专利名称：霍山石斛微卫星dna分子标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子标记技术，具体涉及ー种霍山石斛微卫星分子遗传标记。
背景技术：
微卫星(Microsatellite)又称作短串连重复(ShortTandem Repeats, STRs)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSRs)、简单序列长度多态性(SSLP)。是指ー类遍布于生物基因组中的由几个核苷酸对(称为核心序列，一般为I 6bps)为重复单位组成的简单串联重复。其重复次数在同一物种不同的遗传型间是高度可变的，但这段重复的两端却是相对保守的单拷贝序列，据此设计引物，即可通过PCR技术分析核心序列重复次数的变异，在不同的遗传型间检测到多态。根据重复单元的构成，微卫星DNA序列被分为3种类型单一型(pure),复合型(compound)和间断型(interrupted)。例如
单ー型ATATATATATATATATATATATAT复合型ATATATCACACACACACACAC间断型ATATATCAATATATCA ATATATA作为ー种分子标记，微卫星DNA具有以下特点广泛分布于真核生物的基因组中，据估计每6kb长度中就有I个微卫星位点；核心序列的重复次数在个体间呈高度变异性，多态性信息容量高呈共显性，遵循盂德尔法则遗传；选择中性等等。基于以上特点，微卫星DNA被广泛用于植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定和种质保存、数量性状基因的分析、辅助育种、构建指纹图谱、遗传多祥性及物种进化与亲缘关系等方面的研究。霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense. C. Z. Tang et S. J. Cheng)又名米斛，兰科石斛属植物，原产安徽霍山，是药用石斛中的极品，并被誉为“中华仙草之最”。作为濒危植物，霍山石斛现己被中国列入国家ー级重点保护植物。由于石斛是ー种附生植物，对生态环境要求比较严格，自然繁殖频率极低(< 5%)，加上长期采集，野生植株已濒临灭绝。霍山石斛因其质量上乘而驰名中外，多年来市场上霍山石斛有名无实，有价无市，资源接近枯竭。现在国内外市场上，凡冠以“霍山石斛”、“霍斗”或“野生金霍斛”等名称的ー些枫斗产品，均非用真正的霍山石斛加工而成，多数是铜皮石斛、铁皮石斛、扁黄草石斛和钩状石斛的仿冒品。
发明内容
本发明解决的技术问题分离克隆霍山石斛的微卫星DNA分子标记，建立霍山石斛微卫星DNA技术体系并用这些分子标记进行霍山石斛遗传多祥性，石斛属植物遗传关系的研究，以及进行霍山石斛种质鉴定。本发明解决技术问题的技术方案霍山石斛微卫星DNA分子标记,包括霍山石斛微卫星(CT)n富集文库的构建，微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，得到51个含有微卫星重复序列的克隆。得到11个多态性高的微卫星分子标记Hs39、Hs40、Hs41、Hs42、Hs44、Hs47、Hs48、Hs50、Hs54、Hs56、Hs57 ；Hs39 为 600 个核苷酸，Hs40 为 694 个核苷酸，Hs41 为503个核苷酸，Hs42为638个核苷酸，Hs44为437个核苷酸，Hs47为704个核苷酸，Hs48为558个核苷酸，Hs50为540个核苷酸，Hs54为458个核苷酸，Hs56为509个核苷酸，Hs57为541个核苷酸。
图I :Hs39位点的特异性引物扩增24个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。图2 Hs40位点的特异性引物扩增20个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。图3 Hs41位点的特异性引物扩增25个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。图4 Hs42位点的特异性引物扩增28个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。图5 Hs44位点的特异性引物扩增24个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。图6 Hs47位点的特异性引物扩增24个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。图7 Hs48位点的特异性引物扩增24个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。图8 Hs50位点的特异性引物扩增31个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。