专利名称：黄瓜嫩果白色果皮基因w连锁的SSR标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术辅助育种，特别是黄瓜嫩果白色果皮基因w连锁的SSR标记及其在黄瓜种资选择中的应用。
背景技术：
黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界十大蔬菜之一，因其风味清香、ロ感脆爽,深受各国消费者的喜爱。随着消费水平的提高，人们对黄瓜品质的重视程度与日俱增。品质育种也已成为黄瓜育种的重点之一。黄瓜果实品质包括外观品质和内在品质。通常说的品质性状主要指商品性即外观品质，包括瓜色、瓜长、果刺、果瘤、果色均匀度、光泽度等。嫩果果皮顔色作为重要的商品性状，对商品销售影响很大。研究黄瓜嫩果果皮顔色的遗传规律及分子标记具有重要的现实意义。有关控制黄瓜嫩果果皮顔色的基因，已报道有w (白色果皮)、DG (深緑色果皮)、 dg (绿色果皮)、黄緑色果皮(yg)、D (暗色果皮)(Pierce and ffehner, 1990;Wehner andStaub, 1997;顾兴芳等，2005)。前人对于嫩果果皮顔色的遗传规律进行了多项研究。Cochran (1938)报道嫩果果皮白色(w)隐性于绿色。Youngner (1952)认为嫩果黄绿色果皮性状由yg控制，yg对控制果皮呈深緑色的基因表现为隐性，对控制果皮顔色呈浅绿色的基因表现为上位性。孙晓丹等(2011)研究表明，控制嫩果白色果皮的基因(w)对控制嫩果果皮緑色的基因(yg)为隐性，且w与其它修饰基因存在互作，互作类型为隐性上位。孙晓丹等(2011)同时还研究了 w与其它性状之间的遗传关系,发现yg,w, Tu (果瘤)及Se (shapeof fruit end，暂命名)之间的遗传关系为独立遗传。对于黄瓜果皮颜色分子水平的研究不多，李亚利(2008)以WD3XB-2-2构建了F2群体，采用BSA法结合SRAP分子标记技木，找到黄瓜果皮緑色性状相关的分子标记ME9EM1-309和ME8EM14-425，遗传距离分别为6cM和8. 3cM。也有研究者用AFLP分子标记研究黄瓜嫩果白色果皮颜色遗传规律，找到了与w连锁的2个AFLP标记，E43M61和E34M59，遗传距离分别为5. 2cM和5. 6cM (孙晓丹，2011)。本试验以嫩果绿色果皮自交系04796 (Pl)和嫩果白色果皮自交系白叶三(P2)为亲本构建F2和回交群体，通过对6世代群体的表型鉴定，对黄瓜嫩果果皮白色基因w进行了遗传规律分析。以F2群体为作图群体，利用BSA法和SSR技木，实现w基因的染色体定位，并获得紧密连锁标记。本试验不仅为黄瓜嫩果果皮白色基因w的精细定位和分子克隆奠定基础，同时也为利用分子标记辅助选育白色果皮黄瓜新品种提供理论依据。
发明内容
本发明基于上述领域的空白，提供了与嫩果白色果皮基因w连锁的SSR标记，并提供了其在选择有白色果皮黄瓜种质资源上的应用，为黄瓜嫩果白色果皮基因w的精细定位和分子克隆奠定基础，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行白色果皮的筛选，具有高效、限制少、准确的优点，为利用分子标记辅助选育黄瓜白色果皮品种提供实用、高效的途径。黄瓜嫩果白色果皮w紧密连锁的SSR标记，序列如下SSR06791-F/SSR06791-R:TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGG/TGGTGTTTGGTTGTCCTGAG其扩增的特征条带如Seq ID No. I所示(219bp)和Seq ID No. 2所示(243bp)；与果实嫩果绿色果皮W连锁的片段如SEQ ID No. I所示(219bp)TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGGTTAGTTATTCTTCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTACCTTTACCTTTATACTTCATCTTTGGTTTAAAAAGTATCCATTGCAATATTATTCTTACCGTTCATAAGTATTTGTAAACTACCATTTGGAGTAGAACTCAGGACAACCAAACACCA与果实嫩果白色果皮w连锁的片段如SEQ ID No. 