专利名称：一种基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒性脑膜脑炎病原体的诊断，特别是一种针对造成病毒性脑膜脑炎的主要病原体，包括DNA病毒单纯疱疹病毒I型HSV-I、II型HSV-II和Epstein-Barr病毒；RNA病毒EV71、柯萨奇病毒CA16、埃可病毒ECHO的诊断试剂盒。
背景技术：
病毒性脑膜脑炎是常见的中枢神经系统感染性疾病，常表现为发热、头痛、抽搐、意识障碍和脑膜刺激症状等，可致中枢神经系统局灶性损害。病毒性脑膜脑炎预后不佳，死 亡率高，常留有严重后遗症。目前，病原体培养是感染疾病诊断的标准，但实际临床工作中，中枢神经系统感染的病原体检出十分困难，常常造成确诊困难，误诊率和漏诊率很高，而且该方法耗时、操作复杂；分子生物学中的PCR技术的应用可以帮助临床作出快速诊断，但因其灵敏度过高，容易出现假阳性；免疫学方法检测病原体特异性相关抗体，也是常用的一种诊断手段，但其阳性率较低而且一次只能筛查一种病原体，不能为临床提供有力依据。因此，寻找一种早期快速、灵敏特异、一次可筛查多种病原体(高通量)的实验诊断方法就突显其重要性。近年来出现的高通量xMAP技术为我们解决中枢神经系统感染的病原诊断带来了希望。它的核心技术是在不同荧光编码的微球共价耦联寡核苷酸、抗原、抗体、酶、底物、配体或受体形成微球生物探针(包括寡核苷酸及蛋白生物探针)，之后将不同的微球混合，与待测样品(如血清、脑脊液、PCR产物等)进行反应或杂交。待微球与样品中抗原、抗体或核苷酸结合后，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应。因此xMAP技术是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。该技术已成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具，也是最早通过美国食品与药物管理局(FDA)认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。
发明内容
本发明的目的在于改进已有检测方法的不足，依靠xMAP技术平台，实现快速，敏感特异，高通量检测病毒性脑膜脑炎病原体，对诊断疾病具有重要的临床应用价值。本发明实现过程如下
一种基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒，包括下列部件
1)探针耦联编码微球A液，I管，内装6种不同微球分别耦联六种病毒探针；
2)B液，I管，内装I. 5X氯化四甲铵(I. 5XTMAC);
3)C液，I管，内装IX氯化四甲铵(IXTMAC);
4)D 液，I 管，内装 I XTE，pH 8.0 ；
5)E液，I管，内装链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
6)F液，引物，6管，分别装有六种病毒特异性引物，其中下游引物5’末端经biotin修
饰；7)阳性对照G液，6管，分别装有六种病毒标准株基因组DNA阳性模板；
8)96孔滤模板，I张。
上述基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒，其六种病毒探针及引物是根据各自基因保守区序列设计的，探针的5’末端用H2N-C12标记，其DNA序列分别如下
探针序列(5’-3’ )
HSV-I TCCGTGTTCACCACGAGTACCTGCGTCACCHSV-II CGCGCTTATGGACACACCACACGACAACAAEpstein-Barr CGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGAEV71 CATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCA 16 :GATGCCAACACGGTGTAGTAGGAATTGTCTECHO CTATGATGGATGGTCTCACTTCAGTCAGAG引物序列(5’-3’ )