图9 Hs54位点的特异性引物扩增29个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。图10 Hs56位点的特异性引物扩增24个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。图11 Hs57位点的特异性引物扩增30个霍山石斛的DNA的银染PAGE图。图12 Hs42位点的特异性引物扩增I个霍山石斛(第I泳道，片段长度在331bp左右)、2个河南石斛(2-3泳道，片段长度在331bp左右)、7个铁皮石斛(4_10泳道，片段长度230-275bp)、7个铜皮石斛(11-17泳道，没有产物条带)、4个扁黄草石斛(18-21泳道，没有产物条带)和3个钩状石斛(22-24泳道，没有产物条带)的DNA的银染PAGE图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作详细的说明。实施例I :霍山石斛微卫星DNA富集文库的构建I)基因组的提取与酶切 用Doyle J 介绍的 CTAB 法(Doyle J. DNA protocols for plants-CTAB totalDNA isolation [A]. In Hewitt GM, Johnston A (eds.), Molecular Techniques inTaxonomy [M]· Berlin Springer, 1991, 283-293)提取基因组。用限制性内切酶 Sau 3AI(购于TaKaRa公司)酶切基因组。2%的琼脂糖凝胶电泳后，在紫外光下切下400_900bp的DNA片段。用胶回收试剂盒(购于Axygen公司)回收。2)加接头将胶回收纯化后的产物加入接头oligo A(5-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3)oligo B(5-P04-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3)，在T4 DNA Ligase (购于Fermentas公司)作用下于16°C水浴连接过夜。3) PCR检测接头连接以oligo A为引物，以连接产物为模板进行PCR扩增，(50 μ I反应体系如下25μ IGoTaq 丨 Green Master Mix (购于 Promega 公司)，5 μ I 引物 oligoA, 5 μ I 连接产物，加水补
至50 μ I。PCR反应程序94°C预变性5分钟，94°C变性50秒，56°C退火一分钟，72°C延伸2分钟，变性、退火、延伸三个步骤循环25次，最后72°C充分延伸10分钟。在2%的琼脂糖凝胶电泳检测后，PCR产物用纯化试剂盒(购于Axygen公司)进行纯化。4)磁珠富集用亲合素包被的磁珠Streptavidin MagneSphere ParamagneticParticles(PMPs)(购于Promega公司)结合微卫星探针上的生物素，由于亲和素和生物素的结合是ー个牢固的，不可逆的过程，因此在二者结合的同时，磁珠也吸附了“微卫星探针及包含微卫星的基因组DNA单链”，在此同时通过多次洗脱去除不含微卫星的基因组片断，最后通过高温变性打开微卫星探针与DNA链的结合，从而达到富集含微卫星片断的目的。将杂交液加入已处理好的磁珠，室温静置30分钟。将离心管放在磁力架上，吸去上清，依次用O. 5 X SSC，6 X SSC在室温下洗三次，再用6\55(，2父55(，1\55(在60で下洗两次，最后 用O. I X SSC室温下洗一次。加入TE缓冲液，在PCR仪上95°C变性10分钟，收集上清。重复两次。5) PCR 富集以磁珠富集产物为模板，oligo A为引物进行PCR扩增，25 μ I反应体系如下，
12.5 μ I GoTaq Green Master Mix (购于 Promega 公司)，I. 5 μ I 引物 oligo A, 2. 5 μ I 富集后的DNA，加水补至25 μ I。PCR反应程序如下94°C预变性3分钟，94°C变性35秒，60°C退火性35秒，72°C延伸I分钟，变性、退火、延伸三个步骤循环25次，最后72°C充分延伸12分钟。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶电泳检测后，用纯化试剂盒(购于Axygen公司)进行纯化。6)感受态细胞的制备挑取平板上E. coli DH-5单菌落，接种于5ml的不含Amp的LB培养基中，37°C振荡培养过夜。取Iml培养液于50ml的LB液体培养基中，37°C振荡培养，2 4h至对数期。测OD (O. 2 O. 6)。将培养液分装至EP管中(每管I. 5ml菌液)，水浴10 15min。