专利名称：细胞培养基及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及毛囊干细胞与毛发再生研究領域。具体地，本发明涉及细胞培养基及其用途。更具体地，本发明涉及细胞培养基及其在体外培养毛乳头细胞中的用途、用于体外培养毛乳头细胞的试剂盒及其用途、体外培养毛乳头细胞的方法、毛乳头细胞或其衍生物、体外培养毛乳头细胞的系统以及鉴定制剂对毛囊组织是否具有影响的方法。
背景技术：
近年来随着生活节奏的加快，受到外界压力、环境等多种因素的影响，脱发人群有明显增长的趋势。自体毛囊移植是目前治疗脱发的唯一有效措施，但手术复杂，且对大面积脱发患者而言，供区毛囊有限，无法满足治疗需求。因此，现阶段主要将分离的毛囊干细 胞进行扩增后移植于毛发缺失部位，诱导形成新的毛囊，以便实现毛发的再生。而毛乳头细胞能够诱导毛囊再生，即使体外培养的毛乳头细胞仍具有这种特性。因此，毛乳头细胞的分离、富集及体外扩增对毛发再生的应用至关重要。然而，目前的体外培养毛乳头细胞的方法仍有待改进。
发明内容
本发明g在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的ー个目的在于提出ー种体外培养毛乳头细胞的手段。根据本发明的ー个方面，本发明提供了ー种细胞培养基。根据本发明的实施例，该培养基包含基础培养基,该基础培养基为AminomaxC-IOO培养基(GIBCO，Cat 17001)；AminomaxC-100 supplement (GIBCO,Catl2556) ;bFGF ;以及 DM0G。发明人发现，利用本发明的细胞培养基对分离的毛乳头细胞进行体外培养，能够有效地使得毛乳头细胞扩增，从而能够有效地获得具有干细胞特性和毛囊诱导能力的毛乳头细胞或其衍生物。根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于体外培养毛乳头细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒中含有bFGF和DM0G。发明人发现，利用本发明的用于体外培养毛乳头细胞的试剂盒对毛乳头细胞进行体外培养，能够有效地使得毛乳头细胞扩增，并且获得的毛乳头细胞的毛囊再生能力好。根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于体外培养毛乳头细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含前面所述的本发明的培养基。根据本发明的实施例，利用本发明的用于体外培养毛乳头细胞的试剂盒对毛乳头细胞进行体外培养，能够有效地使得毛乳头细胞扩增，从而能够有效地获得具有毛囊再生能力的毛乳头细胞或其衍生物。 根据本发明的另一方面，本发明提供了前面所述的根据本发明实施例的细胞培养基在体外培养毛乳头细胞中的用途。由此，能够利用本发明的细胞培养对毛乳头细胞进行体外培养，并且获得的毛乳头细胞的毛囊再生能力好。根据本发明的另一方面，本发明提供了前面所述的根据本发明实施例的两种试剂盒在体外培养毛乳头细胞中的用途。由此，能够利用本发明的试剂盒对毛乳头细胞进行体外培养，从而能够有效地获得具有毛囊再生能力的毛乳头细胞或其衍生物。根据本发明的又一方面，本发明提供了ー种体外培养毛乳头细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤利用根据本发明实施例的培养基，培养CD133阳性毛乳头细胞。发明人发现，利用本发明的体外培养毛乳头细胞的方法，能够有效地对毛乳头细胞进行体外培养，使得毛乳头细胞扩增，从而能够获得具有干细胞特性和毛囊诱导能力的毛乳头细胞或其衍生物。根据本发明的再一方面，本发明提供了一种毛乳头细胞或其衍生物。