HSV-I 上游弓 I 物一GCCGTTGAGCTAGCCAGCGA下游引物一 GTGCTGGTGCTGGACGACAC-biotinHSV-II 上游引物一GTAAGCGCGGGCCAAAGGAT下游引物一TCAAACACGGAAGCCCGAAC - biotinEpstein-Barr :上游引物一CCTGCCAAAGAGCCAGATCTAAG下游引物一AGCCAACCATAGACCCGCTTCCT - biotinEV71 :上游引物一 GAGCCCTCACTCATGCTCTAC下游引物一AGITGTGCCTTCAAGAGGGAG - biotinCA 16 :上游引物一 CCTACAGCTGCCAACACTGAA下游引物一ACCATCCGTGITCTGTGTACC - biotinECHO :上游引物一 CCAGGATGTCGATACCATTCATGAG下游引物一TCACCCCTTGCACATCAAAGITGAC - biotin。上述基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒的使用方法，按下列步骤进行
(1)病毒基因组DNA或RNA提取，RNA需逆转录为cDNA；
(2)设计五种病毒引物，下游引物5’末端用Biotin修饰，进行PCR扩增产物；
PCR 扩增反应体系包括10XMulti Hotstart Buffer、超纯 dNTP (2.5 mM each), DNAPo I ymerase、上游引物、下游引物、基因组DNA模板、UDG、dUTP、ddH20 ；
按下列条件扩增
95° C 10 min 预变性，一94° C 30 sec 35 个循环一72° C 10 min —4° C 保存
57。C 90 sec 72。C 60 sec ；
(3)杂交检测
I)准备探针微球混合工作液用I. 5 X TMAC杂交液B液使探针微球A液的浓度稀释为每种微球150个/ ii 1，震荡混匀；
2分别向样本管、阳性对照管、阴性对照管和空白管加入33 Ul探针微球混合工作液；
3)向各样本管、阳性对照管和阴性对照管依次对应加入5 u I已生物素化的PCR产物，空白管加入5iU ddH20，然后向各反应管补加pH 8. O的TE buffer D液，使反应总体积为50u I ；
4)将各反应管置于PCR仪，设置反应条件，95°C 5 min, 55° C 15 min ；
5)在第4步同时，用C液IXTMAC配制新鲜的31^/ml的SA-PE，震荡混匀；
6)将第4步中的反应液转移入预湿的96孔滤模板孔内，负压真空抽滤除去上清，依次向每孔加入100 W 3Pg/ml的SA-PE，震荡混匀，室温避光孵育IOmin ;迅速将96孔滤模板转移至LumineX200液相芯片检测仪内，设置杂交温度后进行检测；检测样本的荧光信号值大于四倍阴性对照荧光信号值则为阳性，反之视为阴性。 本发明选择6种常见病毒性脑膜脑炎病原体的特异性基因，从GenBank获得保守基因序列，进行序列比对，保证其特异性。应用oligo6. 65设计特异性引物及寡核苷酸探针，通过生物信息学分析和试验验证，筛选出针对六种病原体的6对特异性引物及相应的探针。首先用5’-H2NC12标记的寡核苷酸探针包被不同编码微球作为反应载体，然后将各种探针荧光微球混合，制作悬浮芯片，与单重或多重PCR扩增片段进行杂交反应，最后应用Luminex200流式荧光微球检测分析仪进行定性和定量检测。这种技术可以同时检测六种病毒性脑膜脑炎病原体，而且可检测到Pg级DNA含量，具有很高的特异性和灵敏性。本发明的病毒性脑膜脑炎诊断试剂盒是一种基于xMAP技术的液相芯片，它以病毒特异性寡核苷酸探针耦联荧光编码微球为反应载体，与检测样本中的病毒基因组进行杂交，通过Luminex200分析仪快速、特异、高通量地对病原体进行检测，因此优于传统和常规的生物学检测方法，所以该试剂盒可大大提高病毒性脑膜脑炎的诊断效率，具有很高的实用价值。
具体实施例方式本发明基于xMAP技术及液相芯片检测方法对病原进行检测。运用生物信息学知识和相关生物信息学知识软件，对6种目标病毒的核苷酸序列分别进行同源性分析，设计引物和探针，通过PCR，分子杂交，再用Luminex200系统进行检测，从而确定样本中所含病原体的种类。下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例I
