专利名称：口腔癌易感基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种口腔癌易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估口腔癌发病的风险级别，并作为预防和治疗口腔癌的方向指导。
背景技术：
口腔癌是发生在口腔的恶性肿瘤的总称，大部分属于鳞状上皮细胞癌。在临床实践中口腔癌包括唇癌、牙銀癌、舌癌、软硬腭癌、颌骨癌、口底癌、口咽癌、涎腺癌和上颌窦癌以及发生于颜面部皮肤粘膜的癌症等。口腔癌是头颈部较常见的恶性肿瘤之一。口腔癌在全世界是居第六位的常见肿瘤，并且男性的发生率较女性高I至5倍。在发展中国家，口腔癌是一大问题。口腔癌的发生率与年龄的增加有关。40岁后发生率急剧上升。随着世界老龄人口的增加，将有更多的老年人处于口腔癌的高度危险之中。其危险随年龄增长急剧上升，由30岁男性的7/10万升至60岁时80/10万。口腔癌发生初期，往往无痛苦，不易引起患者的重视，或者患者虽然发现一些异常但希望其能自行消失。口腔癌最好的治疗方法莫过于手术切除。但一般当口腔癌被确诊时， 往往错过了最佳手术时机。此时即使可以手术，也会因为手术面积大而对口腔造成损害，不能恢复正常的功能与形态。因此，早期发现及预防就成为了治疗口腔癌的重要前提。通过大量的研究证明，CYPlAl基因上Ile462Val位点多态性及MspI位点多态性，CYP2D6基因上 C188T位点多态性的3个单核苷酸多态性与口腔癌的发生密切相关。CYPlAl基因编码细胞色素P4501A1。该蛋白是重要的活化多环芳烃类致癌物的主要酶类。被激活的CYPlAl能够将多种环境中的有机物质如多环芳烃转化为细胞毒素或其他致癌物质，从而更加造成癌症发生的危险。分子生物学研究表明，CYPlAl第462号氨基酸由Ile变为Val，以及CYPlAl MSPI位点T — C，会增加CYPlAl酶活性，可产生高诱导活性的CYPlAl酶，使多环芳烃类化合物活化速率加快，导致多种癌症的发生风险增高。国内外研究表明CYPlAl基因多态性与口腔癌发生密切相关，大样本的中国人群的关联分析显示， 该位点的多态现象是中国人群中重要的口腔癌遗传易感因素之一。因此该位点可以作为肺癌易感性的遗传检测因子。CYP2D6酶又称为异喹胍羟化酶，主要是因为异喹胍代谢仅依赖于CYP2D6。CYP2D6 表型和基因型有显著的种族差异，亚洲人常见的单核苷酸多态性之一是CYP2D6第一号外显子C188T突变，造成Pro34Ser氨基酸替代，导致编码的酶活性改变，影响对前致癌物的代谢，与个体的口腔癌易感性有密切关系。综上所述，鉴于CYPlAl基因上Ile462Val位点多态性及MspI位点多态性，CYP2D6 基因上C188T位点多态性在口腔癌变过程中有着不可忽视的作用，可以将上述基因作为遗传易感因素来检测出受检者在口腔癌发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患口腔癌的高危人群，从而有针对性的预防和治疗口腔癌，这对于降低口腔癌的发病率有非常重要的意义。
发明内容
基于CYPlAl基因上Ile462Val位点多态性及MspI位点多态性，CYP2D6基因上 C188T位点多态性的3个单核苷酸多态性位点基因型可作为评估口腔癌发病的危险因子的基础上，本发明提供一种口腔癌易感基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测CYPlAl基因上Ile462Val位点多态性及MspI位点多态性，CYP2D6基因上 C188T位点多态性的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物； PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。测序反应体系25%BigDye mix lul ；3. 2uM DNA 测序引物 lul ;125mMEDTA 溶液 lul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例I.检测试剂盒的使用I、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(I)CYPlAl (Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG 3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA 3'(2)CYP1A1 (MspI)正向引物5' GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3'CYPlAl (MspI)反向引物5' CTTCACTCCCACCGCCTCT3'(3)CYP2D6(C188T)正向引物5' AACACAGCAGGTTCACTCACAG3'CYP2D6(C188T)反向引物5' ATCCATGTTTGCTTCTGGTAGG3'
PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5 μ I 25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、 5U/ul Taq酶O. 125 μ 1、DNA模板 I μ I (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 O. 25 μ I、 ddH20 19. 175μ I ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I 分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(I)CYPlAl (Ile462Val)测序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG 3'(2) CYPlAl (MspI)测序引物5' GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3'(3)CYP2D6(C188T)测序引物5' AACACAGCAGGTTCACTCACAG3 '反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul, 25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA测序引物Iul，去离子水 2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.对人们进行预防口腔癌发病的基因无创检测的服务I.采样及抽提DNA由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。2.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的CYPlAl基因上Ile462Val位点多态性及MspI位点多态性，CYP2D6基因上C188T位点多态性的3个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。3. 口腔癌发病高危人群风险评估通过对受检者SNPs基因型的分析，出具口腔癌易感基因风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者CYPlAl基因上Ile462Val位点多态性及MspI位点多态性，CYP2D6 基因上C188T位点多态性的3个基因上SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读口腔癌易感基因无创检测报告单。
权利要求
1.一种检测口腔癌易感基因无创检测试剂盒，其特征在于检测CYPlAl基因上 Ile462Val位点多态性及MspI位点多态性，CYP2D6基因上C188T位点多态性的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP 酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对CYPlAl 基因上Ile462Val位点多态性及MspI位点多态性，CYP2D6基因上C188T位点多态性的3个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA测序引物是针对CYPlAl基因上Ile462Val位点多态性及MspI位点多态性，CYP2D6基因上C188T位点多态性的3个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求I所示的试剂盒，其特征在于，所含的3对特异性引物序列如下(1)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG 3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA 3'(2)CYPlAl (MspI)正向引物5, GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3'CYPlAl (MspI)反向引物5' CTTCACTCCCACCGCCTCT3'(3)CYP2D6(C188T)正向引物5' AACACAGCAGGTTCACTCACAG3'CYP2D6(C188T)反向引物5' ATCCATGTTTGCTTCTGGTAGG3'。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所含的3条DNA测序引物序列如下(1)CYPlAl(Ile462Val)测序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG 3'(2)CYPlAl (MspI)测序引物5, GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3'(3)CYP2D6(C188T)测序引物5'AACACAGCAGGTTCACTCACAG 3'。
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1) 0 反应体系10父？0 反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶O. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 产物纯化体系川/111SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)测序反应体系25%BigDye mixlul，3.2uM DNA 测序引物 lul，125mMEDTA 溶液 lul，100% 乙醇溶液 15111，70%乙醇溶液30111，！1101 溶液 8ul，ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度在_20°C。
全文摘要
本发明提供了一种检测口腔癌易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测CYP1A1基因上Ile462Val位点多态性及MspI位点多态性，CYP2D6基因上C188T位点多态性的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与口腔癌发生密切相关的3个单核苷酸多态性位点的基因型来评估受检者口腔癌患病的风险级别，并最终根据每一位受检者的基因检测结果从基因层面指导受检者有针对性的预防口腔癌的发生，降低口腔癌的发病几率。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。
文档编号C12Q1/68GK102605081SQ20121008672
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司