专利名称：一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵领域，尤其是一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法。
背景技术：
家禽肿瘤和病毒感染性疾病的有效治疗一直是困扰禽病防治的重大难题之一。鸡的免疫系统以及在病原感染或注射疫苗时所产生的免疫反应与哺乳动物相似，所以可以应用细胞因子来控制与治疗禽类疾病。目前，动物滥用抗生素作为饲料添加剂的现象日益严重，动物性食品(尤其是鸡肉)的药物残 留超标，导致各种耐药菌株在人类身上不断出现，例如“超级细菌”，给人类健康带来严重威胁。鸡干扰素α蛋白制剂作为一种新型的绿色生物制品可以有效带动禽类的绿色高效养殖，具有广阔市场发展前景。然而目如米用原核表达系统来生广鸡Ct干扰素存在着表达质粒各易丢失、蛋白产量低、生产成本高等问题，严重制约了其工业化应用。因此从控制发酵参数入手，通过改良发酵培养基来解决上述难题，具有非常重要的生产实践意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法。本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法的制备方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，包括以下步骤(I)种子活化将表达鸡α干扰素的工程菌株大肠杆菌在固体LB培养基上活化，然后挑取一单菌落至50mL LB液体培养基中，在30 37°C，180 220rpm，培养12 24小时；再将得到的种子液按体积比1% 5%的接种量接种至LB培养基中，在30 37°C，180 220rpm，培养6 12小时，得到发酵种子液；(2)接种向发酵罐中填充发酵培养基，然后按体积比5% 10%的接种量将上述活化好的种子液接种至液体发酵培养基中；(3)发酵向发酵罐中通入空气或者空气/氧气的混合气体，通气量为2 4m3/h，发酵温度30 37°C，搅拌转数300 900rpm，溶氧控制在20 % 40 %，pH控制在6. 8
7.4，发酵时间11 24小时，当OD6tltlnm = 2 4时开始补料，补料的流加速度是100 lOOOmL/h ；(4)诱导当OD600nm = 4 6时开始添加IPTG诱导鸡α干扰素的表达，最后进行蛋白纯化，得到目的蛋白。优选的，上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，所述发酵罐为50L发酵罐。优选的，上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，所述培养基组成为LB培养基每升H2O中蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠IOg;
发酵培养基每升H2O中含有葡萄糖5 10g、蛋白胨5 10g、酵母粉5 10g、KH2PO4 2 4g,K2HPO4 I 4g、Na2HPO4 · 12H20 2 7g、(NH4)2SO4 O. 6 I. 2g、NH4Cl O. I O. 3g、MnSO4 · 5H20 O. 001 O. Olg、CoCl2 · 6H20 0. 004 0. Olg、Na2MoO4 · 2Η20 O. 001 O. 005g、ZnCl2O. 001 0. Olg、CuSO4 · 5H20 0. 001 0. Olg、H3BO4 0. 002 0. 012g、FeSO4 · 7H20 0. 01 0. 02g、CaCl2 · 2H20 0. 01 0. 04g、MgSO4 · 7H20 0. I 0. 6g、消泡剂0. I 0. 3g ;补料培养基每升H2O中葡萄糖120 260g、蛋白胨30 60g、酵母粉15 35g、MgSO4 · 7H20 2 6g、NaCl 3 7g。优选的，上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，所述培养基组成为LB培养基每升H2O中蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠IOg;发酵培养基每升H2O中葡萄糖7 10g、蛋白胨5 7g、酵母粉5 7g、KH2PO42 3g、K2HPO4 I 3g、Na2HPO4 · 12H20 2 4g、(NH4)2SO4 O. 6 I. 0g、NH4Cl O. I 0. 2g、MnSO4 ·5Η20 O. 001 0. 