专利名称：一株可合成苦参碱的苦豆子内生真菌及其应用和其发酵液的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株可合成苦参碱的苦豆子内生真菌及其应用和其发酵液的应用。
背景技术：
苦豆子(Sophora alopecuroides L)是豆科槐属多年生草本植物,广泛分布于我国宁夏、甘肃、内蒙古、新疆等西部省区的荒漠、半荒漠草地。苦豆子全草、根、种子可入药，用于抗肿瘤、抗病毒、抗菌消炎、清热解毒、消肿止痛、止痢、杀虫等，其有效成分主要为苦参碱等喹诺里西啶类生物碱，具有重要的医疗和研究价值。苦豆子抗寒耐旱耐盐碱、固氮作用强，是西北地区防风固沙、维持西部草原生态平衡的重要沙生植物。但近年来，随着临床医疗对苦豆子生物碱需求的不断增加，人为的滥采滥挖致使野生苦豆子储量急剧下降，大批·草场退化，水土流失，严重威胁着苦豆子植物资源的可持续开发和利用以及西部草地的生态平衡。目前，人们主要对苦豆子内生细菌、内生放线菌进行了研究，但苦豆子内生真菌的研究较少。王兰等(2007)对苦豆子内生真菌进行研究，分离出I株对小麦赤霉等6种病原菌具有不同程度抑制作用的内生真菌，与苦豆子生物碱的作用相近；顾沛雯等从苦豆子中分离到214株内生真菌，167株具有抑菌活性。但苦豆子中合成喹诺里西啶类生物碱内生真菌的研究还未见报道。产生喹诺里西啶生物碱的苦豆子内生真菌的开发，将是解决苦豆子植物资源日益匮乏的有效途径，具有重要的研究价值和广阔应用前景。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株可合成苦参碱的苦豆子内生真菌，利用苦豆子内生真菌能够通过微生物发酵合成苦参碱等苦豆子的主要有效成分；本发明的目的之二是提供一种上述苦豆子内生真菌的应用，其能够用于合成苦参碱；本发明的目的之三是提供一种上述苦豆子内生真菌发酵液的应用，该发酵液对金色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌具有不同程度的抑菌作用。—株可合成苦参碱的苦豆子内生真菌,是苦豆子内生真菌枝顶孢属(Acremoniumsp.)SA_NX E3 CCTCC NO. M 2012213。—株用于直接利用真菌发酵产生苦参碱的苦豆子内生真菌枝顶孢属(Acremoniumsp.)SA_NX E3 CCTCC NO. M 2012213。—株其发酵液用于抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌的苦豆子内生真菌枝顶孢属(Acremonium sp.) SA_NX E3 CCTCC N0.M2012213。本发明的苦豆子内生真菌，可以通过微生物发酵合成苦参碱等苦豆子主要有效成分，从而开发新的微生物资源，为野生苦豆子植物资源的保护和利用提供了依据。并且本发明的苦豆子内生真菌可直接利用真菌发酵产生苦参碱，与植物栽培产生苦参碱相比，具有效率高，周期短，不受季节、气候、地理条件等因素的限制，经过试验证明，可通过实验室或工业发酵来生产苦参碱。
附图I为本发明菌株SA_NX E3提取物中保留时间为25. 597min的色谱峰的离子碎片质谱图；附图2为菌株SA_NX E3的菌落图；附图3为本发明菌株SA_NX E3的显微形态；附图4为本发明菌株SA_NX E3的NJ系统发育树。
具体实施方式
·本发明提供了一株苦豆子内生真菌枝顶孢属(Acremonium sp.) SA_NXE3 CCTCCNO. M 2012213(以下简称“菌株SA_NX E3”)，该菌株保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. M2012213,保藏日期为2012年6月10日，经真菌分类学鉴定为枝顶孢属(Acremonium sp.)。该菌可产生具有多种药理活性作用的喹诺里西啶生物碱一苦参碱，其发酵液对金色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌具有不同程度的抑菌作用。一、菌株SA_NX E3的分离和筛选(I)样品准备采集宁夏平罗县新鲜无病害的结荚期全株苦豆子植物，放入冰盒中，于12h内进行内生真菌分离。用自来水冲去植物表面泥土,用剪刀将叶、茎、种子、根分离，分别放入灭菌的玻璃平皿中进行表面消毒。(2)植物样品表面消毒先用体积分数为75%的酒精漂洗20 30s，用灭菌去离子水漂洗3 5次；再用有效氯质量分数为I %的次氯酸钠溶液漂洗2 3min，用灭菌去离子水漂洗3 5次。(3)真菌的分离分别将表面消毒后的叶、茎、种子、根用灭菌剪刀剪成3 5_2大小的组织块，放置在真菌分离培养基表面并轻轻按压，然后置20°C培养箱中培养3 30d。待组织块周围长出菌落后，挑取每个菌落边缘菌丝分别接种于PDA培养基表面，置20°C培养箱中继续培养，若挑取的菌落在新的PDA表面生长出现不同的菌落，则分别挑取各菌落接种于新的PDA培养基表面进一步培养，待培养基表面仅长出一种菌落时，可确定该菌株已被纯化，进而得到纯化的菌株并一一编号。苦豆子茎的组织块经培养后，长出白色的绒毛状菌丝，挑取该菌丝接种至新的PDA培养基表面继续培养，得到单一的菌落，即为纯化的SA_NX E3 菌株。