瘤，成视网膜细胞瘤，卵巢乳头状囊腺癌，Wilm’s肿瘤或者小细胞肺癌。应当理解，根据本发明，不用进行多余的实验就可以生产针对上述各种肿瘤相关的肿瘤相关抗原的合适抗体。
适合于利用本发明进行治疗的血液恶性瘤包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤以及白血病，包括ALL-L3(伯基特(Burkitt’s type)白血病)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和单核细胞白血病。应当理解到本发明的化合物和方法对于治疗各种B细胞淋巴瘤特别有效，包括初级/滤泡非霍奇金淋巴瘤(NHL)，细胞淋巴瘤(FCC)，套细胞淋巴瘤(MCL)，弥散性大细胞淋巴瘤(DLCL)，小淋巴细胞(SL)NHL，中级/滤泡NHL，中级弥散性NHL，高级免疫母细胞NHL，高级淋巴母细胞NHL，高级小型不分裂细胞NHL，大型疾病NHL和Waldenstrom’s巨球蛋白血症。本领域技术人员应该清楚这些淋巴瘤和白血病经常由于分类系统的改变有各种不同的名字，患有用不同名字分类的血液恶性肿瘤的病人也可以从本发明的联合治疗方案中受益。除了上述肿瘤疾病外，人们也应该理解本发明可有利用于治疗其它的带有适宜的肿瘤相关抗原的的恶性肿瘤。
参考以下的实施例可以更充分理解以上的描述。但是，这些实施例是用以说明实践本发明的优选方法的，而并非要限制发明和这里所附的权利要求的范围。
实施例1构建和表达C2B8.ΔCH2免疫球蛋白改变嵌合抗体C2B8(IDEC Pharmaceuticals)以产生人体γ1恒定区缺失CH2结构域的结构域缺失体。C2B8和质粒N5KG1在U.S.Pat.Nos.5,648,267和5,736,137(此处引入以供参考)中描述，后者是一个编码了人的K轻链恒定区以及人的γ1恒定区的“空”载体。产生CH2结构域缺失体是通过重叠PCR突变完成的。
γ1恒定区从质粒编码的Nhe I位点开始，其位于免疫球蛋白序列的翻译阅读框里。PCR5’引物包括了所述的Nhe I位点及紧接着的下游序列。将PCR3’引物构建成与免疫球蛋白铰链区3’端退火并在框架里编码了γ1 CH3结构域起始的几个氨基酸。另外的PCR引物对由与上述第一引物对3’PCR引物反向互补序列作为5’引物和在跨越CH3结构域内的BsrG I限制性位点的基因座退火的3’引物组成。每一次PCR扩增后，将得到的产物用作模板分别以Nhe I和BsrG I为5’和3’引物。扩增产物再克隆回N5KG1载体产生N5KG1ΔCH2质粒。该构建体将完整的CH3结构域紧接着放在了完整的铰链区的下游并与之在同一个读码框内。由于这是一个“空”载体，C2B8免疫球蛋白的轻链和重链的可变区然后被插入到合适的克隆位点。
在测序确定了免疫球蛋白的编码区后，将这个表达构建体转染进CHO DG44细胞，并利用G418抗性(由载体编码的新霉素磷酸转移酶基因赋予)进行筛选。然后测定抗性细胞分离物的HuCC49免疫球蛋白的表达。所获得的构建体的序列示于图1-3。
实施例2构建和表达huCC49.ΔCH2免疫球蛋白人源化的CC49抗体(ATCC No.HB 9459)是从美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)获得的。轻链在称为pLNCX IIHuCC49 HuK质粒中编码。重链在称为pLgpCX II HuCC49G1.ΔCH2质粒中编码。
从这些质粒中用PCR扩增的方法分离轻链和重链的可变区。构建PCR引物包括限制性内切酶位点以能随后亚克隆入IDEC的专有表达载体N5KG1.ΔCH2中。
轻链的限制性内切酶是5’端的Bgl II(紧接在NCI质粒编码的天然前导肽的翻译起始位点的上游)和3’端的BsiW I(在IDEC的载体编码的人κ轻链恒定区的翻译读码框内)。轻链可变区内没有氨基酸发生NCI序列改变。