006g、CoCl2 ·6Η20 O. 004 O. Olg^Na2MoO4 ·2Η20 O. 001 O. 004g、ZnCl2 0· 001 0. 005g、CuSO4 · 5H20 0· 001 0. 007g、H3BO4 O. 002 0. 006g、FeSO4 · 7H200. 01 0. 02g、CaCl2 · 2H20 0. 01 0. 02g、MgSO4 · 7H20 0. 3 0. 6g、消泡剂 0. I 0. 2g ;补料培养基每升H2O中葡萄糖130 220g、蛋白胨45 60g、酵母粉20 35g、MgSO4 · 7H20 3 6g、NaCl3 5g。优选的，上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，所述培养基组成为LB培养基每升H2O中蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠IOg ；发酵培养基每升H2O中葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母粉5g、KH2P042g、K2HP044g、Na2HPO4 · 12H207g、(NH4)2SO4L 2g、NH4Cl 0. 2g、MnSO4 · 5H20 0. 001g、CoCl2 · 6H20 0. 004g、Na2MoO4 · 2H20 0. 002g、ZnCl2 0. 002g、CuSO4 · 5H20 0. 001g、H3BO4 0. 005g、FeSO4 · 7H200. 02g、CaCl · 2H20 0. 02g、MgSO4 · 7H20 0. 3g、消泡剂 0. 2g ；补料培养基每升H2O中葡萄糖150g，蛋白胨45g，酵母粉25g，MgS04. 7H204g，NaCl5g。优选的，上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，所述培养基组成为LB培养基每升H2O中蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠IOg ；发酵培养基每升H2O中葡萄糖10g、蛋白胨6g、酵母粉6g、KH2PO4 2g、K2HPO4 lg、Na2HPO4 · 12H20 2g、(NH4)2SO4 0. 6g、NH4Cl 0. lg、MnSO4 · 5H20 0. 001g、CoCl2 · 6H20 0. 004g、Na2MoO4 · 2H20 0. OOlg^ZnCl2 0. OOUCuSO4 · 5H20 0. OOlg^H3BO4O. 002g、FeSO4 · 7H20 0. Olg、CaCl2 · 2H20 0. OUMgSO4 · 7H20 0. 4g、消泡剂 0. Ig ；补料培养基每升H2O中葡萄糖200g、蛋白胨60g、酵母粉35g、MgS04 *7H206g,NaCl3g。优选的，上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，所述培养基组成为LB培养基每升H2O中蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠IOg ；发酵培养基每升H2O中葡萄糖8g、蛋白胨5g、酵母粉5g、KH2PO4 3g、K2HPO4 2g、Na2HPO4 · 12H20 3g、(NH4)2SO4 0. 8g、NH4Cl 0. 2g、MnSO4 · 5H20 0. 005g、CoCl2 · 6H20 0. Olg、Na2MoO4 ·2Η20 0. 003g、ZnCl2 0. 005、CuSO4 ·5H20 0. 005g,H3BO4 0. 004g、FeSO4 ·7H20 0. Olg、CaCl2 · 2H20 0. OUMgSO4 · 7H20 0. 6g、消泡剂 0. 2g ；
补料培养基每升H2O中葡萄糖220g、蛋白胨60g、酵母粉20g、MgS04· 7H20 3g、NaCl 4g。
优选的，上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，所述培养基组成为LB培养基每升H2O中蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠IOg ；发酵培养基每升H2O中葡萄糖5g、蛋白胨5g、酵母粉10g、KH2PO4 2g、K2HPO4 lg、Na2HPO4 · 12H20 7g、(NH4)2SO4O. 6g、NH4Cl 0. lg、MnSO4 · 5H20 0. OOlg、CoCl2 · 6H20 0. Olg、Na2MoO4 · 2H20 0. 