专利名称：唐氏综合征产前无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种唐氏综合征产前无创检测试剂盒，本诊断试剂盒能够对第9周后的孕妇进行早期的检测和诊断，根据检测结果从基因层面准确诊断出胎儿是否患有唐氏综合征。
背景技术：
新生儿中有少部分存在先天性遗传病或出生缺陷，给社会和家庭带来巨大的经济和精神负担。2007年中国有1564万新生儿出生，其中出生缺陷率超过1%。出生缺陷是影响我国全民健康水平和人口素质的重要问题。国家“十一五”规划纲要将生殖健康相关技术列为科技发展优先主题；2006-2020年国家中长期规划也将“出生缺陷防治”作为重点领域和优先主题。我国每年约出生80 120万缺陷婴儿；造成经济损失约10亿元人民币。 遗传病是新生儿缺陷的最主要原因之一，而且许多先天性出生缺陷往往缺乏有效的治疗方法，因此早期诊断和预防是目前降低出生缺陷的最有效措施。唐氏综合征是小儿最为常见的由常染色体畸变性所导致的出生缺陷类疾病。顾名思义，该病是由先天因素造成的具有特殊表型的智能障碍。我国活产婴儿中唐氏综合征的发生率约为0.5%。-O. 6%。，男女之比为3 2，60%的患儿在胎儿早期即夭折流产。患儿的主要临床特征为智能障碍、体格发育落后和特殊面容，并可伴有多发畸形，给患儿及家庭带来极大的痛苦。因此，胎儿有否换上唐氏综合征是孕妇选择进行产前检查的主要原因，是降低畸形儿出生率最为有效的办法之一。现在世界上进行这类诊断通常是在孕期第16到18周间进行的，办法一是通过子宫穿刺羊膜腔，从羊水中获取胚胎细胞，二是提取胎盘组织进行活体检查，但这两种办法都比较复杂，且都是采用介入式方法进行，对孕妇和胎儿有可能引起一定的损伤，甚至有时会引发宫内感染、羊膜破裂、流产、胎儿畸形或死亡等。由于其潜在的风险，此类诊断临床上一般只针对高龄孕妇和有家族畸形遗传史的孕妇进行，其排查和检测的范围小，因此，也难以对整个新生儿先天性遗传病或出生缺陷的产前诊断做出足够的贡献。目前，开发新的方便、安全的胎儿基因或染色体诊断技术是国内外相关领域的热点领域。比如从外周血中获取或富集胚胎细胞用于胎儿遗传诊断近年来取得了一定的进展。如法国国家卫生与医学研究所(INSERM)的科学家利用胚胎细胞比母体血液细胞大的特点，尝试从孕妇的血液中分离出胚胎细胞，然后再通过分析母体和父体基因的遗传特性， 进行细胞筛选。对13名孕期为11到12周的孕妇进行的诊断实验表明，这种细胞筛选法是可行的，母体血液化验法在理论上可以替代羊膜腔穿刺术和胎盘活组织检查。但是其检查不同胎儿畸形症状时的敏感性、可靠性还有待确认，且由于胚胎细胞数量少，对于检验仍然存在较大的困难。本领域需要提供更方便、安全的非介入性胎儿基因或染色体诊断相关技术。本试剂盒正是基于此而开发的，只要孕妇的孕周达到12周，即可向医生咨询进行非侵入性的唐氏综合征无创产前检测，大大减轻了孕妇的痛苦和风险，具有很好的应用前景。
发明内容
基于能够利用孕妇血液循环中游离的DNA来建立胎儿的有效DNA文库，从而同时完成21号染色体三体综合征，13三体综合征，18三体综合征的检测。且结果准确，无假阳性和无假阴性的基础上，本发明提供一种唐氏综合征产前无创检测试剂盒。该试剂盒包括T4 DNA连接酶缓冲液；Klenow 片段(5 单位 /ul)；T4多核苷酸激酶(T4 PNK)；接头序列；DNA测序引物；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。测序反应体系25%BigDye mix lul ；3. 2uM DNA 测序引物 lul ;125mMEDTA 溶液 Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例I.检测试剂盒的使用I. DNA 的获取从孕妇的离体外周血液中提取的DNA片段。获取孕妇的离体外周血衆，使用试剂盒QIAamp DNA Midi reagent set (Qiagen, catlog#51183)提取血浆中的游离DNA，方法是使用该试剂盒中的血液和体液处理方法 ("blood and body fluid" protocol) qDNA 的纯化过程使用 the QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒自动进行在QIAcube (Qiagen 9001292)上进行，此步骤可通过这些试剂盒自动完成。·2.末端修复从孕妇的血液中提取的DNA是双链DNA片段，这些片段是平端的，或含有3或5'突出端。这一步是通过T4 DNA聚合酶，大肠杆菌DNA多聚酶I大片段(Klenow片段)，和多核苷酸激酶T4，使突出端磷酸化成平末端。3'到5'外切酶活性去除3'突出端，聚合酶活性填充5'突出端。Sambrook等(1989)对这一步过程做了更详细的解释。重要的是这种方法采用了大肠杆菌DNA多聚酶I大片段(Klenow片段)，而不是用步骤三使用的缺失了到5'外切酶活性的Klenow片段。材料从血浆DNA 中提取 DNA (DNA I 至 5ng，30 μ I 水)。Τ4 DNA连接酶缓冲液与IOmM ΑΤΡ。dNTP s 的混合物(IOmM)。T4 DNA 聚合酶(3 单位 / μ I)。Klenow 片段(5 单位 / μ I)。Τ4 PNK (Τ4多核苷酸激酶，10单位/ μ I)，QIAquick PCR扩增纯化试剂盒(QIAGEN 公司，目录编号#28104)。程序(I)以I : 5的比例，用水稀释lU/ul浓度的DNA偶合聚合酶。(2)准备以下反应的组合
