专利名称：用于检测肠炎沙门氏菌的引物及含有该引物的检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于细菌检验领域，具体地说，涉及一种用于检测肠炎沙门氏菌的引物及含有该引物的试剂盒。
背景技术：
PCR技术是近二十年发展成熟的一种体外扩增特异性DNA片段的技术，具有简便、快速、灵敏度高和特异性强的优点，因而从上个世纪90年代以来开始尝试利用该技术检测食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌 。然而，现在一般的PCR技术只能鉴定到沙门氏菌属，无法直接区分血清型，通常还需要结合生化鉴定和血清学实验进行分型。近几年，随着一些沙门氏菌血清型测序的完成，国外开始有研究根据肠炎沙门氏菌特有的基因序列进行PCR检测，以达到特异性检测肠炎沙门氏菌的目的，国内相关研究较少。而对肠炎沙门氏菌的特异性PCR检测大多是根据sef操纵子基因进行的，例如根据sefltsefA基因对肠炎沙门氏菌进行检测，但随后陆续发现这些基因在其他个别血清型沙门氏菌中也存在，主要是和肠炎沙门氏菌同属D群的血清型菌，如S. Dublin, S. Pullorum,因此相关检测方法就不再具有完全的特异性了。2006年Clavijo等报道了 Prot6E基因可以编码SE的一种独特的表面菌毛，其特异性已得到多位学者的认可。Soumet等(1999年)利用多重PCR结合改良MSRV培养基的方法来特异性检测肠炎沙门氏菌。其根据沙门氏菌属特异性片段设计引物ST11-ST15，根据sefA基因设计引物Sen67-Sef478，以此检测了 1078份鸡舍环境棉拭子，其敏感度(95% )高于传统方法的敏感度(92. 5% )0Se。等(2004年)报道了根据sefA基因序列设计的实时荧光定量PCR法来特异性检测肠炎沙门氏菌(“Rapid, Specific Detection ofSalmonella Enteritidis in PooledEggs by Real-Time PCR”)，用该方法对染菌鸡蛋进行了检测，检测结果与传统方法所得结果完全吻合。
发明内容
本发明的目的是针对肠炎沙门氏菌特有的Prot6E基因提供一种特异性检测引物及含有该弓I物的检测试剂盒。为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测肠炎沙门氏菌的特异性引物，引物序列如下Prot6E-F:5’ -ACAGGGGCACAATAACCGTA-3’ ；Prot6E-R 5，-TGCATCCCTGTCACAACATT-3，。本发明进一步提供含有上述特异性引物的检测试剂盒，其包括引物Prot6E_F和Prot6E_R。优选地，所述检测试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTP、Taq酶中的一种或多种。更优选地，所述检测试剂盒还包括缓冲蛋白胨水(BPW)和亚硒酸盐胱氨酸(SC)选择性增菌液。
选取鸡体内最常见的大肠杆菌，亲缘关系最近、引起病症相似、基因同源性最高的鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌，根据该引物序列设计的PCR法进行检测，证明了 Prot6E基因的特异性。PCR反应体系为15iiL，各组分如下10XPCR缓冲液I. 5u L, dNTPO. 8 y L、引物Prot6E-F 与 Prot6E-R 各 0. 15 y L、模板 DNA1. 0 y L、Ex Taq 酶 0. 3 y L，双蒸水 11. I y L。PCR反应程序94°C 5min,94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 50s，经过 35 个循环，最后 72°C IOmin0 扩增产物于I. 5%的琼脂糖凝胶中电泳，观察结果。结果表明，Prot6E基因具有特异性，并且根据该引物进行PCR检测不会产生干扰条带(图I)。采用本发明提供的特异性引物进行肠炎沙门氏菌的检测，操作简便，易于掌握，便于在基层实验室中推广使用，仅需两天即可完成检测。同时本发明具有抗干扰能力强，灵敏度高，特异性强的优点，完全可以满足在家禽及其产品中快速、特异性检测肠炎沙门氏菌的需求，对于疫情的诊断和控制具有十分重要的作用，从而最大程度地避免了经济损失及对公共健康造成的危害。
图I为Prot6E基因特异性检测结果，其中，M markerl ；1 :肠炎沙门氏菌；2 :鸡白痢沙门氏菌；3 :大肠杆菌。图2为PCR检测体系的灵敏度分析结果，其中，M markerl ；B :空白对照；1_9 :模板 DNA 浓度分别为 0. 05ng/ u 1、0. 2ng/ u 1、0. 65ng/ u 1> I. 3ng/ u 1、4. 2ng/ u I、13ng/ u I、20.5ng/u I、55. 5ng/u l、138ng/u I。图3为检测鸡盲肠内容物中肠炎沙门氏菌的部分凝胶电泳结果，其中，M :marker I ；P :阳性对照；1_23 :盲肠内容物样本。图4为蛋鸡体内器官中肠炎沙门氏菌检测的部分凝胶电泳结果，其中，M :marker I ；P :阳性对照；B :空白对照；1~2 :肝脏;3_4 :阴道;5_6 :心脏；7~9脾脏；10 :卵巢；
11:输卵管膨大部；12 :漏斗部；13 :子宫；14 :峡部。图5为鸡蛋各部位中肠炎沙门氏菌检测的部分凝胶电泳结果,其中，M markerl ；P :阳性对照；B :空白对照；1_15 :鸡蛋样本。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例I采用本发明的特异性引物进行PCR检测I. I 引物Prot6E-F :5’ -ACAGGGGCACAATAACCGTA-3’ 和Prot6E-R:5’ -TGCATCCCTGTCACAACATT-3’I. 2 增菌取样后按I : 9比例加入缓冲蛋白胨水(BPW)振荡培养18小时，吸取Iml培养液加入到9ml亚硒酸盐胱氨酸选择性增菌液(SC)中，振荡培养18小时。I. 3 提取 DNA