001g、ZnCl2O. 001g、CuSO4 · 5H20 0. 001g、H3BO4O. 012g、FeSO4 · 7H20 0. 02g、CaCl2 · 2H20 0. Olg、MgSO4 · 7H20 0. lg、消泡剂 0. 3g ；补料培养基每升H2O中葡萄糖260g、蛋白胨30g、酵母粉15g、MgSO4 · 7H20 6g、NaCl 7g。优选的，上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，所述步骤(I)中单菌落培养时间为16 20小时。优选的，上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，所述步骤(3)中搅拌转数为 400 600rpm, pH 控制在 7. O。优选的，上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，所述步骤(3)中溶氧控制在 25% 35%。优选的，上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，所述步骤(3)中补料时间为 OD6ticinm = 3 小时。优选的，上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，所述步骤(3)中补料的流加速度控制方法为补料开始后的第一个小时控制流加速度为100 200mL/h，之后每2 4小时流加速度增加50 100mL/h。优选的，上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，所述步骤(4)中诱导时间为 OD6tltlnm = 5 小时。优选的，上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，所述步骤(4)中诱导剂IPTG 浓度为 0. 5 I. OmM0本发明的有益效果是上述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，通过有效控制发酵过程中的关键参数实现了重组大肠杆菌高密度生长，尤其在配合使用改良后的发酵培养基与补料培养基的情况下，在充分满足工程菌发酵过程中营养要求的同时，使鸡α干扰素的单位产量提高为改良前的3 4倍，有效降低了生产成本，对大规模工业生产具有非常重要的指导意义。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。下述实施例中采用的发酵罐是镇江科润海生物工程设备有限公司生产的50L发酵罐，补料瓶是四川蜀牛公司生产的；所采用的试剂均为普通化学试剂公司购买，所用消泡剂购自江苏斯德瑞克化工有限公司，YJG-I。实施例I一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，包括以下步骤(I)种子活化将表达鸡α干扰素的工程菌株大肠杆菌在固体LB培养基上活化，然后挑取一单菌落至50mL LB液体培养基中，在35°C，200rpm，培养17小时；再将得到的种子液按体积比4%的接种量接种至LB培养基中，在35°C，200rpm,培养10小时，得到发酵种子液；(2)接种向发酵罐中填充发酵培养基，然后按体积比7%的接种量将上述活化好的种子液接种至液体发酵培养基中；(3)发酵向发酵罐中通入空气或者空气/氧气的混合气体，通气量为3m3/h，发酵温度35°C，搅拌转数500rpm，溶氧控制在30%，pH控制在7. O，发酵时间18小时，当OD6tltol=3时开始补料,补料的流加速度是600mL/h ,所述补料的流加速度控制方法为补料开始后的第一个小时控制流加速度为150mL/h，之后每3小时流加速度增加80mL/h ；(4)诱导当OD600nm = 5时开始添加O. 8mM IPTG诱导鸡α干扰素的表达，最后进行蛋白纯化，得到目的蛋白。上述各培养基组成如下LB培养基每升H2O中蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化钠IOg ；发酵培养基每升H2O中葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母粉5g、KH2PO4 2g、K2HPO4 4g、Na2HPO4 · 12H20 7g、(NH4)2SO4L 2g、NH4Cl 0. 2g、MnSO4 · 5H20 0. OOlg、CoCl2 · 6H20 0. 004g、Na2MoO4 · 2H20 0. 002g、ZnCl2 0. 002g、CuSO4 · 5H20 0. OOlg、H3BO4 0. 