2所示(243bp) TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGGTTAGTTATTCTTCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTACCTTTACCTTTATACTTCATCTTTGGTTTAAAAAGTATCCATTGCAATATTATTCTTACCGTTCATAAGTATTTGTAAACTACCATTTGGAGTAGAACTCAGGACAACCAAACACCA上述SSR标记在筛选具有嫩果白色果皮基因w的黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下(I)采用上述SSR标记为引物对待选黄瓜品种的基因组DNA分别进行PCR扩增，(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；(3)从检测结果中筛选扩增出如SEQ ID No. 2所示的片段的材料。所述PCR反应体系为7. 5ng DNA，正向和反向引物各50ng，5 μ L Go Taq GreenMasterMix,加双蒸水至IOul。所述PCR扩增程序为94V预变性4分钟；94V变性15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒，35个循环；72°C保温5分钟，16°C保存。所述凝胶电泳检测指采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于160V恒功率电泳分离，最后银染显色。本试验以黄瓜嫩果果皮绿色自交系04796 (Pl)和嫩果果皮白色自交系白叶三(P2)为亲本构建F2和回交群体，通过对6世代群体的表型鉴定，对嫩果果皮白色基因w进行了遗传规律分析。再以F2群体为作图群体，利用BSA法筛选到与w连锁的标记SSR06791，与w的遗传距离为8. 6cM。通过用用不同遗传背景的其它30份材料验证，标记的准确率达80%。本试验不仅为黄瓜嫩果果皮白色基因w的精细定位和分子克隆奠定基础，同时也为利用分子标记辅助选育白色果皮黄瓜新品种提供理论依据。
图I.是SSR标记SSR06791对黄瓜亲本材料04796，白叶三，Fl世代单株及F2群体随机单株的检测结果；其中=P1:04796 (果皮绿色)；P2:白叶三(果皮白色)。
具体实施例方式材料与方法
本研究所用的试验材料为‘04796’(P1X‘白叶三’ (P2)0‘04796’是由优良杂交种津优I号多代自交定向选育而成的高代自交系，果皮深緑色，刺瘤密，刺白色，果瘤小。现有已知品种，在顾兴芳等在《中国蔬菜》2008年第6期发表的文章《耐热黄瓜新品种中农106号的选育》一文中也有记载，本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。‘白叶三’是国内优良地方品种白叶三中筛选出的纯系，果皮白色，刺瘤稀少，刺白色，果瘤较大。现有已知品种，在张占军在《甘肃农业科技》2008年第12期发表的文章《9个白皮黄瓜品种在陇东的引种对比试验結果》一文中也有记载，本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。SSR引物来自国际黄瓜基因组计划(CUGI)，共2112对(Ren et al.，2009)。详细结果可以參见Ren等在PloS One 2009年第4期在线发表的文章《An Integrated Genetic and Cytogenetic map of the cucumber Genome》。PCR 买验使用 Shang hai Promega 公 ロJ的GoTaq Green Master Mix ;凝胶电泳使用盈信阳光公司的40%非变性聚丙烯酰胺,将其稀释至6%后使用。实施例I.黄瓜果果皮白色基因w连锁SSR标记的筛选步骤I.黄瓜果皮颜色性状鉴定试验于2008-2009年在中国农业科学院蔬菜花卉研究所实验基地进行，以04796(P1)和白叶三(P2)为父母本进行正反交、自交、回交，获得F1、F2及BC1P1、BC1P2群体。2009年春季在中国农业科学院蔬菜花卉研究所实验大棚中种植P1J2和F1,F/各10株，F2189株，BC1PJS株，BC1P2SO株。株距25cm，行距55cm，按常规田间管理。在开花结果期，调查六世代群体各单株上商品瓜(开花后7 10d)的果皮顔色。在种植的六世代群体中，调查果皮颜色的性状表现，计算分离比，使用MicrosoftExcel2003软件进行数据统计分析，使用SAS8. O对结果进行卡方测验。结果显示无论正反交后代F1果皮均表现为绿色；在F2群体中，緑色果皮与白色果皮植株的分离比例经卡方测验符合3:1以04796为回交亲本的回交群体全部表现为果皮緑色，而与另一亲本白叶三回交获得的回交群体中，果皮緑色与果皮白色的比例为1:1。由此可知，嫩果果皮白色性状是由I对核基因控制的，并将该基因命名为w，果皮緑色(W)对果皮白色(w)为显性。