取选择性增菌液2mL置于Ep管中，12000r/min离心5min、超纯水洗涤2次、用0. 2mL超纯水悬浮、隔水煮沸15min,插入冰中冷却2min, 12000r/min离心15min,取上清用作DNA模板。1.4PCR 扩增PCR反应中以肠炎沙门氏菌标准菌株DNA为阳性对照。PCR反应体系为15iiL，各组分如下:10XPCR缓冲液I. 5u L, dNTPO. 8 ii L、引物Prot6E-F 与 Prot6E-R 各 0. 15 y L、模板 DNA1. 0 y L、Ex Taq 酶 0. 3 y L，加双蒸水 11. I y L。PCR 反应程序94°C 5min,94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 50s，经过 35 个循环，最后 72°C IOmin0扩增产物于I. 5%的琼脂糖凝胶中电泳，观察结果(图I)，产物大小为175bp。实施例2采用本发明的特异性引物进行PCR检测的灵敏度分析
按照实施例I中1.3的方法提取肠炎沙门氏菌标准菌株DNA，用分光光度计测定DNA浓度为138ng/iil，按比例对其进行稀释并测定稀释后的准确浓度。分别取138ng/U I>55.5ng/u I、20. 5ng/uI、13ng/u 1>4. 2ng/u 1>I. 3ng/u 1>0. 65ng/u1>0. 2ng/uI、
0.05ng/ ill共9种浓度的DNA各I ill作为模板进行PCR扩增，扩增条件同实施例I中I. 4。结果如图2所示，结果表明，该PCR法能检测到模板DNA的下限值为0. 2ng，因此只要样品中模板DNA含量不低于0. 2ng，均可采用该法进行有效的扩增检测。实施例3采用本发明的特异性引物进行PCR检测与采用传统分离法检测肠炎沙门氏菌的比较取62只4周龄白来航蛋鸡，通过采食饲料接种IO4CFU肠炎沙门氏菌后，于第7天、第14天同时用实施例I的检测方法和传统的分离培养法检测盲肠内容物，其中传统的分离培养法包括前增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定、血清学分型共5个步骤。盲肠内容物中细菌含量多，菌种杂，含有很多不确定的干扰因素，能够检验该检测方法的灵敏度与准确性。结果表明，该PCR法的检出率明显高于传统的培养分离法，而且用时短、检测方便迅速。传统法检测呈阴性而PCR法检测显阳性的样品，经多次划线分离大部分可分离得到肠炎沙门氏菌。表IPCR法与传统培养分离法检出率和用时的比较
抬:出率■
側午用时
对照组试验组-；-
PCR 法0/14 39/482 天
培养分离法0/14 27/486天结果如表I和图3所示。该结果表明，仅肠炎沙门氏菌中出现了与目的片段大小一致的条带，测序后进行序列比对，结果与SE具有100%同源性，即表明Prot6E基因具有特异性。而在其他菌种中不会产生与该目的片段大小近似的条带，也就不会对检测造成干扰，表明该检测方法具有很强的抗干扰能力。实施例4采用本发明的特异性引物检测蛋鸡的不同部位取100只20周龄白来航蛋鸡、160只60周龄白来航蛋鸡分别通过采食饲料接种IO8CFU肠炎沙门氏菌后，用该特异性PCR法定期检测心脏、肝脏、脾脏、卵泡、卵巢、输卵管的漏斗部、膨大部、峡部、子宫、阴道、盲肠内容物、体内未产出鸡蛋与已产出鸡蛋的蛋壳、壳膜、蛋清、蛋黄各部位中肠炎沙门氏菌的定植情况，所得结果与国内外相关研究基本相符。部分结果如图4和图5所示。该结果表明，在蛋鸡体内的组织中，肠炎沙门氏菌在脏器中的定植率高于生殖器官；在鸡蛋各部位中，肠炎沙门氏菌在蛋壳中的检出率最高，其次为壳膜，而蛋黄、蛋白中最低。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。权利要求
1.用于检测肠炎沙门氏菌的特异性引物，引物序列如下Prot6E-F :5’ -ACAGGGGCACAATAACCGTA-3’ ；和Prot6E-R :5’ -TGCATCCCTGTCACAACATT-3’。
2.含有权利要求I所述特异性引物的检测试剂盒。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTP、Taq酶中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲蛋白胨水和亚硒酸盐胱氨酸选择性增菌液。
全文摘要
本发明是根据肠炎沙门氏菌特有的Prot6E基因，提供一种用于检测肠炎沙门氏菌的特异性引物及含有该引物的检测试剂盒，所述引物包括Prot6E-F和Prot6E-R(如Seq ID No.1和2所示)。采用本发明提供的特异性引物进行肠炎沙门氏菌的检测，操作简便，易于掌握，便于在基层实验室中推广使用，仅需两天即可完成检测。同时本发明具有抗干扰能力强，灵敏度高，特异性强的优点，完全可以满足在家禽及其产品中快速、特异性检测肠炎沙门氏菌的需求，对于疫情的诊断和控制具有十分重要的作用，从而最大程度地避免了经济损失及对公共健康造成的危害。
文档编号C12Q1/10GK102643915SQ201210112440
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月16日 优先权日2012年4月16日
发明者徐桂云, 杨宁, 樊世杰, 郑江霞 申请人:中国农业大学