005g、FeSO4 · 7H200. 02g、CaCl · 2H20 0. 02g、MgSO4 · 7H20 0. 3g、消泡剂 0. 2g ；补料培养基每升H2O中葡萄糖150g，蛋白胨45g，酵母粉25g，MgS04. 7H204g，NaCl5g。实施例2一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，包括以下步骤(I)种子活化将表达鸡α干扰素的工程菌株大肠杆菌在固体LB培养基上活化，然后挑取一单菌落至50mL LB液体培养基中，在37°C，180rpm，培养24小时；再将得到的种子液按体积比5%的接种量接种至LB培养基中，在30°C，220rpm,培养12小时，得到发酵种子液；(2)接种向发酵罐中填充发酵培养基，然后按体积比5%的接种量将上述活化好的种子液接种至液体发酵培养基中；(3)发酵向发酵罐中通入空气或者空气/氧气的混合气体，通气量为2m3/h，发酵温度37°C，搅拌转数900rpm，溶氧控制在25%，pH控制在7. 4，发酵时间24小时，当OD6tltol=2时开始补料,补料的流加速度是100mL/h ；(4)诱导当OD600nm = 6时开始添加0. 7mM IPTG诱导鸡α干扰素的表达，最后进行蛋白纯化，得到目的蛋白。上述各培养基组成如下LB培养基每升H2O中蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化钠IOg ；发酵培养基每升H2O中葡萄糖10g、蛋白胨6g、酵母粉6g、KH2PO4 2g、K2HPO4 lg、Na2HPO4 · 12H20 2g、(NH4)2SO4O. 6g、NH4Cl 0. lg、MnSO4 · 5H20 0. OOlg、CoCl2 · 6H20 0. 004g、Na2MoO4 · 2H20 0. OOlg、ZnCl2O. OOUCuSO4 · 5H20 0. OOlg、H3BO4O. 002g、FeSO4 · 7H20 0. Olg、CaCl2 · 2H20 0. OUMgSO4 · 7H20 0. 4g、消泡剂 0. Ig ；补料培养基每升H2O中葡萄糖200g、蛋白胨60g、酵母粉35g、MgSO4 · 7H20 6g、NaCl 3g。实施例3一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，包括以下步骤(I)种子活化将表达鸡α干扰素的工程菌株大肠杆菌在固体LB培养基上活化，然后挑取一 单菌落至50mL LB液体培养基中，在30°C，220rpm，培养12小时；再将得到的种子液按体积比I %的接种量接种至LB培养基中，在37°C，180rpm,培养6小时，得到发酵种子液；(2)接种向发酵罐中填充发酵培养基，然后按体积比10%的接种量将上述活化好的种子液接种至液体发酵培养基中；(3)发酵向发酵罐中通入空气或者空气/氧气的混合气体，通气量为4m3/h，发酵温度30 V，搅拌转数300rpm，溶氧控制在约20 %，pH控制在6. 8，发酵时间11小时，当OD6tltol=4时开始补料,补料的流加速度是1000mL/h,所述补料的流加速度控制方法为补料开始后的第一个小时控制流加速度为200mL/h，之后每2小时流加速度增加100mL/h ；(4)诱导当OD600nm = 4时开始添加I. OmM IPTG诱导鸡α干扰素的表达，最后进行蛋白纯化，得到目的蛋白。上述各培养基组成如下LB培养基每升H2O中蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化钠IOg ；发酵培养基每升H2O中葡萄糖8g、蛋白胨5g、酵母粉5g、KH2P043g、K2HPO4 2g、Na2HPO4 · 12H20 3g、(NH4)2SO4O. 8g、NH4Cl 0. 2g、MnSO4 · 5H20 0. 005g、CoCl2 · 6H20 0. Olg、Na2MoO4 · 2H20 0. 003g、ZnCl2O. 005、CuSO4 · 5H20 0. 005g、H3BO4 0. 004g、FeSO4 · 7H20 0. Olg、CaCl2 · 2H20 0. OUMgSO4 · 7H20 0. 6g、消泡剂 0. 2g ；补料培养基每升H2O中葡萄糖220g、蛋白胨60g、酵母粉20g、MgS04· 7H20 3g、NaCl 4g。