专利名称：一种高效表达重组人凝血八因子的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用哺乳动物细胞培养高效表达重组八因子的工艺方法。
背景技术：
天然人凝血八因子(FVIII)是一种大分子糖蛋白，由重链和轻链结合而成，总分子量330KD，血浆中含量约O. 2mg/L,以结合血管性血友病因子(VWF)的形式存在。血液凝集反应中，活化的FVIII使FIX的酶活大大提高，催化FX的活化，并结合组成一个复合体，催化凝集链式反应进行下去。FVIII分子的缺失或缺乏导致A型血友病，补充有活性的FVIII是治疗A型血友病的有效措施。重组人FVI11与天然FVI11有相同的生理，药理和免疫特征，并且有杜绝HIV，HDV,蛋白病毒等病源传播的优点，因此，重组FVIII蛋白表达的研究成为A型血友病治疗的一个重要趋势。世界上第一支重组人凝血八因子，即第一代的重组八因子在1990年就已经上市。目前全球的八因子销售年达到了 70亿国际单位，其中60%为基因工程重组凝血八因子。天然FVIII总是与vWF结合成复合物而稳定存在。重组FVIII分泌至细胞的无血清培养基时，分子很容易解体，并且被降解，表达的FVIII得不到积累。利用vWF和FVIII共表达系统可以很好地解决重组FVIII在细胞分泌表达过程中的不稳定和容易降解等问题。Kaufman等人的研究表明，FVIII与VWF共表达后可显著提高FVIII的表达水平。此外，在有血清的培养条件下,血清中的VWF可以结合新生成的VIII，形成比较稳定的复合物,达到FVIII在细胞培养液中累积的效果。在利用细胞大规模培养来生产重组八因子过程中，为了提高八因子的表达量，利用有血清培养基或者在哺乳动物细胞中共转染FVIII和VWF基因，稳定了八因子的表达，但这两种方法都存在各自的局限性。对于有血清培养基来说，由于在哺乳动物细胞培养过程中，外源添加动物血清而带来了病毒潜在污染的风险。因此，目前利用哺乳动物细胞生产蛋白质药物中倾向于无血清培养替代有血清细胞培养。而对于VWF与FVIII基因的共表达来说，人们在研究重组人凝血八因子表达中发现，VffF与FVIII共表达，八因子的表达量比较低，细胞株的构建也比较复杂，筛选出的高表达八因子细胞株在无血清培养基中的表达量一般在O. 1-0.5国际单位/天/IO6细胞，此表达水平远远达不到产业化的要求。可见，目前急需一种新的培养方法来表达重组八因子，能够在无血清培养条件下实现重组八因子的工业化生产，使八因子的表达简单、高效、无病毒污染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用哺乳动物细胞培养高效表达重组八因子的工艺方法。本发明首先公开了一种高效表达重组人凝血八因子的方法，为将外源的血管性血友病因子添加到表达重组人凝血八因子的细胞培养液中，并在培养过程中控制细胞培养液、中血管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为I 10:1。较优的，所述表达重组人凝血八因子的细胞培养液为无血清细胞培养液。本发明中所述表达重组人凝血八因子的细胞为单独表达重组FVIII的细胞株，VWF为另外制备，作为分子伴侣额外添加到表达重组人凝血八因子的细胞培养液中的外源物质。本发明提供的技术方案是将VWF按照一定的比例添加到重组八因子的细胞培养液中，可大大提高重组八因子的表达量，这种方法为工业化八因子的生产提供了一种简单实用的实现路径。本发明的方法不需将八因子和VWF基因共转染宿主细胞，简化了细胞株构建过程，提高了高产细胞株筛选效率，特别适合工业化大规模生产重组人凝血八因子。较优的，所述高效表达重组人凝血八因子的方法具体步骤如下
I)表达细胞的准备表达人凝血八因子的细胞株的构建或者表达人凝血八因子的冻存细胞的复苏；2)表达细胞的扩种培养将步骤I)构建或复苏的人凝血八因子表达细胞接种到无血清培养基中，振荡培养3 4天，至细胞密度达到I 2 X 106cells/ml，细胞传代，振荡培扩增养至细胞密度达到I 2X106cells/ml，获得种子液；3)细胞反应器培养将步骤2)获得的种子液接种到细胞反应器的无血清培养基中，培养4 7天，使细胞液的细胞密度达到I 5X106cellS/ml ;然后向细胞液中加入外源VWF并对细胞液进行补料培养，获得细胞原液；所述补料培养过程中，控制细胞液中VWF活性与FVIII活性比为I 10:1 ;4)凝血八因子产品的制备对细胞原液进行离心、过滤、纯化处理，获得重组人凝血八因子产品。步骤I)所述表达人凝血八因子的细胞株或者表达人凝血八因子的冻存细胞为构建的单独表达人凝血八因子的细胞株，并且表达的FVIII包括全长FVIII的和B区有缺失的FVIII片段。构建方法为常规分子生物学重组蛋白制备方法。较优的，步骤2)中构建或复苏的人凝血八因子表达细胞以I 9X105cells/ml的接种量进行接种。表达细胞的扩种培养可以将构建或复苏的人凝血八因子表达细胞接种到三角瓶中，经过摇瓶培养、传代、摇瓶培养获得种子液。较优的，步骤2)中所述细胞传代是以1:2 4的传代比例传代。更优的，步骤2)中所述细胞传代是以1:3的传代比例传代。