在4°C离心，4000rpm，10min (先降温后再离心)弃上清。弃上清后三管并一管，冰浴30min (第一管加入O. lmol/L, Iml事先冰中预冷的CaC12，混匀，吸出至第二管，如此将三管并一管)。取出后梯度离心，4°C，4000rpm，5 8min。弃上清。加入200 μ I预冷甘油(15% )/CaC12(0. 1M)混匀，_80°C保存。7)连接转化取PCR富集后的纯化产物连接入TA克隆载体(pMD19-T Simple Vector)(购于TaKaRa公司)，16 °C水浴连接2_3小吋。取出冻存管，冰上复苏IOmin ；^10μ I的连接产物加入200 μ I感受态细胞中，混匀，冰浴30min ;42°C水浴热休克90s ;冰浴2min，加入600 μ ILB培养基，37°C振荡培养I. 5h ;取70μ I培养液，滴入LB/Amp/X-gal/IPTG平板上并涂布均匀(X-Gal需避光);将平板37°C正向放置培养O. 5h，然后于37°C烘箱中倒置培养过夜。经过12h的培养，待平板上的菌落大小适中，取出平板于4°C放置使蓝斑充分显现。用灭过菌的牙签挑取平板上白色单克隆菌落，置于96深孔板中(深孔板事先加入了 400μ I的含Amp抗性的LB/Amp培养基)。当白色单菌落挑取结束后，用不干胶将孔板盖好后于37°C，225rpm振荡培养4h。
8)含微卫星序列的阳性克隆的筛选以连接转化所得的菌液为模板，利用引物oligo A和引物(CT) 12进行PCR扩增。15 μ I PCR 反应体系包括rTaq 酶 O. 375U (购自 TaKaRa 公司)，10 X Buffer I. 5 μ I，dNTPO. 2yM,MgC12 1.5yMj_0.4yM(oligo A，(CT) 12)，水，模板。反应程序94 °C 预变性 3分钟，94°C变性50秒，56°C退火35秒，72°C延伸I分钟，变性、退火、延伸三个步骤循环30次。最后72°C充分延伸12分钟。I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。对于PCR产物检测中有2条或3条带的克隆，则这些克隆内可能含有微卫星的插入片段。9)阳性克隆测序及引物设计选取扩增片断长度在300_900bp的可能含有微卫星插入片段的阳性克隆菌液，送生エ生物(上海)有限公司测序，共得到51条含有微卫星DNA的序列。利用软件PrimerPremier 5. O根据微卫星DNA两端的序列来设计引物。10)筛选有多态性的引物 用上述的CTAB法提取霍山石斛的基因组。用设计好的引物(表I)扩增基因组。反应程序94V预变性4分钟，94V变性45秒，相应的退火温度30秒，72°C延伸35秒，变性、退火、延伸三个步骤循环35次。最后72°C充分延伸8分钟。I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物用PAGE电泳进行检测。共得到11个有多态性的微卫星标记。Hs39为600个核苷酸，Hs40为694个核苷酸，Hs41为503个核苷酸，Hs42为638个核苷酸，Hs44为437个核苷酸，Hs47为704个核苷酸，Hs48为558个核苷酸，Hs50为540个核苷酸，Hs54为458个核苷酸，Hs56为509个核苷酸，Hs57为541个核苷酸。11)结果分析 使用Cervus3. O软件计算期望杂合度和观察杂合度。使用Genepop3. 4软件计算哈代-温伯格以及连锁不平衡的值，以此来描述11个霍山石斛微卫星DNA多态位点的特征。由附图1-11可看出，本发明的11个微卫星序列的长度在供试的20-31个霍山石斛中都出现了多祥性，条带都在210-400个核苷酸范围内。由此可见，本发明的这11个微卫星标记能用于研究霍山石斛的遗传多样性，石斛属植物种间和居群间的变异和进化关系，具有很高的重复性，是ー种可靠有效的分子标记。12)霍山石斛微卫星分子标记在石斛属其它几种中的应用通过PCR方法用霍山石斛的这11对微卫星引物扩增石斛属其它4种石斛基因组DNA、电泳分离和银染检测等步骤，结果发现其中HS-42引物在铜皮石斛和铁皮石斛，扁黄草石斛及钩状石斛等个体中在此范围内均未扩增出条带。见附图12.表I引物特性表
权利要求