实施例4一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，包括以下步骤(I)种子活化将表达鸡α干扰素的工程菌株大肠杆菌在固体LB培养基上活化，然后挑取一单菌落至50mL LB液体培养基中，在33°C，190rpm，培养16小时；再将得到的种子液按体积比4%的接种量接种至LB培养基中，在36°C，190rpm,培养10小时，得到发酵种子液；(2)接种向发酵罐中填充发酵培养基，然后按体积比9%的接种量将上述活化好的种子液接种至液体发酵培养基中；(3)发酵向发酵罐中通入空气或者空气/氧气的混合气体，通气量为3m3/h，发酵温度34°C，搅拌转数600rpm，溶氧控制在35%，pH控制在7. 2，发酵时间21小时，当OD6tltol=4时开始补料,补料的流加速度是300mL/h,所述补料的流加速度控制方法为补料开始后的第一个小时控制流加速度为100mL/h，之后每4小时流加速度增加50mL/h ；(4)诱导当OD600nm = 4时开始添加0. 5mM IPTG诱导鸡α干扰素的表达，最后进行蛋白纯化，得到目的蛋白。上述各培养基组成如下LB培养基每升H2O中蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化钠IOg ；
发酵培养基每升H2O中葡萄糖5g、蛋白胨5g、酵母粉10g、KH2PO4 2g、K2HPO4 lg、Na2HPO4 · 12H20 7g、(NH4)2SO4O. 6g、NH4Cl 0. lg、MnSO4 · 5H20 0. OOlg、CoCl2 · 6H20 0. Olg、Na2MoO4 ·2Η20 0. 001g、ZnCl20. 001g、CuS04 ·5H20 0. OOlg^H3BO4 0. 012g、FeS04 ·7H20 0. 02g、CaCl2 · 2H20 0. Olg、MgSO4 · 7H20 0. lg、消泡剂 0. 3g ；补料培养基每升H2O中葡萄糖260g、蛋白胨30g、酵母粉15g、MgSO4 · 7H20 6g、NaCl 7g。实施例5一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，包括以下步骤(I)种子活化将表达鸡α干扰素的工程菌株大肠杆菌在固体LB培养基上活化，然后挑取一单菌落至50mL LB液体培养基中，在36°C，210rpm，培养20小时；再将得到的种子液按体积比3%的接种量接种至LB培养基中，在36°C，210rpm，培养9小时，得到发酵种 子液； (2)接种向发酵罐中填充发酵培养基，然后按体积比7%的接种量将上述活化好的种子液接种至液体发酵培养基中；(3)发酵向发酵罐中通入空气或者空气/氧气的混合气体，通气量为4m3/h，发酵温度32°C，搅拌转数400rpm，溶氧控制在28%，pH控制在7. O,发酵时间20小时，当OD6tltol=2时开始补料,补料的流加速度是800mL/h,所述补料的流加速度控制方法为补料开始后的第一个小时控制流加速度为200mL/h，之后每3小时流加速度增加90mL/h ；(4)诱导当OD600nm = 6时开始添加0. 6mM IPTG诱导鸡α干扰素的表达，最后进行蛋白纯化，得到目的蛋白。上述各培养基组成如下LB培养基每升H2O中蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化钠IOg ；发酵培养基每升H2O中含有葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母粉5g、KH2P043g、K2HPO43g、Na2HPO4 · 12H20 4g、(NH4)2SO4O. 6g、NH4Cl 0. lg、MnSO4 · 5H200. 006g、CoCl2 · 6H20 0. Olg、Na2MoO4 · 2H20 0. OOlg、ZnCl2O. OOlg、CuSO4 · 5H200. 007g、H3BO4 0. 006g、FeSO4 · 7H20 0. Olg、CaCl2 · 2H20 0. 02g、MgSO4 · 7H200. 6g、消泡剂 0. Ig ；补料培养基每升H2O中葡萄糖260g、蛋白胨30g、酵母粉15g、MgS04 *7H206g,NaCl7g。实施例6一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，包括以下步骤(I)种子活化将表达鸡α干扰素的工程菌株大肠杆菌在固体LB培养基上活化，然后挑取一单菌落至50mL LB液体培养基中，在32°C，185rpm，培养21小时；再将得到的种子液按体积比5%的接种量接种至LB培养基中，在35°C，220rpm,培养11小时，得到发酵种子液；(2)接种向发酵罐中填充发酵培养基，然后按体积比7%的接种量将上述活化好的种子液接种至液体发酵培养基中；(3)发酵向发酵罐中通入空气或者空气/氧气的混合气体，通气量为3m3/h，发酵温度34°C，搅拌转数600rpm，溶氧控制在32%，pH控制在6. 