重链的限制性内切酶是5’端的Mlu I(编码了在阅读框内的由IDEC的表达载体编码的“合成”免疫球蛋白重链信号肽第-5和-4个氨基酸残基)。PCR引物也编码了重链可变区的开始部分的第-3，-2，-1个残基。3’重链PCR引物编码了与IDEC的γ1结构域缺失重链恒定区同一框架的限制性内切酶Nhe I。最终结果是带有以下成分的编码HuCC49结构域缺失抗体表达构建体。重链可变区内没有氨基酸发生NCI序列的改变。
轻链天然的轻链前导肽-NCI可变区-IDEC的人κ恒定区。
重链IDEC合成的重链前导肽-NCI可变区-IDEC CH2结构域缺失的γ1重链恒定区。
在测序确定了免疫球蛋白的编码区域后，将这个表达构建体转染进CHO DG44细胞，并利用G418抗性(由载体编码的新霉素磷酸转移酶基因赋予)。测定抗性细胞分离物的HuCC49免疫球蛋白的表达。HuCC49.ΔCH2重链和轻链的序列示于图4和5。
实施例3构建和表达C5E10.ΔCH2免疫球蛋白小鼠表达C5E10的杂交瘤细胞来自爱荷华大学(University ofIowa)。从细胞中提取RNA并用oligo dT从RNA获得了cDNA。接着利用一系列小鼠κ重链可变区引物对cDNA进行PCR扩增，然后将PCR产物进行琼脂糖电泳。用已知的技术，用引物来分离和鉴定琼脂糖胶条带中的重链和轻链。分离条带，用限制性内切酶酶切，再将轻链可变区基本按实施例1和实施例2所述克隆入Neospla N5KG1载体。重链可变区然后克隆入NeosplaΔCH2载体上(也基本按实施例1和实施例2所述)以产生没有CH2结构域的抗体。亲本抗体和结构域缺失的构建体的重链和轻链可变区的DNA和氨基酸序列示于图6-8。运用已知的技术将载体电转进入CHO细胞以获得稳定细胞系。在CHO细胞生长并表达产物后，用亲和层析的方法纯化改变的抗体。
实施例4制备111In和90Y放射标记的构建体如下所述，用放射活性的铟和钇进行标记实施例1-3中制备的改变的抗体构建体或者基本等价物和合适的对照以进行体内生物学分布和生物学实用性研究。如上所述，直接在蛋白质中掺入放射性金属如111In和90Y一般是无效的。因此，一般用螯合剂将这些同位素与抗体连接起来以提供所需的放射活性免疫缀合物。在这里描述的研究中，用螯合剂MX-DTPA掺入111In和90Y。
在缀合前，将MAb2B8，2B8.F(ab’)2和C2B8.ΔCH2渗滤到低金属盐溶液(LMC-Saline，用0.5M的硼酸调节pH值到8.6)中。Mabs用预先洗过的Centricon 30的滤器进行渗滤(两次，根据商品说明)，用A280测MAb的浓度(1mg/ml＝1.7AU)，并用LMC-Saline(pH8.6)稀释到约10.0mg/ml。MAb与MX-DTPA以4∶1摩尔比的比例(螯合剂比Mab)在室温反应14-16小时。温育后，缀合物用Centricon 30的滤器(3次)清除未反应的螯合剂，用A280测定蛋白的浓度，并用LMC-Saline调节到终浓度2.0mg/ml。
用相同的方法使CC49和CC49.ΔCH2与MX-DTPA缀合，只是螯合剂与Mab的摩尔比是2∶1，而抗CD20 Mab是4∶1。用A280测定CC49和CC49.ΔCH2抗体的浓度(1mg/ml＝1.0)。
缀合后，结构域缺失构建体和对照抗体和片段以111In和90Y进行放射标记。以特异活性1-3mCi/mg蛋白质标记111In。用50mM乙酸钠调节氯化铟[111]稀盐酸溶液(Nycomed Amersham或者CyclotronProducts.Inc)到pH4。加入免疫球蛋白缀合物，混合物在室温温育。30分钟后，混合物被用pH7.2含有7.5％人血清白蛋白(HAS)和1mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)(缓冲液)的1×PBS稀释到抗体终浓度0.2mg/ml。
以特异活性10-19mCi/mg蛋白对这些构建体和对照用90Y进行放射标记。用50mM乙酸钠调节氯化钇[90]稀盐酸溶液(NycomedAmersham或者NEN Dupont)到pH4。加入抗体缀合物，混合物在室温温育。5分钟后，混合物用pH7.2含有7.5％人血清白蛋白(HAS)和1mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)(配制缓冲液)的1×PBS稀释到抗体终浓度0.2mg/ml。