权利要求
1.一种用于唐氏综合征产前无创检测筛查的试剂盒，其特征在于T4 DNA连接酶缓冲液、Klenow片段(5单位/ul)、T4多核苷酸激酶(T4PNK)、接头序列、DNA测序引物、PCR反应组件、DNA测序反应组件等。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的接头序列是指将DNA片段进行修饰，从而能够在PCR仪中进行扩增制备文库的两对特异性的接头序列。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的PCR引物是指用PCR方法特异性扩增出接头序列修饰后的DNA片段的一对PCR引物。
4.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA测序引物是指针对于每个 DNA文库第I号-第22号染色体进行测序统计分析的I条特异性测序引物序列。
5.根据权利要求I所示的试剂盒，其特征在于，所含的2对接头序列如下(1)接头序列la 5/ ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3'接头序列 Ib : 5' pGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT3'(2)接头序列2a 5/ pGATCGGAAGAGCTCGTATG CCGTCTTCTGCTTG 3'接头序列 2b :5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT3'。
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所含的I对PCR引物序列如下(1)PCR引物序列I5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3'(2)PCR 弓丨物序列 2:5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT3'。
7.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所含的I条测序引物序列如下测序引物序列5' ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3'。
8.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1) 0 反应体系10父？0 反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶O. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)测序反应体系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA测序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
全文摘要
本发明提供了一种检测唐氏综合征的产前无创检测试剂盒。该试剂盒包括T4DNA连接酶缓冲液、Klenow片段(5单位/ul)、T4多核苷酸激酶(T4PNK)、接头序列、DNA测序引物、PCR反应组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过从孕妇的外周血中建立离体的DNA文库，能够针对胎儿的基因组序列准确测序，从而用于胎儿的唐氏综合症筛查，且结果准确，无假阳性和无假阴性。并且检测可以用于少量的离体外周血样本，大大减轻了孕妇的痛苦和风险，具有很好的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102605083SQ201210086800
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者伍建, 姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司