9，发酵时间19小时，当OD6tltol=4时开始补料,补料的流加速度是500mL/h,所述补料的流加速度控制方法为补料开始后的第一个小时控制流加速度为100mL/h，之后每3小时流加速度增加70mL/h ；(4)诱导当OD600nm = 5时开始添加O. 8mM I PTG诱导鸡α干扰素的表达，最后进行蛋白纯化，得到目的蛋白。上述各培养基组成如下LB培养基每升H2O中蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化钠IOg ；发酵培养基每升H2O中含有葡萄糖7g、蛋白胨7g、酵母粉7g、KH2P042g、K2HP04lg、Na2HPO4 · 12H20 2g、(NH4)2SO4L 0g、NH4Cl 0. 2g、MnSO4 · 5H200. OOlg、CoCl2 · 6H20 0. 004g、Na2MoO4 · 2H20 0. 004g、ZnCl2O. 005g、CuSO4 · 5H200. OOlg、H3BO4 0. 002g、FeSO4 · 7H20 0. 02g、CaCl2 · 2H20 0. Olg、MgSO4 · 7H200. 3g、消泡剂 0. 2g ；补料培养基每升H2O中葡萄糖120g、蛋白胨60g、酵母粉35g、MgSO4 · 7H20 2g、NaCl 3g。实施例7一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，包括以下步骤(I)种子活化将表达鸡α干扰素的工程菌株大肠杆菌在固体LB培养基上活化，然后挑取一单菌落至50mL LB液体培养基中，在37°C，190rpm，培养22小时；再将得到的种子液按体积比2%的接种量接种至LB培养基中，在35°C，190rpm，培养9小时，得到发酵种子液；(2)接种向发酵罐中填充发酵培养基，然后按体积比7%的接种量将上述活化好的种子液接种至液体发酵培养基中；(3)发酵向发酵罐中通入空气或者空气/氧气的混合气体，通气量为2m3/h，发酵温度34°C，搅拌转数500rpm，溶氧控制在34%，pH控制在6. 8，发酵时间18小时，当OD6tltol=2时开始补料,补料的流加速度是100mL/h。(4)诱导当OD600nm = 4时开始添加I. OmM IPTG诱导鸡α干扰素的表达，最后进行蛋白纯化，得到目的蛋白。上述各培养基组成如下LB培养基每升H2O中蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化钠IOg ；发酵培养基每升H2O中葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母粉5g、KH2P04 4g、K2HP04 4g、Na2HPO4 · 12H20 2g、(NH4)2SO4 I. 2g、NH4Cl 0. 3g、MnSO4 · 5H20 0. Olg、CoCl2 · 6H20 0. 004g、Na2MoO4 · 2H20 0. 005g、ZnCl2 0. Olg、CuSO4 · 5H20 0. Olg、H3BO4O. 002g、FeSO4 · 7H20 0. Olg、CaCl2 · 2H20 0. 04g、MgSO4 · 7H20 0. 6g、消泡剂 0. Ig ；补料培养基每升H2O中葡萄糖130g、蛋白胨45g、酵母粉35g、MgSO4 · 7H20 6g、NaC15g。实施例8一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，包括以下步骤(I)种子活化将表达鸡α干扰素的工程菌株大肠杆菌在固体LB培养基上活化，然后挑取一单菌落至50mL LB液体培养基中，在31°C，180rpm，培养14小时；再将得到的种子液按体积比2%的接种量接种至LB培养基中，在3rC，200rpm，培养7小时，得到发酵种子液；(2)接种向发酵罐中填充发酵培养基，然后按体积比9%的接种量将上述活化好的种子液接种至液体发酵培养基中；(3)发酵向发酵罐中通入空气或者空气/氧气的混合气体，通气量为4m3/h，发酵温度37°C，搅拌转数800rpm，溶氧控制在40%，pH控制在6. 8，发酵时间18小时，当OD6tltol=3时开始补料,补料的流加速度是700mL/h,所述补料的流加速度控制方法为补料开始后的第一个小时控制流加速度为200mL/h，之后每3小时流加速度增加70mL/h ；(4)诱导当OD600nm = 5时开始添加O. 9mM IPTG诱导鸡α干扰素的表达，最后进行蛋白纯化，得到目的蛋白。上述各培养基组成如下LB培养基每升H2O中蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠IOg;
发酵培养基每升H2O中葡萄糖5g、蛋白胨5g、酵母粉10g、KH2PO4 2g、K2HPO4 lg、Na2HPO4 · 12H20 7g、(NH4)2SO4 0. 6g、NH4Cl 0. lg、MnSO4 · 5H20 0. OOlg、CoCl2 · 6H20 0. Olg、Na2MoO4 ·2Η20 0. 001g、ZnCl20. 001g、CuS04 ·5H20 0. OOlg^H3BO4 0. 012g、FeS04 ·7H20 0. 02g、CaCl2 · 2H20 0. Olg、MgSO4 · 7H20 0. lg、消泡剂 0. 3g ；补料培养基每升H2O中葡萄糖220g、蛋白胨60g、酵母粉20g、MgS04· 7H20 3g、NaCl 4g。实施例9一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，包括以下步骤(I)种子活化将表达鸡α干扰素的工程菌株大肠杆菌在固体LB培养基上活化，然后挑取一单菌落至50mL LB液体培养基中，在35°C，200rpm，培养17小时；再将得到的种子液按体积比4%的接种量接种至LB培养基中，在35°C，200rpm,培养10小时，得到发酵种子液；(2)接种向发酵罐中填充发酵培养基，然后按体积比7%的接种量将上述活化好的种子液接种至液体发酵培养基中；(3)发酵向发酵罐中通入空气或者空气/氧气的混合气体，通气量为3m3/h，发酵温度35°C，搅拌转数500rpm，溶氧控制在38%，pH控制在7. O，发酵时间18小时，当OD6tltol=3时开始补料,补料的流加速度是600mL/h,所述补料的流加速度控制方法为补料开始后的第一个小时控制流加速度为150mL/h，之后每3小时流加速度增加80mL/h ；(4)诱导当OD600nm = 5时开始添加0. 8mM IPTG诱导鸡α干扰素的表达，最后进行蛋白纯化，得到目的蛋白。上述各培养基组成如下LB培养基每升H2O中蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠IOg;发酵培养基每升H2O中葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母粉10g、KH2P043g、K2HP04 2g、Na2HPO4 · 12H20 3g、NaCl 5g、消泡剂 0. 2g ；补料培养基每升H2O中葡萄糖600g、酵母粉50g、蛋白胨25g、MgSO4 · 7H2010g。将实施例1-8之一所述各组分用量按照相同比例增加或减少，所得各组分的用量配比关系均属于本发明的保护范围。上述实施例1-9之一所述各培养基的制备方法如下(一)LB培养基的制备方法(I)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)在蒸馏水溶液中溶解；(3) 121°C,20分钟条件下灭菌，即得。( 二 )发酵培养基的制备方法(I)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；(2)在蒸馏水溶液中溶解；(3)用50%氨水溶液调节pH值至7. O ;
(4)在发酵罐内，121°C，20分钟条件下灭菌，即得。(三)补料培养基的制备方法(I)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；(2)在蒸馏水溶液中溶解；(3)用50%氨水溶液调节pH值至7. O ;(4)装入补料瓶中在115°C，20分钟条件下灭菌，即得。上述实施例1-9的发酵结果见表I。其中，最终菌体OD6tltol的测定方法为菌体经过适当稀释后测定其600nm处吸光度；最终菌体湿重的测定方法为4500rpm,离心15min,弃上清,收集菌体,称重。表I
权利要求
1.一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，其特征在于包括以下步骤 (1)种子活化将表达鸡α干扰素的工程菌株大肠杆菌在固体LB培养基上活化，然后挑取一单菌落至50mL LB液体培养基中，在30 37°C，180 220rpm，培养12 24小时；再将得到的种子液按体积比1% 5%的接种量接种至LB培养基中，在30 37°C，180 220rpm，培养6 12小时，得到发酵种子液； (2)接种向发酵罐中填充发酵培养基，然后按体积比5% 10%的接种量将上述活化好的种子液接种至液体发酵培养基中； (3)发酵向发酵罐中通入空气或者空气/氧气的混合气体，通气量为2 4m3/h，发酵温度30 37 °C，搅拌转数300 900rpm，溶氧控制在20% 40%，pH控制在6. 8 7. 4，发酵时间11 24小时，当OD6tltlnm = 2 4时开始补料，补料的流加速度是100 IOOOmL/h ； (4)诱导当OD6ticinm= 4 6时开始添加IPTG诱导鸡α干扰素的表达，最后进行蛋白纯化，得到目的蛋白。