根据本发明的实施例，该毛乳头细胞或其衍生物是通过根据本发明实施例的体外培养毛乳头细胞的方法获得的。发明人发现，根据本发明实施例的毛乳头细胞或其衍生物能够在适当的条件下分化成毛囊细胞。根据本发明的另一方面，本发明提供了ー种体外培养毛乳头细胞的系统。根据本发明的实施例，该系统包括分离装置，该分离装置用于从人头皮或小鼠背部皮肤组织分离真皮细胞；分选装置，该分选装置与分离装置相连，并且适于利用CD133抗体从所分离的真 皮细胞中分选CD133阳性毛乳头细胞；以及培养装置，该培养装置与分选装置相连，并且设置有根据本发明实施例的培养基，用于对CD133阳性毛乳头细胞进行培养。发明人发现，利用本发明的体外培养毛乳头细胞的系统，能够方便有效地对毛乳头细胞进行体外培养，并且获得的毛乳头细胞或其衍生物能够在适当的条件下分化成毛囊细胞。根据本发明的又一方面，本发明提供了一种鉴定制剂对毛囊组织是否具有影响的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤将根据本发明实施例的毛乳头细胞或其衍生物与制剂接触；以及对接触前后的毛乳头细胞或其衍生物进行检测，其中，基于毛乳头细胞或其衍生物的形态变化，以及其干细胞特性和毛囊诱导能力标志物的表达变化，判断制剂对毛囊组织是否具有影响。利用该方法能够有效地鉴定制剂对毛囊组织是否具有影响。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中
图I显示了根据本发明一个实施例的利用流式细胞仪分选CD133阳性毛乳头细胞的结果；图2显示了根据本发明一个实施例的体外培养传代的第I代毛乳头细胞体外培养5天时倒置显微镜下的形态(X40)；图3显示了根据本发明一个实施例，利用细胞免疫化学染色检测体外培养的毛乳头细胞中表皮干细胞标志物CK19，非真皮成纤维细胞标志物α -SM,间充质来源标志物Vimentin以及毛乳头细胞标志物Versican、⑶133的表达的结果；图4显示了根据本发明一个实施例，利用流式细胞仪检测体外培养的毛乳头细胞中⑶200表达的结果；图5显示了根据本发明一个实施例的第3代毛乳头细胞的AB-PAS组织化学染色结果;图6显示了根据本发明一个实施例的第3代毛乳头细胞的甲苯胺蓝组织化学染色
结果;图7显示了根据本发明一个实施例，利用CCK-8检测体外培养的毛乳头细胞的生长曲线；以及图8显示了根据本发明一个实施例，接种毛乳头细胞的裸鼠皮肤组织及阴性对照的石蜡切片HE染色結果。
具体实施例方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过參考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。根据本发明的ー个方面，本发明提供了ー种细胞培养基。根据本发明的实施例，该培养基包含基础培养基，所述基础培养基为AminomaxC-100培养基(GIBCO，Cat 17001)；AminomaxC-100 supplement (GIBCO,Catl2556) ;bFGF ;以及DMOG。发明人发现，利用本发明的细胞培养基对分离的毛乳头细胞进行体外培养，能够有效地使得毛乳头细胞扩增，从而能够有效地获得具有干细胞特性和毛囊诱导能力的毛乳头细胞或其衍生物。根据本发明的实施例，在本发明的细胞培养基中，AmnioMaxC-100supp I ement (GIBCO, 12556)与 AmnioMaxC-IOO 基础培养基的体积比为I 6。由此，能够提供细胞培养所需要的各种细胞因子以及谷氨酰胺。根据本发明的实施例，bFGF的浓度有一定的范围，本领域技术人员可以根据实际实验情况选择相应的浓度。根据本发明的ー些具体示例，bFGF的浓度可以为4-10ng/ml，优选5ng/ml。根据本发明的实施例，DMOG的浓度并不受特别限制。根据本发明的ー些具体示例，DMOG的浓度为200-500 μ Μ，优选30 μ Μ。