较优的，步骤2)中振荡培养的条件为转速60 150转/分钟，培养温度32 38。。。较优的，步骤3)种子液接种到细胞反应器的接种量为5 10v/v%。较优的，步骤3)所述补料培养的条件为补料培养过程中控制溶氧40 80%，PH6. 8 7. 2，搅拌转速40 90转/分钟，培养温度32 38°C，根据葡萄糖的消耗来进行补料，使葡萄糖浓度维持在O. 5 I. 5g/L。更优的，步骤3)所述补料培养的条件为补料培养过程中控制溶氧40 80%，PH6. 8 7. 2，搅拌转速40 90转/分钟，培养温度37°C，根据葡萄糖的消耗来进行补料，使葡萄糖浓度维持在I. Og/L。较优的，步骤3)反应器培养得到的所述细胞原液的细胞密度为I 2X IO7ceIls/ml ο步骤4)所述重组人凝血八因子产品的制备所采用的离心、过滤、纯化处理为常规的蛋白分离纯化步骤，获得的较高纯度的FVIII中VWF既可除去也可仍旧保留。本发明步骤2)表达细胞的扩种培养及步骤3)细胞反应器培养均可采用现有的常规无血清细胞培养液进行细胞培养。本发明克服了现有技术中为了得到稳定的凝血八因子必须要在同一个细胞株中共表达八因子和VWF的难点。本发明提出了一种有效的细胞培养途径，通过将FVIII和VWF的含量控制在一定的优化范围内，使FVIII的表达被大量累积，并且本发明的制备工艺表达细胞构建难度小，特别适合工业化生产重组人凝血八因子。本发明的效果包括1)本发明的生产方法采用的是单独表达八因子细胞株，不需 要八因子与VWF共转染细胞株，前期的细胞株构建和筛选过程简单；2)细胞培养过程添加了 VWF因子，提高了八因子的累积和稳定；3)适合工业化生产，可非常简单地提高八因子表达量，也容易放大。
图I :重组八因子的大规模反应器培养工艺流程图2 :凝血八因子活性检测的标准曲线图
具体实施例方式下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook. J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。实施例一I.实验方法I)将驯化为无血清培养的八因子表达细胞(八因子表达细胞的构建参考文献“凝血因子FVIII在哺乳动物细胞中的表达研究”，王琪等，药物生物技术，2002, 9(5)25Γ255 ；细胞株无血清驯化方法可参照细胞培养手册，如invitrogen公司产品手册附录中细胞培养操作部分)，以9X105cells/ml接种三角摇瓶，培养温度32°C，摇瓶转速为60转/分钟；无血清培养约3天后细胞密度达到2X106cellS/ml，以1:2的比例传代，摇瓶培养，培养温度38°C，转速60转/分钟，至细胞密度达到I 2X106cells/ml。无血清细胞培养液为商业化SIGMA公司产品SFMII302培养液。2)用含有不同活性重组VWF (重组VWF蛋白的制备参考文献Recombinant vonWillebrand factor:Potential Therapeutic Use, BernhardE. Fischer, Journal ofThrombosis and Thrombolysis, Volume8, Number3 (1999)，197-205)的培养液换液培养表达八因子的细胞(检测VWF活性的试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司)，培养24小时后，收集细胞培养液进行八因子活性分析(见表I)。本实施例所采用的无血清细胞培养液为商业化SIGMA公司产品SFMII302培养液。3)八因子活性分析方法
采用人凝血因子VIII测定法(一期法)，可参加中国药典三部附录XN人凝血因子VIII测定法，具体步骤如下A.试剂(I) 3. 8%枸橼酸钠取枸橼酸钠9. 5g，加水溶解并稀释至250ml。⑵咪唑缓冲液(ρΗ7· 3):取咪唑O. 68g和氯化钠I. 17g，加水使溶解成100ml，加入
O.lmol/L盐酸溶液42. 2ml，再加水稀释至200ml，即得。
⑶稀释液取一体积的3. 8%的枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%。⑷激活的部分凝血活酶(APTT)试剂。(5)人凝血因子VIII缺乏血浆为人凝血因子VIII含量低于1%的人血浆或人工基质血浆。(6) O. 05mol/L氯化钙溶液取氯化钙(CaCl2 · 2H20) 147g，加水溶解并稀释至1000ml，配制成lmol/L的氯化钙贮存液，用前用水稀释20倍，配制成O. 05mol/L氯化钙溶液。B.人凝血因子VIII标准液的制备用人凝血因子VIII缺乏血浆将标准品(人凝血因子VIII标准品，购自法国Stago公司)稀释成每Iml含IIU凝血因子VIII，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰浴待用。C.待测样品溶液的制备用人凝血因子VDI缺乏血浆将待检测样品稀释成每Iml含IIU凝血因子珊，再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释，置冰浴待用。D.样品的检测⑴取激活的部分凝血活酶试剂O. 