实施例5制备125I放射标记的构建体以放射性碘标记实施例1-3中制备的构建体和合适的对照以用于下述的生物学分布和生物学实用性研究。更具体而言，构建体和对照用Iodo-Beads(BioRad Industries)根据厂商提供的一般指南进行放射标记。在100mM pH7.0的磷酸钠溶液中2mCi Na125I与一Iodo-Bead温育5分钟。加入大约0.2mg免疫球蛋白，反应混合物温育2分钟。未结合的碘用Sephadex G-25(Pharmacia PD-10柱)在1×PBS中通过脱盐除去。
实施例6放射标记的huCC49.ΔCH2的血液清除速率图9比较了111In，90Y和125I标记的结构域缺失的huCC49和111In或者125I标记的亲本抗体CC49在小鼠内的血液清除速率。结构域缺失的构建体或者它们的基本等价物和完整的抗体是按照实施例1-5的描述制备的。标记的CC49构建体在正常的小鼠或LS174T BABL/cnu/nu带瘤小鼠中都作了评估。LS174T是源于人结肠癌的TAG-72阳性肿瘤。通过将1×106的洗过的组织培养细胞sc.注射到小鼠体内进行肿瘤异种移植并使其增殖。如图9所示，所有标记了不同同位素的结构域缺失的构建体在带瘤和不带瘤小鼠中表现出了类似的血液清除速率。有意义的是，应该注意在接种后24小时99％以上的标记的结构域缺失构建体从血液中清除。使用不同的同位素没有发现清除速率不同。与之形成强烈反差的是，明显水平的放射性标记的完整抗体在注射三天后仍然遗留在循环系统中。如上述大量讨论的，给予的放射标记化合物循环延长和非特异性沉积会产生骨髓毒性，在很多情况下，实际上就限制了放射性缀合物的施用量。放射性缀合物的快速清除可以大大降低骨髓毒性。这样，该实施例形象化地说明了本发明在减少不利副作用和潜在地增加杀肿瘤药物的施用量方面的优点。
实施例7比较血液清除速率和肿瘤定位小鼠的抗体2B8和其嵌合体C2B8都与人CD20抗原反应。在带瘤小鼠中，用111In标记的2B8，C2B8.ΔCH2和2B8.F(ab’)2检测血液清除速率的药物动力学和肿瘤定位。
通过sc.注射1×106的洗过的组织培养细胞在雌性BALB/cnu/nu小鼠中进行增殖Daudi肿瘤(CD20阳性)。在肿瘤体积达到约50-100mm3大小时i.v.注射放射性标记的Mab或者构建体。为了研究不同构建体的生物学分布和肿瘤定位，处死动物并且在指定时间放血。肿瘤从动物身上移除，用PBS洗净后称重。标准的血液样品简单去除并保存直到进行分析。运用本领域熟知的技术，用γ计数器测量肿瘤和血液中的放射性并进行物理衰变的校正。结果代表了在每个时间点的三个动物体平均值，并以图形示于图10中。更具体地，图10A显示了完整的C2B8血液清除和肿瘤定位速率，而图10B和10C分别表示标记的F(ab’)2构建体和结构域缺失构建体的同一测量结果。
曲线显示了无论是111In标记的C2B8.F(ab’)2(图10B)或者C2B8.ΔCH2(图10C)构建体在注入24小时后，加入的放射性只有很少还存留在循环系统中。相反的，在注入24小时后血清中仍残留有很高水平的111In-2B8.IgG(图10A)。因此结构域缺失的和F(ab’)2构建体的血液清除速率明显快于完整的IgG分子。更具体而言，由血液清除速率计算的有效半寿期C2B8.ΔCH2是5.7小时，2B8F(ab’)2片段是12.9小时，而完整的2B8 IgG分子是38小时。结构域缺失构建体明显快的血液清除速率再次说明本发明可以充分减少输送到骨髓的放射剂量。