已知样本中含有单纯疱疹病毒I型HSV-I，按本发明的方法进行检测，具体操作如下
1、提取样本总DNA；
2、以步骤I中提取的样本总DNA为模板，以HSV-I特异性生物素修饰PCR引物进行扩增，同时分别以G液中HSV-I病毒标准株基因组DNA和超纯水作为阳性对照和阴性对照，弓丨物序列如下(5’-3’ )
上游引物一 GCCGTTGAGCTAGCCAGCGA 下游引物一 GTGCTGGTGCTGGACGACAC-biotin
3、在PCR 管中加入下列物质10XMulti Hotstart Buffer5 y I、超纯 dNTP (2. 5 mMeach) 4 u I, DNA Polymerasel yl、上游引物 lyl、下游引物 I ul、基因组 DNA 模板 I ii I、UDG0. 5 ii I、dUTPO. 2 y I、ddH20 补至 50 yl。4、PCR过程条件为95。C 10 min ;94。C 30 sec,57° C 90 sec,72° C 60 sec,共35个循环；72° C10min;4° C保存。5、准备探针微球混合工作液用I. 5 X TMAC杂交液B液使探针微球A液的浓度稀释为每种微球150个/ul，震荡混匀；六种编码微球分别耦联六种H2N-C12标记病毒探针，序列如下(5’-3’ )
HSV-I TCCGTGTTCACCACGAGTACCTGCGTCACCHSV-II CGCGCTTATGGACACACCACACGACAACAAEpstein-Barr CGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGAEV71 CATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCA 16 :GATGCCAACACGGTGTAGTAGGAATTGTCTECHO CTATGATGGATGGTCTCACTTCAGTCAGAG
6、分别向样本管、阳性对照管、阴性对照管和空白管加入33Ul探针微球混合工作液；
7、向各样本管、阳性对照管和阴性对照管依次对应加入5u I已生物素化的PCR产物，空白管加入5 ill ddH20，然后向各反应管补加TE buffer (PH 8. 0) D液，使反应总体积为50u I ；
8、将各反应管置于PCR仪，设置反应条件，95°C 5 min, 55° C 15 min ；
9、在第8步同时，用C液IXTMAC配制新鲜的SA-PE(3l^g/ml)，震荡混匀；
10、将第8步中的反应液转移入预湿的96孔滤模板孔内，负压真空抽滤除去上清，依次向每孔加入IOOW SA-PE (31^/ml)，震荡混匀，室温避光孵育IOmin ；
11、迅速将96孔滤模板转移至LumineX200液相芯片检测仪内，设置杂交温度后进行检测。检测样本的荧光信号值大于四倍阴性对照信号值则为阳性，反之视为阴性；
12、用LumineX200液相芯片检测仪分别读取经步骤10杂交后的6种微球上的荧光标记的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值，结果如下
I)空白管背景孔中，荧光检测值为145。2) 阴性对照孔中，荧光检测值为194. 3。3) 阳性对照孔中，荧光检测值为8025. 3。4) 微球耦联探针为HSV-I的荧光检测值为7418. 3。5) 微球耦联探针为HSV- II的荧光检测值为205.8。6) 微球稱联探针为Epstein-Barr病毒的突光检测值为338. 3。7) 微球耦联探针为EV71的荧光检测值为253. 8。8) 微球耦联探针为CA16的荧光检测值为325. 8。9) 微球耦联探针为ECHO的荧光检测值为310. 3。微球耦联探针中探针为HSV-II、Epstein-Barr, EV71、CA16和ECHO的杂交产物的荧光检测值分别小于四倍的阴性对照的荧光检测值，认为样本中不含有HSV- 11、Epstein-Barr, EV71、CA16和ECHO五种病毒。微球耦联探针中探针为HSV- I的杂交产物的突光检测值大于四倍的阴性对照的突光检测值，认为样本中含有HSV- I病毒。实施例2