1ml，置37°C水浴保温一定时间(一般4min)，加入凝血因子VDI缺乏血浆O. 1ml、不同稀释度的人凝血因子VDI标准溶液O. 1ml，混匀，置37°C水浴保温一定时间(一般5min),加已预热至37°C O. 05mol/L氯化I丐溶液O. Iml,记录凝固时间。将标准溶液人凝血因子珊效价(IU/ml)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数进行直线回归处理，求出直线回归方程，回归的线性曲线如图2所示。⑵取激活的部分凝血活酶试剂O. 1ml，置37°C水浴保温一定时间(一般4min)，加入凝血因子VDI缺乏血浆O. 1ml、待测样品溶液O. 1ml，混匀，置37°C水浴保温一定时间(一般5min),加已预热至37°C O. 05mol/L氯化I丐溶液O. Iml,记录凝固时间。⑶计算待测样品溶液人凝血因子珊效价，再乘以稀释倍数，即为待测样品人凝血因子VDI效价(IU/ml)。表I不同添加量的VWF对八因子活性的影响
权利要求
1.一种高效表达重组人凝血八因子的方法，为将外源的血管性血友病因子添加到表达重组人凝血八因子的细胞培养液中，并在培养过程中控制细胞培养液中血管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为I 10:1。
2.如权利要求I所述的培养方法，其特征在于，所述表达重组人凝血八因子的细胞培养液为无血清细胞培养液。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，具体步骤如下 1)表达细胞的准备表达人凝血八因子的细胞株的构建或者表达人凝血八因子的冻存细胞的复苏； 2)表达细胞的扩种培养将步骤I)构建或复苏的人凝血八因子表达细胞接种到无血清培养基中，振荡培养3 4天，至细胞密度达到I 2 X 106cells/ml，细胞传代，振荡培养扩增至细胞密度达到I 2X106cells/ml，获得种子液； 3)细胞反应器培养将步骤2)获得的种子液接种到细胞反应器的无血清培养基中，培养4 7天，使细胞液的细胞密度达到I 5X 106cells/ml ;然后向细胞液中加入外源WF并对细胞液进行补料培养，获得细胞原液；所述补料培养过程中，控制细胞液中VWF活性与FVIII活性比为I 10:1 ; 4)凝血八因子产品的制备对细胞原液进行离心、过滤、纯化处理，获得重组人凝血八因子产品。
4.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤2)中构建或复苏的人凝血八因子表达细胞以I 9X105cellS/ml的接种量进行接种。
5.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤2)中所述细胞传代是以1:2 4的传代比例传代。
6.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤2)中振荡培养的条件为转速60 150转/分钟，培养温度32 38°C。
7.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤3)种子液接种到细胞反应器的接种量为5 10v/v%。
8.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤3)所述补料培养的条件为补料培养过程中控制溶氧40 80%，pH6. 8 7. 2，搅拌转速40 90转/分钟，培养温度32 38°C，根据葡萄糖的消耗来进行补料，使葡萄糖浓度维持在O. 5 I. 5g/L。
9.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤3)反应器培养得到的所述细胞原液的细胞密度为I 2X107cells/ml。
10.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤3)在培养过程中控制细胞培养液中血管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为2 3:1。
全文摘要
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种利用哺乳动物细胞培养高效表达重组人凝血八因子的工艺方法，具体为将外源的血管性血友病因子添加到表达重组人凝血八因子的细胞培养液中，并在培养过程中控制细胞培养液中血管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为1～10:1。本发明利用重组人凝血八因子表达过程中必须要VWF分子伴侣，稳定新生成的人凝血八因子，提高人凝血八因子的累积效果，降低了技术难度，提高了目标蛋白的表达效果。
文档编号C12P21/02GK102776260SQ20121026209
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月26日 优先权日2012年7月26日
发明者李军辉, 杨松峰, 许必雄 申请人:上海泰龙生物医药科技有限公司