1.霍山石斛微卫星DNA分子标记，其特征在干所述微卫星标记的标号分别为Hs39、Hs40、Hs41、Hs42、Hs44、Hs47、Hs48、Hs50、Hs54、Hs56、Hs57 ； 其核苷酸序列分别为 Hs39 gatcagactt ccttccaact gccaaccacc gcctgacttt cacctgacca ccactcgata60gtcaattgtc gttagatcac cgcttgtcca tcaaacttct gcccttaagc tatcggactt120ccgcctgact gctgccagat ttctactcaa ctctccaaac tattataatt ccacaaccta180taagttaaag gacgggtcaa cctttgtaat taactcacat ttagtgaaat cttttcatct240aggagaggcc tcatggtttt tcccactatg ggttttccac ataaaaaaat ctgttgtttt300acttctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctcaaatt360acatgtttgt atgttggata tccgtgtatt gctaagatga aaaatttaca cgctcaacca420ttgcgaatat tctaacttgc aacaatgaca aaagtcaaac aaagtcaaac ataaaatgtg480cctttcccta atagtaatca tataacaaca atgactcata atctttttac tattatggct540ccaagaatat tgttctaaaa tattttcata atcaactaca tgcaagctgc acctcaccat600Hs40 gatcagagtt caacgccagat tagaaaagtc cttgtagagg ccatcacccc ggcggagggc60gcggcatccc cacaggagaa ggtcaggttt gacaagtaat gtcaaaagat gatgaaatta120ttacgtgcaa gcacaggacg tcgtccagag gcgaattaga acgcgccacg 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2.根据权利要求I所述的ー种霍山石斛微卫星DNA分子标记，其特征在于 所述的 Hs39、Hs40、Hs41、Hs42、Hs44、Hs47、Hs48、Hs50、Hs54、Hs56、Hs57 -j^一个位点的引物序列为 Hs39-F CAC CGC TTG TCC ATC AAA CTT C Hs39-R CGC AAT GGT TGA GCG TGT AAA T Hs40-F AAG ATT GAG GCG ATG TTG T Hs40-R ACT TGC TGG AAT TTG TGG T Hs41-F CAG GCG GCA GAG TTA CAG Hs41-R GCC AAA GCA AAA CAA AGT AGA G Hs42-F TCC ATC TAT CCA TCA ACT AAG C Hs42-R GAC GAG TAT GTT CAG CAG ATT G Hs44-F ATG GCA TAA AAC CTC CCC G Hs44-R GAG CGG ACA ATC GCA TCT AAG T Hs47-F TGA AAT AGC CAT CCT GAA GAG Hs47-R GGA GAA GAT TAT TGG GTT TGA GT Hs48-F AGG GAA AGG CCG TAA TGA TGA T Hs48-R AGA GTT GTA ATG TTG GCT CCG CTA Hs50-F CCA AGC AAA CCT CAA GAA CTC Hs50-R CGA AAG GAC CGA CCT AAT ACTHs54-F CAG CCA ACA GCC ACT CTT CTT C Hs54-R CGC CGT CAA ATA GTT TAT CGT AG Hs56-F GCA GAA GCA AGA ATA AAA GTC G Hs56-R ATA AGA TTA GAT GAG CCC CAG A Hs57-F CCT TGA ATT TGC ATG GAG TT Hs57-R TTT TGG GGC ATT TTG CTG TT。
全文摘要
本发明公开了一种霍山石斛微卫星DNA分子标记，包括霍山石斛微卫星(CT)n富集文库的构建，微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，得到51个含有微卫星重复序列的克隆，筛选得到了11个高多态性的微卫星分子标记Hs39、Hs40、Hs41、Hs42、Hs44、Hs47、Hs48、Hs50、Hs54、Hs56、Hs57，其中Hs42可较好地区分霍山石斛与铁皮石斛、铜皮石斛、扁黄草石斛和钩状石斛。采用本方法开发的微卫星分子标记可用于研究霍山石斛的遗传多样性，鉴别霍山石斛几种伪品，具有准确、快速、重复性好的优点，为霍山石斛的去伪存真提供了新的工具。
文档编号C12Q1/68GK102649955SQ20121009791
公开日2012年8月29日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者何祥林, 宋平, 曹正宇, 朱国萍, 王晖, 王鹏, 郑基阳, 陈乃富, 高鹏 申请人:安徽师范大学