由此，本发明的细胞培养基能够使得毛乳头细胞快速有效地进行体外扩增，从而能够获得具有毛囊再生能力的毛乳头细胞。根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于体外培养毛乳头细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒中含有bFGF和DM0G。发明人发现，利用本发明的用于体外培养毛乳头细胞的试剂盒对毛乳头细胞进行体外培养，能够有效地使得毛乳头细胞扩增，并且获得的毛乳头细胞的毛囊再生能力好。
根据本发明的实施例，在本发明的试剂盒中，可以进一歩包含AmnioMaxC-lOOsupplement (GIBCO, Catl2556)，由此，能够提供细胞培养所需要的各种细胞因子以及谷氨酰胺。根据本发明的实施例，bFGF、DMOG和AmnioMaxC-lOOsupplement分别设置在不同的容器中。根据本发明的实施例，bFGF的浓度并不受特别限制。根据本发明的ー些具体示例，bFGF的浓度可以为4-10ng/ml，优选5ng/ml。根据本发明的实施例，DMOG的浓度并不受特别限制。根据本发明的ー些具体示例，DMOG的浓度为200-500 μ Μ,优选300 μ Μ。由此，本发明的细胞培养基能够使得毛乳头细胞快速有效地进行体外扩增，从而能够获得具有毛囊再生能力的毛乳头细胞。根据本发明的一些实施例，本发明的试剂盒可以进ー步包含基础培养基，该基础培养基可以为AminomaxC-100培养基(GIBC0，Catl7001)。根据本发明的实施例，在本发明的试剂盒中，AmnioMaxC-lOOsupplement (GIBC0,12556)与AmnioMaxC-IOO基础培养基(GIBCO，Cat 17001)的体积比为I 6。由此，能够提供细胞培养所需要的各种细胞因子以及谷氨酰胺。根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于体外培养毛乳头细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含前面所述的本发明的培养基。根据本发明的实施例，利用本发明的用于体外培养毛乳头细胞的试剂盒对毛乳头细胞进行体外培养，能够有效地使得毛乳头细胞扩增，从而能够有效地获得具有毛囊再生能力的毛乳头细胞或其衍生物。根据本发明的再一方面，本发明提供了前面所述的根据本发明实施例的细胞培养基在体外培养毛乳头细胞中的用途。由此，能够利用本发明的细胞培养对毛乳头细胞进行体外培养，并且获得的毛乳头细胞的毛囊再生能力好。根据本发明的另一方面，本发明提供了前面所述的根据本发明实施例的两种试剂 盒在体外培养毛乳头细胞中的用途。由此，能够利用本发明的试剂盒对毛乳头细胞进行体外培养，从而能够有效地获得具有毛囊再生能力的毛乳头细胞或其衍生物。根据本发明的又一方面，本发明提供了ー种体外培养毛乳头细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤利用根据本发明实施例的培养基，培养CD133阳性毛乳头细胞。发明人发现，利用本发明的体外培养毛乳头细胞的方法，能够有效地对毛乳头细胞进行体外培养，使得毛乳头细胞扩增，从而能够获得具有干细胞特性和毛囊诱导能力的毛乳头细胞或其衍生物。根据本发明的实施例，在本发明的体外培养毛乳头细胞的方法中，CD133阳性毛乳头细胞的来源不受特别限制。根据本发明的ー些具体示例，CD133阳性毛乳头细胞可以来源于人头皮或小鼠背部皮肤组织，其中人头皮为自愿捐献者头皮。根据本发明的实施例，上述⑶133阳性毛乳头细胞是通过下列步骤获得的首先，从人头皮或小鼠背部皮肤组织分离真皮细胞。然后，利用CD133抗体对所分离的真皮细胞进行分选，以便获得CD133阳性毛乳头细胞。