所述的真菌分离培养基、PDA培养基的组分及配比分别为真菌分离培养基葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母粉2g，MgSO4. 7H200. 5g，K2HPO4 lg，琼脂15g,蒸懼水IOOOmL, pH为6 7,121 °C高压灭菌20min。PDA培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水lOOOmL，pH为6 7，121 °C高压灭菌20min。(4)真菌富集培养将纯化的SA_NX E3菌株接种于PCA培养基斜面，置20°C培养箱中培养5 15d。然后将灭菌去离子水加入培养基斜面，振荡或吹打后吸取该液体，均匀涂布于富集培养基表面，置20°C培养箱中培养15d。所述PCA培养基的组分及配比为马铃薯20g，胡萝卜20g，琼脂15g，蒸馏水IOOOmL, pH 为 6 7，121 °C高压灭菌 20min。所述的富集培养基的组分及配比为葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母粉2g，MgS04. 7H200. 5g, KCl 0. 5g, FeSO4. 7H20 0. Olg, K2HPO4 lg,蒸馏水 IOOOmL,琼脂 13g, pH 为 6 6. 5，121°C高压灭菌20min。(5)合成苦参碱真菌的筛选收集经富集培养的SA_NX E3菌株菌丝3 5g，用液氮冷冻菌丝并研磨成粉末，置60°C水浴30min烘干。分别用干净滤纸包裹真菌粉末，置索氏提取器中甲醇50ml提取24h。将提取液浓缩挥干甲醇，用IOml体积分数为3%乙酸溶解，3000r/min离心，取上清液加入装有5cm的Dowex 50WX8阳离子交换树脂的玻璃梓中，动杰交换lh。先用去离子水洗脱树脂柱，然后用lmol/L的氨水溶液洗脱树脂柱，将氨水洗脱液浓缩挥干，残渣用吡啶溶解，经微孔滤膜过滤后，定容至5ml，用于气相色谱质谱联用分析。·分析条件为Agilent HPSMS (190915-433)石英毛细管柱(30mX0. 25mmX0. 25 y m)，载气为氦气，流速 lmL/min。柱温为100°C 保持 Imin ；100 2000C, 5 0C /min,200 270°C，20°C /min ;270°C保持 lOmin。进样口温度 250°C，进样量I U L，分流比50 I ;质谱离子源温度230°C，扫描范围30 550，EI电压为70eV。经色谱分离后，对各色谱峰进行质谱检索，检测真菌样品中是否含有苦参碱等生物活性物质。经测定，菌株SA_NXE3提取物经气相色谱分离后，保留时间为25. 597min的色谱峰的离子碎片质谱图与质谱数据库中苦参碱的离子碎片质谱图吻合(参见附图1)，最后确定菌株SA_NX E3能够合成苦参碱。二、菌株SA_NX E3的分类鉴定(I)菌株SA_NX E3的形态特征SA_NX E3菌株的菌落呈白色(参见附图2)，绒状，中央凸起，气生菌丝较发达，生长较快，生长速度为I. 5cm/d。在PDA、PCA培养基上培养均能产生分生孢子及分生孢子梗等结构。菌丝较细，具横隔；分生孢子及分生孢子梗无色，分生孢子梗不分枝。分生孢子顶生或侧生，或单生或聚集成团，呈椭球状或梭形，分生孢子大小为1.5 3.5Xl 1.5iim(S见附图3)。(2)菌株SA_NX E3的分子生物学鉴定米用引物ORl和ITS5扩增内部转录区间序列(internal transcribed sequence,ITS)，采用引物NSl和NS2扩增核糖体小亚基编码序列。PCR反应体系为DNA聚合酶2. 5U，10XPCR Buffer 5 u L, MgCl2 3 u L, dNTP 4 U L，引物各 2 y L，模板 DNA 0.5iiL，加双蒸水M 50 u L ;反应条件为94°C预变性5min ;94°C变性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸lmin, 30个循环；最后72°C延长IOmin使其完全反应。将扩增的片段凝胶回收后，送上海英骏生物技术公司测序。核苷酸序列测定结果显示，菌株SA_NX E3的ITS-5. 8S rDNA序列和SSU rDNA序列长度分别为576bp和498bp，其GenBank登录号分别为JX021663和JX040871。菌株SA_NX E3的ITS-5. 8S rDNA的核苷酸序列为序列表中序列I所示，菌株SA_NX E3的SSU rDNA核苷酸序列为序列表中序列2所示。登录http//:www. ncbi. nlm. nih. gov,分别应用 BLAST 程序将测定的 ITS 和 SSUrDNA序列与GenBank中的ITS和SSU rDNA序列进行同源性比较，选取同源性较高的菌株序列构建系统发育树。采用邻接法(neighbor-j0ining，NJ)构建系统发育树。BLAST比对结果显不，菌株 SA_NX E3 的 ITS-5. 8SrDNA 序列与 Acremonium sp. CB90 (HM989951)、Acremoniumsp.YT03(EF577237)、Acremonium sp.XSD-85(EU326199)、Acremonium sp.B26(HQ696028)等枝顶孢属真菌的序列同源性高达98%。