步骤2. DNA提取和SSR分析取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及群体各单株的基因组DNA。PCR反应体系为:总反应体系IOyL, 3μ L DNA (2. 5ng · μ L_l)，正向和反向引物(50ng · μ L-1)各 I μ L, 5 μ L Go Taq Green Master Mix (Promega 公司产品)。引物使用黄瓜全基因测序开发的SSR引物(Ren et al. , 2009 ; Cavagnaro et al.,2010)。PCR扩增程序为94°C预变性4min ;94°C变性15s，55°C退火15s，72°C延伸30s，35个循环；72°C保温5min, 16°C forever。扩增产物用6. 0%非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为
0.5 X TBE, 150V恒功率电泳分离I. 5h，电泳后银染显色，统计带型。步骤3. SSR标记筛选、数据统计及连锁图构建主要包括4步(1)筛选在父母本间表现多态的SSR标记；(2)在F2群体中选取果皮緑色、果皮白色单株的DNA各7个，根据BSA法构建果皮緑色，白色2个近等基因池，用池筛选多态性引物；(3)利用获得的多态性引物分析F2群体各单株基因型；(4)利用JoinMap4. O软件进行连锁图的绘制。共显性标记的统计方法与母本(04796)—致的带型记为a，与父本(白叶三)一致的带型记为b，杂合的带型记为h。显性标记的统计方法若母本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为d，和父本带型一致的记为b ;若父本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为a，和父本带型一致的记为C，未扩增出的或模糊不清的记为U。结果显示用2112对SSR引物对P1 (04796)和P2(白叶三)进行筛选，其中在两个亲本间表 现多态的引物有211对，多态率10%。结合BSA法建池，进ー步筛选得到了 16个SSR多态性标记。利用筛选出的多态性标记对04796 X白叶三组合的F2群体进行分析，结合调查性状数据利用Joinmap4. O构建连锁图。结果14个标记和w被定位在同一连锁群上(LOD=IO),得到与w连锁的标记SSR06791，遗传距离为8.6cM。将本试验得到的连锁图与已发表的黄瓜遗传图谱(Ren et al. ,2009 ；Miao et al，2011)比较，发现本连锁群与第3染色体上共有12个共有标记，据此将w基因定位在第3染色体上。步骤4.标记SSR06791PCR扩增的差异条带的回收纯化及测序(I)目的片段的回收采用煮沸法。具体操作为先从胶上将标记SSR06791PCR扩增的差异条带2条挖下来装入I. 5mL的Eppendorf管内，向管内加入100 μ L超纯水,加水量视胶带颜色深浅而定；常温下浸泡24h，转入95°C水浴锅(或PCR仪)中煮30min后，5000rpm离心3min。产物即可取上清3 μ L做模板进行PCR扩增，剰余产物置_20°C保存备用。(2)目的片段的纯化用PCR产物直接纯化方法。在PCR产物中加入2倍体积的无水こ醇，_20°C过夜放置，I, 2000rpm离心5min就可以得到纯化产物。(3)目的片段与载体的连接反应体系为10 μ L PMD18-T Vectorl. OyL ；Ligation buffer I 5· 0 μ L ;目的片段4· 0μし在超净工作台上加样，混匀反应物，暂短离心，16°C连接约lh，过夜也不影响连接效率。(4)连接产物的转化I)取出感受态细胞，SolutionA, SolutionB，置于冰上融化；2)感受态(50 μ L) +5 μ L SolutionA+4 μ L SolutionB+46 μ L 预冷去离子水;3)用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到I. 5mL离心管，每管加入105 μ L，再加入5 μ L的目的DNA，轻旋混匀；4) 42°C水浴热激90s，注意不要晃动离心管；5)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却3 5min ；6)加入500 μ L LB液体培养基。在37°C,150rpm摇床上预培养Ih ；