相反的，本发明的改变的抗体特别有效地将治疗有效量的放射性输送到肿瘤上。在这方面，图10中表示了111In标记的构建体的肿瘤定位。图10A中，111In-2B8.IgG在输注后24-48小时出现了肿瘤定位的峰值。而在图10B和10C中2B8.F(ab’)2或C2B8.ΔCH2构建体在输注6小时后显示峰值定位。但是，2B8.F(ab’)2与其它构建体相比显示出注射剂量/gm百分率有很明显的降低，与之不同，C2B8.ΔCH2显示出与用111In2B8获得的量相当的肿瘤定位模式(图10A和10C)。在这个实施例中，峰值肿瘤定位，以注射剂量/gm组织的百分比(％ID/gm)表示，在6小时2B8.F(ab’)2是6.2，而结构域缺失构建体6小时时是17.1％。作为对比，6小时只有4％的2B8.IgG定位在肿瘤上。2B8.IgG的肿瘤定位的最高峰值是在24小时，为19.4％。
因此，只有本发明的改变的抗体体现出期望的特性，既有高的肿瘤定位，又有相对快的血液清除。更一般地说，完整的抗体表现出了较高的肿瘤定位(虽然是在一个更长的时段里)，但是由于较长的血液半寿期而有相当大的骨髓毒性。相反，F(ab’)2构建体表现出较快的血液清除特性，但是非常差的肿瘤定位。应意识到这些限制都被本发明的改变抗体令人惊奇地克服了。
实施例8检验血液清除速率和肿瘤定位从血液清除的数据进行计算这些构建体的有效半寿期和对骨髓的MIRD剂量估计辐射值并示于表1中。免疫缀合物的肿瘤定位数据示于表2中。所报告的剂量被i.v.注射到具有合适肿瘤的BALB/cnu/nu小鼠体内(即实施例6和实施例7的Daudi或者LS174T小鼠)；在预定的时间点收集血液。
本领域的技术人员应理解用注射后1-72小时取的样品以接种剂量/gm组织的百分比(％ID/gm)计算对骨髓的MIRD(吸收的放射)剂量估计值，并报告在表1中。
表1比较正常组织(血液和红骨髓)中Y2B8(IgG和F(ab)2)和CH2结构域缺失构建体的剂量相关参数
表1的检验再次证实了结构域缺失构建体具有更短的半寿期和对骨髓相应的更低的辐射量。更具体的，表1显示出F(ab’)2C2B8构建体和完整的IgG分别有12.9小时和38小时的半寿期。形成显著对比的是结构域缺失的CC49构建体的半寿期在相同剂量时只有6.5小时(即少于完整的IgG 5倍以上)。有意义的是，这样短的半寿期可以使血液和红骨髓基本不暴露于不需要的放射能。MIRD水平(即被输送到骨髓的必需的放射能)的结果显示完整的C2B8 IgG的剂量几乎是等量的结构域缺失的CC49 4倍(即2.2rad/mCi比0.61rad/mCi)。应该强调这种对骨髓照射的减少将导致更少的骨髓毒性，这在开发癌症治疗方案中是一个关键的因素。
如上所示，表2显示了本发明在提供放射性核素高肿瘤定位的优点。应当理解，加强的定位，再加上上述说明的快速血液清除，可以使在肿瘤细胞处特别有效地施用放射性或者细胞毒性化合物。
表2在带瘤裸鼠异种移植(肿瘤定位)中Y2B8[IgG和F(ab)2]与huCC49ΔCH2的剂量比较
如在表2中所示，111In-2B8；111In-huCC49.ΔCH2和125I-huCC49.ΔCH2显示了相似的肿瘤存留时间(分别是0.95，1.15和0.92uCi-hr/uCi)。另外，111In-huCC49.ΔCH2，125I-huCC49.ΔCH2和111In-2B8峰值定位(分别是18.5，16.2和17.8％ID/gm)也相似，但是结构域缺失构建体在输注后6小时达到峰值而完整的2B8是接种后24小时。结构域缺失构建体(用111In或125I标记的片段)的更早定位导致与完整亲本Mab 2B8相比对肿瘤的辐射量估计增加了3倍(即3637rad/mCi比1331rad/mCi)。
再次要强调的是更快的血液清除和增强的肿瘤定位而没有降低肿瘤定位的峰值或者肿瘤存留时间说明使用结构域缺失构建体对使用联合药物疗法的临床方案具有明显优点。
实施例9改变的抗体的协同特性四十只无胸腺的雌性小鼠被皮下注射了0.2ml 2×106的LS174T细胞。使TAG-72+的肿瘤生长至150-200mm3的大小。这时候，小鼠被分成10个一组的四组。这四组分别按以下进行处理1.只用鬼臼亚乙苷2.只用90Y-huCC49.ΔCH23.90Y-huCC49.ΔCH2+鬼臼亚乙苷4.稀释液对照(PBS/DMSO)更具体的，鬼臼亚乙苷的贮存液配制成100mg/ml DMSO溶液。其然后用PBS稀释到6.88mg/ml。第一组的小鼠注射1.72mg鬼臼亚乙苷，每隔四天注射一次，一共注射三次。在第二组，小鼠注射0.05mCi90Y-huCC49.ΔCH2，用螯合剂CHx-DTPA固定放射性同位素。在第三组，小鼠注射了0.05mCi相同的放射标记的改变的抗体和1.72mg鬼臼亚乙苷，然后再注射两次1.72mg鬼臼亚乙苷。对照组小鼠(4)注射PBS/DMSO，浓度为6.9％DMSO，每隔四天注射一次共三次。肿瘤每周测定二到三次，结果示于图11中。
