专利名称：一种用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及发光细菌检测技术领域，特别涉及一种用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法。
背景技术：
发光细菌是一种广泛存在的能发出蓝绿色可见光的细菌，其主要分布在海洋中，或者自由生活，或者寄生于海洋或陆生动物体。
发光细菌的发光过程是一种光呼吸过程，是电子传递链上的一个侧支，还原型的黄素单核苷酸(FMNH2)充当反应的底物，萤光酶起催化作用，长链脂肪醛起作改变萤光酶构造的“修饰”作用。萤光酶通过分子氧催化(FMNH2)和脂肪醛(RCHO)的氧化，这种氧化还原反应结果便产生磷光，波长465 490nm之间较多。外界环境条件如pH、温度、氧浓度的变化都会影响发光细菌的发光强度；而有毒的化学物质，如重金属离子、抗生素、化学治疗剂、农药等同样会影响发光细菌的发光状况，因此，采用发光细菌作为敏感指标物测定抗生素类污染物的生物毒性在科研实践中是可能的。经过几代科学家的努力，已成功提取和培养出发光细菌制剂并研制出与之配套的现代光电检测设备，从而形成了成熟的发光细菌毒性检测体系和方法。与传统的生物毒性实验相比，发光细菌毒性实验反应时间短、灵敏度高，并且由于是用发光量定量表征污染环境的生物监测方法，因而能够对环境的变化做出快速反应，有助于对环境质量进行综合评价。标准的发光细菌急性毒性实验因其作用时间短，仅仅适用于那些快速表现出毒性的化合物的测定，对于测定那些影响生物生长繁殖过程的化合物的毒性，实验历经时间必须超过细菌的世代时间。抗生素类物质因其特殊的作用机制(主要是干扰转录、蛋白质的合成以及繁殖过程)，单纯依据标准发光细菌急性毒性实验方法获得的结果可能会严重低估抗生素类污染物的生物毒性。标准毒性实验结果主要反映细胞内部能量状态的变化，影响细胞物质合成的化合物的毒性在这么短的时间里变化很小，因此检测结果并未反应真实的状况。此外，标准的发光细菌急性毒性实验仅适用于可溶性的有毒有害物质的检测，对不溶或微溶化学物质的检测未作详细的规范指导，使得其应用范围受限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种应用更加广泛和准确的发光细菌检测抗生素类毒性的改进方法，解决了现有技术中无法检测抗生素类污染物的延迟毒性、对不溶或微溶化学物质检测不精确等问题。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法，包括如下步骤；
I)配制抗生素母液并将母液稀释至实验所需浓度；2)制备发光细菌冻干粉复苏液3)空白对照制备对于溶解性的抗生素，将发光细菌复苏液作为空白对照；对于不溶或微溶性的抗生素，将含有与对应待测样品具有相同含量ニ甲基亚砜的复苏液作为空白对照；4)待测样品溶液制备取不同浓度的待测样品加入到干净的测试管中，摇匀；5)将空白对照和待测样品相间放置于测试架上；6)按顺序向各个测试管中加入复苏的发光细菌冻干粉(根据发光量和仪器要求调节加入量)，两管加入时间相隔15-30S，轻轻振荡，使之均匀，7)EC50值的计算以待测样品浓度的对数为横坐标，对应的相对发光率为纵坐标作图，求得其EC50值，即相对发光率在50%的样品的浓度；其特征在于，所述步骤6)的放置后，向各个管中按比例依次加入发光细菌的完全培养基，使抗生素类物质与发光细菌作用时间延长至12-36h后在水质毒性检测仪测定发光量。优选地，所述抗生素类物质与发光细菌作用时间延长至24个小吋。优选地，抗生素类物质与发光细菌在20_25°C条件下培养。优选地，所述抗生素类物质，包括青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类、林可酰胺类。优选地，所述抗生素类物质，包括四环素类和磺胺类抗生素。优选地，所述四环素类抗生素，具体包括四环素(CTC)、土霉素(OTC)或金霉素(TC)、强カ霉素。优选地，所述的抗生素类物质为不溶或微溶物质时，在配置的抗生素类母液中加入ニ甲基亚砜，加入量不超过总体积的千分之一。实验证明少量的ニ甲基亚砜对发光细菌的发光量不产生影响，而且采用ニ甲基亚砜溶解不溶或微溶抗生素类物质后，再将不溶或微溶抗生素毒性物质制成溶液后进行实验，扩大了发光细菌的应用范围。优选地，所述的不溶或微溶抗生素类物质是磺胺类抗生素。