菌株SA_NX E3的SSU rDNA序列与AcremoniumguiIlematii CBS 756. 69(HQ232186)、Acremonium guiIlematii CBS 766.69(HQ232194)等枝顶孢属真菌的序列同源性高达99%。NJ系统发育树(附图4)表明，SA_NX E3菌株与 Acremonium sp. CB90 (HM989951) > Acremonium sp. YT03 (EF577237) > Acremoniumsp. XSD-85 (EU326199)、Acremonium sp. B26 (HQ696028)等枝顶抱属真菌的遗传距离最近。根据SA_NX E3菌株的形态特点、ITS-5. 8S rDNA和SSU rDNA序列信息及其系统发育分析结果，确定SA_NX E3菌株为枝顶孢属真菌(Acremonium sp.)。三、菌株SA_NX E3抑菌活性的检测(I)菌株SA_NX E3的发酵培养·
挑取PCA平板上培养I周的SA_NX E3菌株的菌落，放入15ml已灭菌的具塞离心管中。在离心管中加入10 15粒玻璃珠和IOml灭菌去离子水，置涡旋器上振荡I 2min，分散真菌孢子，并在显微镜下记录每毫升液体中孢子的数量。吸取该孢子悬液5ml加入新的灭菌试管中，在试管中加入适量的灭菌去离子水，轻轻振荡混匀，使真菌孢子的浓度为I X IO6 I X IO6个/ml。取Iml真菌孢子悬液加入到装有IOOml发酵培养基的250ml三角瓶中，置25°C振荡器中，150r/min振荡培养5d。所述的发酵培养基的组分及配比为葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母粉2g，MgS04. 7H200.5g，KCl 0. 5g, FeSO4. 7H20 0. Olg, K2HPO4 lg，蒸馏水 lOOOmL，pH 为 6 7，121 °C高压灭菌20mino(2)发酵液的处理待培养结束后，用滤纸将发酵液过滤，滤液用旋转蒸发仪80°C减压浓缩。浓缩残渣用20ml去离子水振荡溶解，然后3000r/min离心lOmin，取上清液。用孔径为0. 22 y m的微孔滤膜过滤除菌，制成待检液。(3)发酵液抑菌试验分别用玻璃涂布器将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌菌悬液涂布于铺有牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿上，在每个培养皿中放置3个牛津杯，并轻轻按压。在每个牛津杯中加入150 u I的SA_NX E3菌株真菌发酵液待检液，置4°C冰箱内预扩散2h，然后将各培养皿放置于37°C培养箱中培养24h，记录各培养皿中抑菌圈的大小。培养24h后，在涂布有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌的培养皿上均出现抑菌圈，其中发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用较强，抑菌圈的直径为31 ±3mm，对大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径分别为22 ± 3mm和25 ± 2mm。结果表明SA_NX E3菌株的发酵液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等病原菌具有不同程度的抑制作用。
权利要求
1.一株可合成苦參碱的苦豆子内生真菌，是苦豆子内生真菌枝顶孢属(Acremoniumsp. ) SA_NX E3 CCTCC NO. M 2012213。
2.一株用于直接利用真菌发酵产生苦參碱的苦豆子内生真菌枝顶孢属(Acremoniumsp. ) SA_NX E3 CCTCC NO. M 2012213。
3.一株其发酵液用于抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌的苦豆子内生真菌枝顶孢属(Acremonium sp. ) SA_NX E3 CCTCC NO. M 2012213。
全文摘要
本发明涉及一株可合成苦参碱的苦豆子内生真菌及其应用和其发酵液的应用,是苦豆子内生真菌枝顶孢属(Acremoniumsp.)SA_NXE3CCTCCNO.M2012213。本发明的苦豆子内生真菌，可以通过微生物发酵合成苦参碱等苦豆子主要有效成分，从而开发新的微生物资源，为野生苦豆子植物资源的保护和利用提供了依据。并且本发明的苦豆子内生真菌可直接利用真菌发酵产生苦参碱，与植物栽培产生苦参碱相比，具有效率高，周期短，不受季节、气候、地理条件等因素的限制，经过试验证明，可通过实验室或工业发酵来生产苦参碱。
文档编号C12R1/645GK102787077SQ20121026184
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月26日 优先权日2012年7月26日
发明者余永涛 申请人:宁夏大学