图11显示了鬼臼亚乙苷和结构域缺失放射性标记的CC49抗体联合使用与任何一种药剂单独使用相比更抑制了肿块的生长。这种协同效应在第25天特别显著，与其它单独使用90Y-huCC49.ΔCH2或者鬼臼亚乙苷处理的小鼠相比，联合使用药物使肿瘤减小几乎一半。
本领域的技术人员将进一步意识到本发明可以具体应用到其它特定形式而不偏离其精神或者主要特征。本发明上述内容只公开了其代表性实施方案，应该可以理解其它的变化也包含在本发明的范围之内。因此，本发明并不只局限于在这里所详述的特定实施方案。而且，应该提出所附的权利要求反映本发明的范围和内容。
权利要求
1.与TAG-72反应的结构域缺失的CC49抗体，其包含具有基本如图4A所示的氨基酸序列的重链。
2.权利要求1中的结构域缺失的CC49抗体，其进一步包含细胞毒性剂。
3.权利要求2中的结构域缺失的CC49抗体，其中所述的细胞毒性剂是放射性核素。
4.权利要求3中的结构域缺失的CC49抗体，其中所述的放射性核素选自131I和90Y。
5.权利要求4中的结构域缺失的CC49抗体，其中所述的放射性核素是90Y。
6.权利要求1中的结构域缺失的CC49抗体，其进一步包含氨基酸间隔区。
7.用于治疗肿瘤性疾病的组合物，其包含具有基本如图4A所示的重链氨基酸序列的结构域缺失的CC49抗体，所述的抗体与一个或多个双功能的螯合剂共价结合，其中所述的一个或多个双功能螯合剂与90Y相连接。
8.权利要求7中的组合物，其中所述的双功能螯合剂选自MX-DTPA和CHX-DTPA。
9.与CD20反应的结构域缺失的C2B8抗体，其包含具有基本如图1B公布的氨基酸序列的重链。
10.权利要求9中的结构域缺失的C2B8抗体，其进一步包含细胞毒性剂。
11.权利要求10中的结构域缺失的C2B8抗体，其中所述的细胞毒性剂是放射性核素。
12.权利要求11中的结构域缺失的C2B8抗体，其中所述的放射性核素选自131I和90Y。
13.权利要求10中的结构域缺失的C2B8抗体，其中所述的放射性核素是90Y。
14.在有此需要的病人中使包含肿瘤相关抗原的肿瘤成像的方法，其包含以下步骤给予所述的患者改变的抗体，所述的改变的抗体与成像剂相连并结合到所述的肿瘤相关抗原上；并对所述的患者成像以显示所述的肿瘤。
15.权利要求14的方法，其中所述的成像剂是放射性同位素。
16.权利要求15的方法，其中所述放射性同位素与所述的改变的抗体通过双功能螯合剂相连。
17.权利要求15的方法，其中所述的放射性同位素选自111In和90Y。
18.治疗患有肿瘤性疾病的骨髓抑制的患者的方法，包含给予所述的患者治疗有效量的改变的抗体的步骤。
19.权利要求18的方法，其中所述的改变的抗体包含结构域缺失的抗体。
20.权利要求19的方法，其中所述的结构域缺失抗体缺少了CH2结构域。
21.权利要求20的方法，其中所述的结构域缺失抗体包含氨基酸间隔区。
22.权利要求18的方法，其中所述的改变的抗体与肿瘤相关抗原反应。
23.权利要求22的方法，其中所述的肿瘤相关抗原选自CD2、CD3、CD5、CD6、CD7、MAGE-1、MAGE-3、MUC-1、HPV 16、HPV E6、HPV E7、TAG-72、CEA、L6-抗原、CD19、CD20、CD22、CD37、HLA-DR、EGF受体和HER2受体。
24.权利要求22的方法，其中所述的肿瘤相关抗原包含CD20。
25.权利要求22的方法，其中所述的肿瘤相关抗原包含TAG-72。
26.权利要求17的方法，其中所述的改变的抗体与细胞毒性剂相连。
27.权利要求25的方法，其中所述的细胞毒性剂包含放射性同位素。