优选地，所述的磺胺类抗生素包括磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲基嘧啶(SM)、磺胺甲恶唑(SMZ)。在本文中，术语“发光细菌”具有本领域技术人员所熟知的含义，发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490nm之间，在黑暗处肉眼可见。目前，全世界已命名的发光细菌有以下几种①属于异短杆菌属(Xenorhabdus)的有发光异短杆菌(Xenorhabdus Iuminescens) 属于发光杆菌属(Photobacterium)的有明亮发光杆菌(Photosbacterium phosphoreum)和缠发光杆菌(P. Ieiognathi);③属于希瓦氏菌属(Shewanella)的有羽田希瓦氏菌(Shezoanellahanedai),以前也曾经把它归类为交替单胞菌属(Alteromonas)的海氏交替单胞菌(Alteromonas hanedia);④属于弧菌属(Vibrio)的有哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、美丽弧菌生物型 I (V. splendidus biotype I)、费氏弧菌(V. f ischeri)、火神弧菌(V. Iogei)和东方弧菌(V. orientalis)。霍乱弧菌(V. cholerae)和地中海弧菌(V. mediterranei)中的某些菌株有发光现象。在本文中，术语“抗生素”指的对某些其他病原微生物具有抑制或杀灭作用的一类化学物质称为抗生素，具体种类包括常见的内酰胺类中的青霉素类抗生素、大环内酯的红霉素等类抗生素、放线菌产生的四环素类广谱抗生素、链霉菌提取出来的链霉素抗生素、氯霉素的广谱抗生素，当然还包括其他种类的例如磺胺类、喹诺酮类、呋喃类、硝咪唑类等本领域技术人员公知的技术，在此就不再赘述。相比于现有技术中的解决方案，本发明优点是I.本发明技术方案中增加抗生素类物质与发光细菌的作用时间，保证发光细菌在 此期间发生增殖，该方法可以实现对抗生素生物毒性的准确表征具有较好的时效性，在保证时效性的基础上使检测结果更加准确，实现了抗生素类污染物延迟毒性的检测。2.本发明技术方案中先用少量二甲基亚砜溶解不溶或微溶抗生素类物质，改进了对不溶或微溶抗生素类物质的测定方法，从而提供了一种应用更加广泛和准确的发光细菌生物毒性检测方法。
图I为不同抗生素类污染物作用不同时间对发光细菌发光量的影响。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。以下将以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册，以及所用试剂和仪器的厂商说明书。其中，所有化学试剂均采用分析级，实验用水经Milli-XQ过滤，各试剂均和材料可以商用渠道获得，具体而言实验中所用到的抗生素包括磺胺甲基嘧啶(SM)，磺胺甲噁唑(SMZ)，磺胺嘧啶(SD)，盐酸土霉素(OTC)，盐酸四环素(TC)，盐酸金霉素(CTC)，均为色谱纯，购自sigma公司。3，5-二氯苯酚(3，5-DCP)，HgC12，分析纯，购自阿拉丁试剂公司。明亮发光杆菌冻干粉(简称502冻干粉)，复苏稀释液，渗透压调节液，水质毒性快速检测仪(BHP9511)均购自北京滨松光子技术股份有限公司。实施例I. I相关药品的配制I. I. I检测物质抗生素类母液的配置四环素类以蒸馏水溶解定溶，磺胺类加入二甲基亚砜(不超过总体积的千分之一)溶解后加水定溶。I. I. 2毒性实验相关浓度的配制用蒸馏水将母液稀释至所需浓度。I. I. 3发光细菌完全培养基酵母膏5g/L，胰蛋白胨5g/L，甘油3ml/L，氯化钠30g/L,磷酸氢二钠5g/L,磷酸氢二钾lg/L, pH为6. 5。I. 2毒性测定实验步骤I)开机预热毒性检测仪30min，备用；2)配制抗生素母液并将母液稀释至实验所需浓度；3)发光细菌冻干粉的复苏及复苏液的制备参照相应的产品规定；