根据本发明的一个实施例，CD133抗体可以为APC-CD133抗体。根据本发明的实施例，利用CD133抗体对所分离的真皮细胞进行分选可以进ー步包括将所分离的真皮细胞悬浮于PBS中；向培养基中添加APC-⑶133抗体，其中，按照每100微升培养基，每IO6个细胞添加APC-⑶133抗体I μ g，即5微升；以及利用流式细胞仪分选⑶133阳性毛乳头细胞。根据本发明的实施例，在本发明的体外培养毛乳头细胞的方法中，培养CD133阳性毛乳头细胞的设备及条件并不受特别限制。根据本发明的ー些具体示例，可以于37°C、5% CO2的培养箱中培养⑶133阳性毛乳头细胞。具体地，根据本发明的实施例，培养⑶133阳性毛乳头细胞可以进一歩包括每3天更换一次培养基，且每9-10天进行一次传代培养，培养至第3代。根据本发明的再一方面，本发明提供了一种毛乳头细胞或其衍生物。根据本发明的实施例，该毛乳头细胞或其衍生物是通过根据本发明实施例的体外培养毛乳头细胞的方法获得的。发明人发现，根据本发明实施例的毛乳头细胞或其衍生物能够在适当的条件下分化成毛囊细胞。根据本发明的另一方面，本发明提供了ー种体外培养毛乳头细胞的系统。根据本发明的实施例，该系统包括分离装置，该分离装置用于从人头皮或小鼠背部皮肤组织分离真皮细胞；分选装置，该分选装置与分离装置相连，并且适于利用CD133抗体从所分离的真皮细胞中分选CD133阳性毛乳头细胞；以及培养装置，该培养装置与分选装置相连，并且设置有根据本发明实施例的培养基，用于对CD133阳性毛乳头细胞进行培养。发明人发现，利用本发明的体外培养毛乳头细胞的系统，能够方便有效地对毛乳头细胞进行体外培养，并且获得的毛乳头细胞或其衍生物能够在适当的条件下分化成毛囊细胞。根据本发明的实施例，分选装置中的CD133抗体的荧光标记种类并不受特别限制。根据本发明的ー些具体示例，CD133抗体可以为APC-CD133抗体。根据本发明的实施例，可以作为分选装置的设备型号、厂家并不受特别限制，只要该设备适于利用APC-CD133抗体从所分离的真皮细胞中分选CD133阳性毛乳头细胞即可。根据本发明的ー些具体示例，分选装置为流式细胞仪。根据本发明的又一方面，本发明提供了一种鉴定制剂对毛囊组织是否具有影响的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤将根据本发明实施例的毛乳头细胞或其衍生物与制剂接触；以及对接触前后的毛乳头细胞或其衍生物进行检测，其中，基于毛乳·头细胞或其衍生物的形态变化，以及其干细胞特性和毛囊诱导能力标志物的表达变化，判断制剂对毛囊组织是否具有影响。利用该方法能够有效地鉴定制剂对毛囊组织是否具有影响。需要说明的是，本发明的细胞培养基及其用途，是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化的工作而完成的。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例I :毛乳头细胞(DPCs)分离培养按照以下步骤进行毛乳头细胞分离培养I.分离毛乳头细胞I. I取自愿捐献者头皮(也可以采用小鼠背部皮肤)，浸泡于70%こ醇中2_3min后，利用IXPBS将其进行洗涤；I. 2利用手术刀片去除人头皮上的毛发后，利用PBS将其进行洗涤；I. 3将上述处理好的人头皮转移至含O. 25%胰蛋白酶(消化液)的皿中，并置于4°C下过夜，以便获得消化过的头皮，其中，处理好的人头皮表皮朝上，漂浮于消化液中；I. 4利用刀片将皿中消化过的头皮去除表皮，保留真皮，并将真皮切成小块，然后，将皿中的混合物转入50ml离心管中，并利用IOml吸管反复吹打，至消化完全，以便获得含有毛乳头细胞的真皮细胞混合物；I. 5利用100 μ m滤网将上述含有毛乳头细胞的混合物进行过滤，并于500xg离心5min，然后利用PBS洗涤沉淀，以便分离获得真皮细胞，备用。2.分选⑶133阳性毛乳头细胞将上述分离的真皮细胞悬于PBS中，并按照每100 μ I体系，每IO6个细胞添加APC-⑶133抗体5 μ 1，即1“8，置于4で下301^11后，利用I XPBS将分离的真皮细胞进行洗涤，并利用流式细胞仪对进行分选，以便获得CD133阳性的毛乳头细胞，备用。其中，图I显示了利用流式细胞仪分选⑶133阳性毛乳头细胞的結果。