28.权利要求26的方法，其中所述的放射性同位素选自90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。
29.权利要求27的方法，其中所述的放射性同位素包含90Y。
30.权利要求18的方法，其中所述的肿瘤性疾病是血液肿瘤。
31.权利要求18的方法，其中所述的骨髓抑制患者的ANC少于约1500/mm3。
32.权利要求31的方法，其中所述的骨髓抑制患者具有的白细胞数少于约1000/mm3。
33.治疗表现为肿瘤性疾病患者的方法，包含的步骤为给予所述的患者治疗有效剂量的至少一种化疗剂；并给予所述的患者治疗有效剂量的至少一种改变的抗体，其中所述的化疗剂和所述的改变的抗体可以以任何顺序或者同时给予。
34.权利要求33的方法，其中所述的改变的抗体包含结构域缺失的抗体。
35.权利要求34的方法，其中所述的结构域缺失抗体缺少CH2结构域。
36.权利要求35的方法，其中所述的结构域缺失抗体包含间隔区。
37.权利要求33的方法，其中所述的改变的抗体与肿瘤相关抗原反应。
38.权利要求37的方法，其中所述的肿瘤相关抗原选自CD2、CD3、CD5、CD6、CD7、MAGE-1、MAGE-3、MUC-1、HPV 16、HPV E6、HPV E7、TAG-72、CEA、L6-抗原、CD19、CD20、CD22、CD37、HLA-DR、EGF受体和HER2受体。
39.权利要求37的方法，其中所述的肿瘤相关抗原包含CD20。
40.权利要求37的方法，其中所述的肿瘤相关抗原包含TAG-72。
41.权利要求33的方法，其中所述的改变的抗体与细胞毒性剂相连。
42.权利要求41的方法，其中所述的细胞毒性剂包含放射性同位素。
43.权利要求42的方法，其中所述的放射性同位素选自90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。
44.权利要求42的方法，其中所述的放射性同位素包含90Y。
45.权利要求33的方法，其中所述的肿瘤性疾病是血液肿瘤。
46.权利要求33的方法，其中所述的患者的白细胞数少于约1500/mm3。
47.权利要求33的方法，其中所述的患者白细胞数少于约1000/mm3。
48.权利要求33的方法，其中所述的化疗剂在所述的改变的抗体之前给予。
49.权利要求48的方法，其中所述的改变的抗体在所述的化疗剂一个月内给予。
50.权利要求48的方法，其中所述的改变的抗体在所述的化疗剂两周内给予。
51.一种在正进行化疗的患者中治疗肿瘤性疾病的方法，包含给予所述的患者治疗有效剂量的改变的抗体的步骤。
52.一种治疗患者血液肿瘤的方法，包含给予所述的患者治疗有效剂量的改变的抗体的步骤。
53.权利要求52的方法，其中所述的改变的抗体是结构域缺失的抗体。
54.权利要求53的方法，其中所述结构域缺失抗体缺少CH2结构域。
55.权利要求54的方法，其中所述的结构域缺失抗体与CD20反应。
56.权利要求55的方法，其中所述的结构域缺失抗体包含具有基本如图1B所示的氨基酸序列的重链。
57.权利要求56的方法，其中所述的血液肿瘤包含非霍奇金淋巴瘤。
58.一种治疗具有肿瘤性疾病的复发患者的方法，包含给予所述的患者治疗有效剂量的改变抗体的步骤。
59.一种治疗患有结肠癌的患者的方法，包含给予治疗有效剂量的huCC49.ΔCH2的步骤。
60.一种治疗患有血液恶性肿瘤的患者的方法，包含给予治疗有效剂量的C2B8.ΔCH2的步骤。
全文摘要
本发明提供了包含改变的抗体的新化合物、组合物和方法。在优选实施方案中，公开的改变的抗体包含具有一个或多个恒定结构域改变或缺失的抗体，从而提供了有益的生理学特性，例如增强靶物质定位以及快速的血液清除。本公开的化合物特别用于治疗骨髓抑制患者的肿瘤疾病。
文档编号C12P21/02GK1494553SQ02805935
公开日2004年5月5日 申请日期2002年1月29日 优先权日2001年1月29日
发明者G·R·布拉斯劳斯克, N·翰纳, P·驰尼, G R 布拉斯劳斯克 申请人:Idec药物公司