2.根据权利要求I所述的鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，其特征在于所述发酵罐为50L发酵罐。
3.根据权利要求I所述的鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，其特征在于所述培养基组成为 LB培养基每升H2O中蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠IOg ； 发酵培养基每升H2O中含有葡萄糖5 10g、蛋白胨5 10g、酵母粉5 10g、KH2P042 4g、K2HPO4 I 4g、Na2HPO4 · 12H20 2 7g、(NH4)2SO4 O. 6 I. 2g、NH4Cl O. I O. 3g、MnSO4 ·5Η20 O. 001 O. Olg、CoCl2 · 6H20 0. 004 0. Olg、Na2MoO4 · 2Η20 O. 001 O. 005g、ZnCl2O. 001 0. Olg、CuSO4 · 5H20 0. 001 0. Olg、H3BO4 0. 002 0. 012g、FeSO4 · 7H200. 01 0. 02g、GaCl2 · 2H20 0. 01 0. 04g、MgSO4 · 7H20 0. I 0. 6g、消泡剂 0. I 0. 3g ; 补料培养基每升H2O中葡萄糖120 260g、蛋白胨30 60g、酵母粉15 35g、MgSO4 · 7H20 2 6g、NaGl 3 7g。
4.根据权利要求I所述的鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，其特征在于所述步骤(I)中单菌落培养时间为16 20小时。
5.根据权利要求I所述的鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，其特征在于所述步骤(3)中搅拌转数为400 600rpm，pH控制在7. O。
6.根据权利要求I所述的鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，其特征在于所述步骤⑶中溶氧控制在25% 35%。
7.根据权利要求I所述的鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，其特征在于所述步骤⑶中补料时间为OD6tltol = 3小时。
8.根据权利要求I所述的鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，其特征在于所述步骤(3)中补料的流加速度控制方法为补料开始后的第一个小时控制流加速度为100 200mL/h,之后每2 4小时流加速度增加50 100mL/h。
9.根据权利要求I所述的鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，其特征在于所述步骤(4)中诱导时间为OD6tltol = 5小时。
10.根据权利要求I所述的鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，其特征在于所述步骤⑷中诱导剂IPTG浓度为O. 5 I . OmM。
全文摘要
本发明提供了一种鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，包括(1)种子活化、(2)接种、(3)发酵和(4)诱导四步骤组成；所述鸡α干扰素原核表达的高密度发酵方法，通过有效控制发酵过程中的关键参数实现了重组大肠杆菌高密度生长，尤其在配合使用改良后的发酵培养基与补料培养基的情况下，在充分满足工程菌发酵过程中营养要求的同时，使鸡α干扰素的单位产量提高为改良前的3～4倍，有效降低了生产成本，对大规模工业生产具有非常重要的指导意义。
文档编号C12P21/02GK102643888SQ20121013173
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月27日 优先权日2012年4月27日
发明者高应瑞 申请人:天津生机集团股份有限公司