已知样本中含有EV71病毒，因其为RNA病毒，所以在第一步中首先提取RNA，再逆转录为cDNA，之后按本发明的方法进行检测，具体步骤如实施例I (2-12)。荧光检测值的结果如下I) 空白管背景孔中，荧光检测值为103。2) 阴性对照孔中，荧光检测值为153. 5。3) 阳性对照孔中，荧光检测值为5730. 5。4) 微球耦联探针为HSV-I的荧光检测值为168。5) 微球耦联探针为HSV- II的荧光检测值为273. 5。
6) 微球稱联探针为Epstein-Barr病毒的突光检测值为189。7) 微球耦联探针为EV71的荧光检测值为3970。8) 微球耦联探针为CA16的荧光检测值为359。9) 微球耦联探针为ECHO的荧光检测值为281. 5。微球耦联探针中探针为HSV-I、HSV-II, Epstein-Barr, CA16和ECHO的杂交产物的荧光检测值分别小于四倍的阴性对照的荧光检测值，认为样本中不含有HSV-I、HSV-II、Epstein-Barr,CA16和ECHO五种病毒。微球耦联探针中探针为EV71的杂交产物的荧光检测值大于四倍的阴性对照的荧光检测值，认为样本中含有EV71病毒。实施例3
I例未知病毒样本按本发明的方法进行检测，具体操作如下
1、提取样本总DNA和总RNA，后者反转录为cDNA；
2、以步骤I中获得的DNA和cDNA为模板，以六种特异性生物素修饰PCR引物进行多重扩增，同时以超纯水作为阴性对照。3、在 PCR 管中加入下列物质10XMulti Hotstart Buffer5 U I、超纯 dNTP (2. 5 mM each) 4 U 1、DNA Polymerasel U I、上游引物Iy I、下游引物Iu I、基因组DNA模板
Iu l、cDNA 模板 Iii 1、UDG0. I, dUTPO. 2 u I、ddH20 补至 50 y I (其中 6 对引物同时加入
反应体系)。其余步骤同实施例1，荧光检测值的结果如表I。
表I 样本检测荧光值 HSV-I HSV-II Epstein-Barr EWl CAl 6 ECHO 样本 236 198.5203180 176.5 7532
阴性对照 75 718066 82 63
空白背景 50 5263.553 61 59.5样本经过多重PCR，与6种特异的微球耦联探针杂交后，应用Luminex200流式荧光微球检测分析仪对杂交产物进行检测。微球耦联探针中探针为HSV-I , HSV-II,Epstein-Barr, EV71和CA16的杂交产物的荧光检测值分别小于四倍的阴性对照的荧光检测值，认为样本中不含有HSV-I、HSV- II、Epstein-Barr, EV71和CA16五种病毒。微球耦联探针中探针为ECHO的杂交产物的荧光检测值大于四倍的阴性对照的荧光检测值，认为样本中含有ECHO病毒。
权利要求
1.一种基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒，其特征在于包括下列部件 (1)探针耦联编码微球A液，I管，内装6种不同微球分别耦联六种病毒探针； (2)B液，I管，内装I. 5X氯化四甲铵； (3)C液，I管，内装IX氯化四甲铵； (4)0液，1管，内装1父丁￡，？118. O ； (5)E液，I管，内装链酶亲和素-藻红蛋白； (6)F液，引物，6管，分别装有六种病毒特异性引物，其中下游引物5’末端经biotin修饰； (7)阳性对照G液，6管，分别装有六种病毒标准株基因组DNA阳性模板； (8)96孔滤模板，I张。