4)毒性检测仪的操作过程按照相应型号仪器的操作手册进行；5)空白对照制备对于溶解性的抗生素，将发光细菌复苏液作为空白对照；对于不溶或微溶性的抗生素，将含有与对应待测样品具有相同含量ニ甲基亚砜的复苏液作为空白对照。6)待测样品溶液制备取不同浓度的待测样品2ml (包含O. 3ml滲透压调节液)加入到干净的测试管中，摇匀后备用。7)将空白对照和待测样品相间放置于测试架上。8)按顺序向各个测试管中加入10 μ L复苏的发光细菌冻干粉(根据发光量和仪器要求调节加入量)，两管加入时间相隔15-30S，轻轻振荡，使之均匀，放置30min后在水质毒性检测仪(BHP9511，北京滨松光子技术股份有限公司)上测定发光量。这里的30min就是标准毒性试验的作用时间即为改进前的作用时间。9)然后向各个管中按比例(培养基/测试液=I 4)依次加入完全培养基，置于20°C的恒温培养箱中培养24h后在水质毒性检测仪(BHP9511，北京滨松光子技术股份有限公司)测定发光量。I. 3结果的处理I. 3. I相对发光率的计算公式相对发光率=待测样品发光量/空白对照发光量X 100%I. 3. 2EC50 值的计算以待测样品浓度的对数为横坐标，对应的相对发光率为纵坐标作图，求得其EC50值(相对发光率在50%的样品的浓度)。发光细菌急性毒性实验用于监测废水和化合物的生物毒性已经得到了非常广泛的应用。用发光细菌作为受试对象的急性毒性和延迟毒性的测定结果如图I和表I所示。图1(a)和(b)分别反映了磺胺类和四环素类抗生素对发光细菌的抑制影响。由图可知，无论是磺胺类还是四环素类，24h的延迟毒性结果与O. 5h的标准急性毒性结果相比，模拟曲线都向左移动，即EC50值减小；且每种抗生素向左移动的程度不同，即毒性増加的程度不同。由图1(a)和表I可知，标准发光细菌毒性实验结果中(O. 5h)，三种磺胺类抗生素的EC50，0. 5h值由小到大的顺序是SD < SMZ < SM，相应的数值分别为62，73和104mg/L ;但是延迟毒性结果中EC50，24h值由小到大的顺序是SMZ < SD < SM，相应的数值分别为O. 0023，
I.57和5. 69mg/L，三种磺胺类抗生素的急慢性EC50比值分别为32119，40和19。由此可知,延长生物毒性测试时间不仅导致受试化合物的EC50值发生了重大改变，同时对抗生素的生物毒性顺序也产生了明显影响，其中SMZ的毒性增加的最大，说明SMZ对发光细菌的生物毒性的延迟现象最为明显。
同样，由图1(b)和表I可知，标准发光细菌毒性实验结果中(O. 5h)，三种四环素类抗生素的EC50，0. 5h值由小到大的顺序是CTC < OTC < TC，相应的数值分别为O. 034，
O.068和37mg/L ;但是延迟毒性结果中EC50，24h值由小到大的顺序是CTC < TC < 0TC，三种四环素类抗生素的急慢性EC50比值分别为31，18586和18。其中TC毒性增加的程度最大，毒性延迟效应最为明显。表I抗生素类污染物对发光细菌抑制的EC5tl值Tab. I EC^0 value of the bioiuminescence innibition assay
米么工旦0 I °2 EC5gO md/U EC50(mg/L) 毒性增
抗生素种类分子里+/立撕
0.5h24h 0.5h 24h 0.5h 24h 0.5h 24h 大倍敫
SMZ 253.2 -11.90 2.19 4.73 1.25 287 0.0090 73 0.0023 32119
咖.,I SD250.3-3.39-1.481.301.392516.29621.5740磺目女类
SM264.3-14.92-2.295.601.4441321.541045.6919
CTC515.349.466.105.291.940.0140.00046 0.0340.001131
TC480.9-6.252.573.061.27900.0048370.002218586
四环素类
OTC496.894.367.145.493.560.140.00780.0680.003918
