专利名称：一种提高埃博霉素b产率的生物合成方法
技术领域：
本发明涉及一种埃博霉素的生物合成方法，具体地说是一种工业化生产提高埃博霉素B产率的生物合成方法，属于抗生素微生物发酵培养领域。
背景技术：
埃博霉素B属于大环内脂类抗生素新成员，埃博霉素是一类具有独特结构和独特生物活性的抗生素。其分子结构如下
权利要求
1.一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，其特征在于包括如下步骤(1)、生产出发菌种，Soce90-G15:通过3000rpm离心摇瓶菌液选取生长健壮的粘细菌作为生产出发菌种；(2)、固体斜面扩培培养基的组分按质量％计为，葡萄糖0.5 1%、蛋白胨O.3 0.5%、淀粉O.5 I %、氯化钠O. I 0.5%、赤霉素O. 002%和琼脂粉2%，余量为水；培养基在120°C、30分钟灭菌冷却后布置成斜面，24小时后把生产出发菌种涂布于斜面上，在 30±2°C、相对湿度55%，7 9天可见生长丰满、金黄色的菌苔，冷藏待用；(3)、摇瓶扩培摇瓶培养基为淀粉5 8g/L、酵母提取物2 4g/L、葡萄糖O.5 1.5g/L、MgS04 lg/L,CaCl2 lg/L、甘油 O. 5 lg/L、磷酸二氢钠 O. 05g/L、豆饼粉 2 4g/L， 饮用水I升，调PH为7. 20、在120°C、30分钟灭菌；把固体斜面的菌苔轻轻刮下接入摇瓶培养基，在29°C ± 1°C、转速150rpm下，生长5 6天；选取菌体生长健壮的摇瓶菌种液转接入一级种子罐；(4)、一级种子培养一级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120°C、30分钟灭菌；把生长好的摇瓶菌种液通过压差法接入一级种子罐中扩培，培养温度29±2°C、转速 120rpm、空气流量比I比O. 4、罐压O. 04kg/cm2，培养5 6天，将生长旺盛的菌种液转接入二级种子罐；(5)、二级种子罐培养二级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120°C、30分钟灭菌；把生长好的一级菌种液通过压差法接入二级种子罐中扩培，培养温度29±2°C、转速 120rpm、空气流量比I比O. 5、罐压O. 04kg/cm2，培养2 3天，将生长旺盛的菌种液转接入发酵罐；(6)、发酵罐培养发酵培养基的组成与摇瓶培养基相同，但外加前体诱导物O.2 O.5g/L、大孔吸附树脂20g/L ;PH调整至7. 30，120°C >30分钟灭菌；把生长好的二级菌种液通过压差法接入发酵罐中扩培，培养产品的温度29±2°C、转速150rpm、空气流量比I比O.8、罐压 O. 04kg/cm2、培养 10 11 天;(7)、洗涤、洗脱发酵至残糖低于0.2%，在代谢活性物质产出高点时终止发酵，将发酵液中的的树脂分离出来淘洗干净装入树脂床内；用50%甲醇洗涤I倍柱床量、流速25ml/ min，脱色、除杂；再用6倍柱床量乙酸乙酯，流速15ml/min洗脱埃博霉素A、埃博霉素B活性物质，收集洗脱液；(8 )、真空浓缩把收集的含活性物质的洗脱液真空浓缩，温度4 O 4 5 °C、真空度-O. 085 -O. 095MPa，浓缩至原始体积量的1/15以下；(9)、液相制备柱分离把浓缩液通过液相制备柱分离收集埃博霉素B部份分离液；(10)、萃取把收集的含埃博霉素B分离液真空浓缩至剩余水相，加入有机溶剂进行萃取分离收集有机相；(11)、结晶把收集的有机相真空浓缩，温度40 45°C、真空度-O.085 -O. 09MPa、浓缩至原始体积量的1/10以下；把浓缩液放入洁净的结晶器中_20°C低温结晶；(12)、真空干燥；收集结晶体放入洁净的真空干燥箱，温度45 50°C、真空度-O. 085 -O. 09MPa ;干燥得到含量99. 5%以上的活性产物埃博霉素B成品。
2.根据权利要求I所述的一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，其特征在于所述的扩培可采用摇瓶振荡培养或搅拌沉没培养方式，工业化生产首选搅拌沉没方式。
3.根据权利要求I所述的一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，其特征在于所述在发酵培养基中外加的前体诱导物为苯丙氨酸，或是它的有机盐，其加入培养基的方法为一次投入或是间歇流加。
全文摘要
本发明涉及一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，其步骤是采用离心法选出健壮的产埃博霉素B菌种接种于灭菌的种子培养基中，在30℃的摇床振荡培养后再发酵；并向发酵培养基中添加前体诱导物苯丙氨酸；在30℃培养10～11天后收获培养液；再经大孔树脂收集吸附饱和，乙酸乙酯洗脱，分离纯化、真空浓缩、萃取、低温结晶、真空干燥。本发明将动态洗脱法用于埃博霉素B的工业化生产，使规模化生产成为可能。通过液相制备柱可有效地提纯埃博霉素B的纯度，其纯度可达99.5％以上，同时采用甲醇进行萃取分离，使埃博霉素B在甲醇中结晶，成品能达到医药级水平。本方法大幅度提高埃博霉素B产率达到30～45％，具有良好的工业化生产前景。
文档编号C12P17/18GK102586358SQ20121000693
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者何福彪, 张文凯, 陈庆源 申请人:湖北宏中药业有限公司