2.根据权利要求I所述的基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒，其特征在于六种病毒探针及引物是根据各自基因保守区序列设计的，探针的5’末端用H2N-C12标记，其DNA序列分别如下 探针序列(5’-3’ )HSV-I TCCGTGTTCACCACGAGTACCTGCGTCACCHSV-II CGCGCTTATGGACACACCACACGACAACAAEpstein-Barr CGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGAEV71 CATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCA 16 :GATGCCAACACGGTGTAGTAGGAATTGTCTECHO CTATGATGGATGGTCTCACTTCAGTCAGAG引物序列(5’-3’ )HSV-I 上游弓 I 物一GCCGTTGAGCTAGCCAGCGA下游引物一 GTGCTGGTGCTGGACGACAC-biotinHSV-II 上游引物一GTAAGCGCGGGCCAAAGGAT下游引物一TCAAACACGGAAGCCCGAAC - biotinEpstein-Barr :上游引物一CCTGCCAAAGAGCCAGATCTAAG下游引物一AGCCAACCATAGACCCGCTTCCT - biotinEV71 :上游引物一 GAGCCCTCACTCATGCTCTAC下游引物一AGITGTGCCTTCAAGAGGGAG - biotinCA 16 :上游引物一 CCTACAGCTGCCAACACTGAA下游引物一ACCATCCGTGITCTGTGTACC - biotinECHO :上游引物一 CCAGGATGTCGATACCATTCATGAG下游引物一TCACCCCTTGCACATCAAAGITGAC - biotin。
3.权利要求I所述的基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒的使用方法，按下列步骤进行 (1)病毒基因组DNA或RNA提取，RNA需逆转录为cDNA； (2)设计五种病毒引物，下游引物5’末端用Biotin修饰，进行PCR扩增产物； PCR 扩增反应体系包括10XMulti Hotstart Buffer、超纯 dNTP、DNA Polymerase、上游引物、下游引物、基因组DNA模板、UDG、dUTP、ddH20 ；按下列条件扩增 95° C 10 min 预变性，一94° C 30 sec 35 个循环一72° C 10 min —4° C 保存 57。C 90 sec 72。C 60 sec ； (3)杂交检测 A、准备探针微球混合工作液用I.5 X TMAC杂交液B液使探针微球A液的浓度稀释为每种微球150个/ ii 1，震荡混匀； B、分别向样本管、阳性对照管、阴性对照管和空白管加入33Ul探针微球混合工作液；C、向各样本管、阳性对照管和阴性对照管依次对应加入5u I已生物素化的PCR产物，空白管加入5iU ddH20，然后向各反应管补加pH 8. (^ATE buffer D液，使反应总体积为50u I ； D、将各反应管置于PCR仪，设置反应条件，95°C 5 min, 55° C 15 min ； E、在第4步同时，用C液IXTMAC配制新鲜的31^/ml的SA-PE，震荡混匀； F、将第4步中的反应液转移入预湿的96孔滤模板孔内，负压真空抽滤除去上清，依次向每孔加入100 W 3Pg/ml的SA-PE，震荡混匀，室温避光孵育IOmin ;迅速将96孔滤模板转移至LumineX200液相芯片检测仪内，设置杂交温度后进行检测；检测样本的荧光信号值大于四倍阴性对照荧光信号值则为阳性，反之视为阴性。
全文摘要
本发明公开了一种基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒，包括探针耦联编码微球、氯化四甲铵、TE、链酶亲和素-藻红蛋白及六种病毒特异性引物，其中下游引物5'末端经biotin修饰、六种病毒标准株基因组DNA阳性模板和96孔滤模板。本发明的病毒性脑膜脑炎诊断试剂盒是一种基于xMAP技术的液相芯片，它以病毒特异性寡核苷酸探针耦联荧光编码微球为反应载体，与检测样本中的病毒基因组进行杂交，通过Luminex200分析仪快速、特异、高通量地对病原体进行检测，因此优于传统和常规的生物学检测方法，该试剂盒可大大提高病毒性脑膜脑炎的诊断效率。
文档编号C12R1/93GK102643928SQ20121001066
公开日2012年8月22日 申请日期2012年1月15日 优先权日2012年1月15日
发明者赵钢 申请人:中国人民解放军第四军医大学