参照物 3,5-DCP163-2.14-1.851.461.3116.3013.482.662.201.2另外，由表I结果可知，发光细菌对毒性参照物质的3，5-DCP的EC50值随时间的变化不明显，EC50，0. 5h和EC50，24h分别为2. 66和2. 20mg/L。出现这种差异的原因可能与受试化学物质毒性作用机制及毒性作用时间有关。标准急性发光细菌实验仅仅适用于那些很快表现出毒性的化合物的测定，对于测定那些影响生物生长繁殖过程的化合物的毒性，必须增加的前提是实验历时需超过细菌的世代时间。因此根据急性毒性数据外推慢性毒性可能会严重低估抗生素类污染物的生物毒性，出现急慢性EC50比值异常大的原因可能与抗生素类物质特殊的作用机制有关，他们主要是干扰转录、蛋白质的合成以及繁殖过程。0. 5h毒性实验结果主要反映细胞内部能量状态的变化，影响细胞物质合成的化合物的毒性在这么短的时间里变化很小，因此延长实验时间保证细菌发生增殖是该方法需要改进的重要内容。由此可见，发光细菌标准急性毒性方法可能导致抗生素类污染物的毒性被严重低估。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法，包括如下步骤； 1)配制抗生素母液并将母液稀释至实验所需浓度； 2)制备发光细菌冻干粉复苏液； 3)空白对照制备对于溶解性的抗生素，将发光细菌复苏液作为空白对照；对于不溶或微溶性的抗生素，将含有与对应待测样品具有相同含量ニ甲基亚砜的复苏液作为空白对昭. 4)待测样品溶液制备取不同浓度的待测样品加入到干净的测试管中，摇匀； 5)将空白对照和待测样品相间放置于测试架上； 6)按顺序向各个测试管中加入复苏的发光细菌冻干粉(根据发光量和仪器要求调节加入量)，两管加入时间相隔15-30S，轻轻振荡，使之均匀， 7)EC50值的计算以待测样品浓度的对数为横坐标，对应的相对发光率为纵坐标作图，求得其EC50值，即相对发光率在50%的样品的浓度； 其特征在于，所述步骤6)的放置后，向各个管中按比例依次加入发光细菌的完全培养基，使抗生素类物质与发光细菌作用时间延长至12_36h后在水质毒性检测仪测定发光量。
2.根据权利要求I所述的ー种用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法，其特征在于，所述抗生素类物质与发光细菌作用时间延长至24个小吋。
3.根据权利要求I所述的发光细菌检测抗生素类物质毒性的改进方法，其特征在干，抗生素类物质与发光细菌在20-25°C条件下培养。
4.根据权利要求I所述的用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法，其特征在于，所述抗生素类物质包括青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类、林可酰胺类。
5.根据权利要求I所述的用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法，其特征在于，所述抗生素类物质为四环素类和磺胺类抗生素。
6.根据权利要求5所述的用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法，其特征在于，所述四环素类抗生素，具体包括四环素CTC、土霉素OTC、金霉素TC、强カ霉素。
7.根据权利要求I所述的用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法，其特征在于，所述的抗生素类物质为不溶或微溶物质时，在配置的抗生素类母液中加入ニ甲基亚砜，加入量不超过总体积的千分之一。
8.根据权利要求7所述的用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法，其特征在于，所述的不溶或微溶抗生素类物质是磺胺类抗生素。
9.根据权利要求5或8所述的用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法，其特征在于，所述的磺胺类抗生素为磺胺嘧啶SD、磺胺甲基嘧啶SM、磺胺甲恶唑SMZ。
全文摘要
本发明提供一种用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法抗生素类物质与发光细菌作用时间延长至12-36个小时，优选延长至24个小时。本发明技术方案中增加抗生素类物质与发光细菌的作用时间，保证发光细菌在此期间发生增殖，该方法可以实现对抗生素生物毒性的准确表征具有较好的时效性，在保证时效性的基础上使检测结果更加准确，实现了抗生素类污染物延迟毒性的检测。
文档编号C12Q1/18GK102634564SQ20121011370
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者彭自然, 李娟英, 王静 申请人:上海海洋大学