3.体外培养⑶133阳性毛乳头细胞将上述获得的⑶133阳性毛乳头细胞接种于细胞培养皿中，并向其中添加含 300ymDM0G、5ng/ml bFGF 以及 AmnioMaxC-lOOsupplement (GIBC0，12556)的AmnioMaxC-IOO培养基(GIBCO，Cat 17001)，然后于37°C、5% CO2的培养箱中进行培养，在培养过程中，每3天更换一次培养基，且9天-10天进行第I次传代培养，培养至第3代，获得体外扩增的毛乳头细胞。其中，AmnioMaxC-lOOsupplement与AminomaxC-100基础培养基的体积比为1:6。实施例2 :体外培养的毛乳头细胞的形态观察及多能性鉴定通过下列实验，对实施例I中体外培养的毛乳头细胞进行形态观察及多能性鉴定I.形态观察一般方法细胞培养至80%-90%融合，PBS洗涤细胞，再用0.25%胰酶-0.03%EDTA消化细胞，中止消化反应，细胞传代。次日细胞贴壁后即可于倒置显微镜下观察细胞形态。按照上述一般方法，于倒置显微镜下观察实施例I中培养了 5d的第I代⑶133阳性毛乳头细胞的细胞形态，结果见图2。由观察结果可知，培养了 5d的第一代毛乳头细胞增殖明显，呈凝集性生长，形态似成纤维状，即为真皮间充质来源的毛乳头细胞形态。此外，按照上述一般方法，将实施例I中生长至80% -90%融合的⑶133阳性毛乳头细胞用胰酶消化，于倒置显微镜下观察细胞形态，当细胞胞质回缩、细胞间隙増大，细胞变圆，終止反应，离心后加入新鲜培养液，传代。2.细胞免疫化学染色将实施例I中体外培养的第3代毛乳头细胞分别进行各种细胞免疫化学染色，以便检测细胞中表皮干细胞标志物CK19、CD200,非真皮成纤维细胞标志物α -SM,间充质来源标志物Vimentin以及毛乳头细胞标志物Versican、⑶133的表达情况，结果见图3和图4。图3显示了利用细胞免疫化学染色检测体外培养的毛乳头细胞中表皮干细胞标志物CK19，非真皮成纤维细胞标志物α-SMA，间充质来源标志物Vimentin以及毛乳头细胞标志物Versican、⑶133的表达的結果。如图3所示，①为阴性对照，②为Vimentin染色，③为Versican染色，④为⑶133，⑤为a-SMA染色，⑥为CK19染色。由图3可知，体外培养的毛乳头细胞中a-SMA、Vimentin、CD133、Versican均为阳性表达，CK19为阴性表达。图4显示了利用流式细胞仪检测体外培养的毛乳头细胞中CD200表达的結果。由图4可知，体外培养的毛乳头细胞中CD200为阴性表达，由此可知，本发明制备的毛乳头细胞为来源于真皮的间充质细胞。3.细胞化学染色采用AB-PAS和甲苯胺蓝对实施例I中的p3代毛乳头细胞进行组织化学染色，其中，染色前将贴壁后的细胞用4%多聚甲醛RT固定lOmin，然后利用蒸馏水洗涤细胞，备用。AB-PAS 染色 将上述处理好的毛乳头细胞，利用Alcian blue染色lOmin，然后利用蒸馏水洗漆。接着利用过碘酸将洗漆过的细胞处理IOmin,并再用蒸懼水洗漆,接下来向细胞滴加2mlSchiff液,进行染色IOmin后水洗5min,然后于倒置显微镜下观察,结果见图5。图5显示了第3代毛乳头细胞的AB-PAS组织化学染色結果。如图5所示，实施例I中的第3代毛乳头细胞的酸性粘液物质被Alcian blue染成湖兰色，中性粘液物质被PAS (periodie acidSchiff)染成紫蓝色。