7)将菌液涂布到含有 100 μ g ^mr1Amp,25 μ g ·ι じ1 IPTG 和 40 μ g mL^X-GAL 的 LB固体培养基上，用一无菌的弯头玻棒轻轻的将菌液均匀涂开，置于室温直至液体被吸收；8)倒置平板，37°C培养12 16h。(5)重组质粒的蓝白斑筛选经37°C培养后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色菌落，其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中，37°C,150rpm过夜培养。(6)菌落PCR的检测吸取I μ L菌液作为模板进行PCR扩增。取4 μ L PCR产物，经I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，与PCR Marker标准分子量相比较检测插入片段的大小，与插入目的片段大小一致的克隆即为阳性克隆。 (7)克隆后载体的测序与分析取3个阳性克隆菌液在甘油(330 μ L甘油中加入1000 μ L菌液)中各保存两份，一份_20°C保藏，ー份送去测序。测序结果如SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示。实施例2. w基因侧翼标记的验证利用30份不同果皮颜色类型的黄瓜材料对实施例I获得的与w基因连锁的侧翼标记SSR06791进行验证，以确定标记用于分子标记辅助选择的准确性这30份材料中有绿色果皮材料28份，白色果皮材料2份。经和所选材料的田间表现型相比，标记在30份材料中共有24份材料的带型反映的表型数据与田间调查结果一致，经计算正确率为80%。其中2份白色果皮材料均扩增出白色果皮特征条帯。本研究中构建了黄瓜嫩果白色果皮基因的SSR连锁图，所获得的SSR标记(SSR06791)与w的遗传距离8. 6cM，这个与黄瓜白色果皮基因连锁的SSR标记为分子标记辅助选择育种筛选黄瓜白色果皮新品种奠定了良好的基础。为建立ー套快速准确鉴定黄瓜嫩果白色果皮的方法提供了理论依据。
权利要求
1.黄瓜嫩果白色果皮基因W连锁的SSR标记，序列如下SSR06791-F/SSR06791-R= TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGG/TGGTGTTTGGTTGTCCTGAG其扩增的特征条带分别如Seq ID No. I、Seq ID No. 2 所示。
2.权利要求I所述的SSR标记在筛选具有嫩果白色果皮基因w的黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下(1)采用上述SSR标记为引物对待选黄瓜品种的基因组DNA分别进行PCR扩增，(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；(3)从检测结果中筛选扩增出如SEQID No. 2所示的片段的材料。
3.根据权利要求2所述的应用，所述PCR反应体系为7.5ng DNA，正向和反向引物各50ng, 5 μ L Go Taq Green Master Mix,加双蒸水至 IOul
4.根据权利要求2所述的应用，所述PCR扩增程序为94°C预变性4分钟；94°C变性15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒，35个循环；72°C保温5分钟，16°C保存。
5.根据权利要求2 4任一所述的应用所述凝胶电泳检测指采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于160V恒功率电泳分离，最后银染显色。
全文摘要
本发明“黄瓜嫩果白色果皮基因w连锁的SSR标记及其应用”，涉及生物技术辅助育种领域。黄瓜嫩果白色果皮w紧密连锁的SSR标记，序列如下SSR06791-F/SSR06791-R:TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGG/TGGTGTTTGGTTGTCCTGAG。其扩增的特征条带如Seq ID No.1所示(219bp)和Seq ID No.2所示(243bp)；采用本发明获得的SSR标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行嫩果白色果皮材料的筛选，具有高效、限制少的优点，为选育白色果皮黄瓜提高了效率，缩短了育种周期。
文档编号C12N15/11GK102827837SQ20121029888
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月21日 优先权日2012年8月21日
发明者顾兴芳, 张圣平, 苗晗, 王烨, 董邵云 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所