由图5可知，实施例I中的第3代毛乳头细胞AB-PAS染色显示为阳性，表明体外培养的毛乳头细胞能够合成酸性粘多糖和中性粘多糖，与体内功能相似。甲苯胺蓝染色分别采用pHl.O和pH5.0的O. 2M磷酸氢ニ钠缓冲液配制O. I %甲苯胺兰，接着，于室温下对上述处理好的毛乳头细胞进行染色5min，然后于倒置显微镜下进行观察，结果见图6。图6显示了第3代毛乳头细胞的甲苯胺蓝染色結果。如图6所示，①为pHl.O的甲苯胺蓝的染色结果，②为PH5. O的甲苯胺蓝的染色结果，其中，低pH甲苯胺蓝(PH1.0)染色呈蓝色，高PH甲苯胺蓝(PH5.0)染色则呈紫红色。由图6可知，实施例I中的第3代毛乳头细胞具有甲苯胺蓝异染性，显示经体外培养扩增到第3代的细胞具有毛乳头细胞的特性。
4.细胞増殖情况检测将实施例I中的体外培养的毛乳头细胞培养至第3代，按照cck-8试剂盒说明书所述的方法，依据以下步骤，检测毛乳头细胞増殖情况将细胞接种于96孔板，每孔接种5 X IO4个细胞，每板接种5孔，共接种7块细胞培养板，然后将细胞培养板置于37°C ,5% CO2的培养箱中进行培养。每天取ー块板加入CCK-8试剂，并继续培养3h，酶标仪测定450nm时细胞的吸光度值，并以培养时间为横坐标，细胞的吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线，结果见图7。图7显示了利用CCK-8检测体外培养的毛乳头细胞的生长曲线。由图7可知，每孔接种5X IO4个毛乳头细胞时，随着培养时间的延长，细胞数增多，培养6d后细胞进入平台期，表明毛乳头细胞在接种1-6天时增殖活力強，但当细胞密度达到一定程度，细胞不再扩增。5.裸鼠移植实验选择4-6周的Balb/c裸鼠，利用こ醚将其麻酔，然后于裸鼠背部两侧皮下分别注射体外培养的第3代人毛乳头细胞(移植细胞组)和生理盐水(对照组)，饲养3个月后，取接种部位皮肤制作石蜡切片，并将其进行HE染色，结果见图8。图8显示了接种毛乳头细胞的裸鼠皮肤组织及阴性对照的皮肤组织石蜡切片HE染色結果。由图8可知，移植细胞组石蜡切片染色可见大的毛囊样结构，而对照组毛囊小，且毛囊角化，毛干萎縮，表明接种的人毛乳头细胞能够在裸鼠体内发育成为完整的大的毛囊结构，且毛囊有多层结构组成，与未接种细胞的裸鼠毛囊结构不同。在本说明书的描述中，參考术语“ー个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“ー些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少ー个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解在不脱离本发明的原理和宗g的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
权利要求
1.ー种细胞培养基，其特征在于，包含 基础培养基，所述基础培养基为AminomaxC-IOO培养基；AmnioMaxC-I00supplement ；bFGF ;以及DMOG， 任选地，所述AmnioMaxC-100supplement与所述AminomaxC-IOO基础培养基的体积比为 I : 6, 任选地，所述bFGF的浓度为4-10ng/ml,优选5ng/ml, 任选地，所述DMOG的浓度为200-500 μ Μ，优选300 μ Μ。
2.ー种用于体外培养毛乳头细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有bFGF和DMOG， 任选地，进一步包含 AmnioMaxC-lOOsupplement, 任选地，所述bFGF、DMOG和AmnioMaxC-100supplement分别设置在不同的容器中， 任选地，进ー步包含基础培养基，所述基础培养基为AminomaxC-IOO培养基， 任选地，所述bFGF、DM0G和AmnioMaxC-100supplement的至少之一溶解于基础培养基， 任选地，所述bFGF的浓度为4-10ng/ml,优选5ng/ml, 任选地，所述DMOG的浓度为200-500 μ Μ，优选300 μ Μ。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在干，进ー步包含AmnioMaxC-100 suppIement, 任选地，所述Amni oMaxC-100 supp I ement与所述AmnioMaxC-IOO基础培养基的体积比为 I : 6。
4.一种用于体外培养毛乳头细胞的试剂盒，其特征在于，包含权利要求I所述的培养基。
5.权利要求I所述的培养基在体外培养毛乳头细胞中的用途。
6.权利要求2-4任一项所述的试剂盒在体外培养毛乳头细胞中的用途。
7.—种体外培养毛乳头细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤 利用权利要求I所述的培养基，培养CD133阳性毛乳头细胞， 任选地，所述CD133阳性毛乳头细胞来源于人头皮或小鼠背部皮肤组织， 任选地，所述⑶133阳性毛乳头细胞是通过下列步骤获得的 从人头皮或小鼠背部皮肤组织分离真皮细胞； 利用CD133抗体对所分离的真皮细胞进行分选，以便获得所述CD133阳性毛乳头细胞， 任选地，所述⑶133抗体为APC-⑶133抗体， 任选地，利用CD133抗体对所分离的真皮细胞进行分选进一歩包括 将所分离的真皮细胞悬浮于PBS中； 向所述培养基中添加APC-CD133抗体，任选地按照每100微升体系，每IO6个细胞添加APC-CD133 抗体 1μ g ;以及 利用流式细胞仪分选CD133阳性毛乳头细胞， 任选地，于37°C、5% CO2的培养箱中进行所述培养， 任选地，培养⑶133阳性毛乳头细胞进ー步包括每3天更换一次培养基，9-10天进行第一次传代培养，培养至第3代。
8.一种毛乳头细胞或其衍生物，其特征在干，是通过权利要求7所述的体外培养毛乳头细胞的方法获得的。
9.ー种体外培养毛乳头细胞的系统，其特征在于，包括 分离装置，所述分离装置用于从人头皮或小鼠背部皮肤组织分离真皮细胞； 分选装置，所述分选装置与所述分离装置相连，并且适于利用CD133抗体从所分离的真皮细胞中分选CD133阳性毛乳头细胞；以及 培养装置，所述培养装置与所述分选装置相连，并且设置有权利要求I所述的培养基，用于对所述CD133阳性毛乳头细胞进行培养， 任选地，所述⑶133抗体为APC-⑶133抗体， 任选地，所述分选装置为流式细胞仪。
10.一种鉴定制剂对毛囊组织是否具有影响的方法，其特征在于，包括以下步骤 将权利要求8所述的毛乳头细胞或其衍生物与所述制剂接触；以及 对接触前后的毛乳头细胞或其衍生物进行检測， 其中， 基于所述毛乳头细胞或其衍生物的形态变化，以及其干细胞特性和毛囊诱导能力标志物的表达变化，判断所述制剂对毛囊组织是否具有影响。
全文摘要
本发明涉及细胞培养基及其用途。其中，培养基包含基础培养基，该基础培养基为AminomaxC-100培养基；bFGF；以及DMOG。利用本发明的细胞培养基对分离的毛乳头细胞进行体外培养，能够有效地使得毛乳头细胞扩增，从而能够有效地获得具有干细胞特性和毛囊诱导能力的毛乳头细胞。
文档编号C12N5/071GK102676448SQ20121011344
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者习佳飞, 刘大庆, 吕洋, 姚海雷, 岳 文, 师伟, 张秀媛, 裴雪涛, 谢小燕, 陈琳 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所