一种检测cho培养细胞中支原体污染的试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测CHO培养细胞中支原体污染的试剂盒及其检测方法，属于生物技术检测领域。该试剂盒包括置于同一PCR体系中的特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对与特异性扩增支原体16srRNA保守区域DNA序列的引物对。在PCR检测支原体污染的同时，可同时完成检测结果可靠性的判定。该发明大大提高了CHO培养细胞中支原体污染检测结果的可靠性，且操作简单，检验周期短，具有良好的样品检测的操作性。
【专利说明】一种检测CHO培养细胞中支原体污染的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物技术检测领域中进行支原体检测的试剂盒及其检测方法，具体涉及一种利用PCR技术快速准确鉴定CHO培养细胞中支原体污染的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]自从1956年Robinson LB等首次报道细胞培养中的支原体污染以来，国内外关于支原体污染细胞和疫苗等生物制品的报道屡见不鲜。支原体是微生物中最简单和最小的生命形式，它是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5 μ m之间。支原体由于体积较小，可以穿过CHO细胞培养时用于过滤微生物的常规滤器；而且支原体感染后只产生少量可见的混浊和细胞伤害，导致支原体的感染在几次传代甚至几个月的时间内都不易被觉察；加上支原体对于细胞培养中常规应用的抗生素具有良好的耐受性，使得支原体感染成为细胞培养中普遍存在的、隐蔽的、恶性的污染源。支原体对宿主的生理生长影响严重，CHO细胞一旦受支原体感染后，便出现生理水平远远偏离正常的情况，而CHO细胞又是重组蛋白质药物生产的首要体系，因此对CHO细胞培养体系中支原体污染的快速准确检测显得尤为重要。
[0003]PCR检测方法应用特异性引物扩增支原体基因组序列，具有灵敏、准确的特点，并且检测周期短，4个小时即可以看到检验结果，被越来越广泛的用于检测CHO细胞中的支原体污染，2006年欧洲药典已将PCR作为常规检测方法。尽管PCR检测方法具有如此多的优点，但也有不足之处。由于PCR实验设计、实验操作、实验试剂等方面的问题，容易造成PCR检测结果出现假阳性和假阴性。出现假阳性主要由于多重扩增所致，而出现假阴性的主要原因是反应体系尤其是样品中 存在的物质阻碍了反应的进行，例如蛋白质、高盐或PH条件的不适宜导致反应的终止。由此带来的误判、错判会给实际生产带来巨大的经济损失，因此需要进一步增强PCR支原体污染检测方法的可靠性及准确性。一般的支原体污染的PCR检测方法中多以去核酸水为阴性对照模板，阳性对照模板为支原体基因组DNA，以此来判定检测结果。如下表所示。
【权利要求】
1.一种检测CHO培养细胞中支原体污染的试剂盒，它包括置于同一 PCR体系中的特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对与特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对。
2.如权利要求1所述的试剂盒，所述特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对为:
上游引物 GF:5’ - CAAAGGCACAGTCAAGGCTGA -3’ ；
下游引物 GR:5’ - TGGTGAAGACGCCAGTAGATT -3’。
3.如权利要求1所述的试剂盒，所述特异性扩增支原体16srRNA保守区域DNA序列的引物对为:
上游引物 MF:5’ - ACACCATGGGAGCTGGTAAT -3’ ；
下游引物 MR:5’ - GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT -3’。
4.如权利要求3所述的试剂盒，所述特异性扩增支原体16srRNA保守区域DNA序列的引物对的扩增产物长度为400~500 bp。
5.如权利要求1所述的的试剂盒， 所述PCR体系中特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对与特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对的浓度比为1:2。
6.如权利要求1所述的试剂盒，所述PCR体系中含有PCR反应缓冲液、dNTPs溶液、rTaq聚合酶和超纯水。
7.利用权利要求1~6任一项所述试剂盒检测CHO培养细胞中支原体污染的方法，包括如下步骤: 1)提取待检CHO培养细胞的DNA； 2)以步骤I)中提取的DNA为模板加入PCR体系，进行扩增反应； 3)以去核酸水为模板加入PCR体系，进行扩增反应，作为阴性对照； 4)所有扩增反应结束后，同时进行琼脂糖凝胶电泳； 5)观察琼脂糖凝胶电泳检测图，判定检测结果的方法如下所述: A)当特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对相应的扩增产物出现，阴性对照没有出现扩增产物时，说明PCR体系正常工作，此时的PCR检测结果准确可罪； A-1 )此时，如果没有出现特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对相应的扩增产物，说明CHO培养细胞中没有出现支原体污染； A-1I )此时，如果出现了特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对相应的扩增产物，说明CHO培养细胞中出现了支原体污染； B)如果特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对相应的扩增产物没有出现，说明PCR体系没有正常工作，此时检测结果无效； C)如果阴性对照出现扩增产物，说明PCR体系受到污染，此时检测结果无效。
8.如权利要求7所述的检测方法，步骤I)中所述提取待检CHO培养细胞DNA的方法为:取待检CHO培养细胞液离心沉淀；用PBS缓冲液充分悬浮沉淀物，离心沉淀；弃上清，加入TE缓冲液，再次充分悬浮沉淀物，煮沸；离心沉淀，取上清作为PCR反应模板。
9.如权利要求7所述的检测方法，步骤2)与步骤3)所述扩增反应的反应条件为:94°C预变性5分钟，然后94°C变性30秒，50°C~53°C退火30秒，72°C延伸40秒，35个循环后，72 °C恒温10分钟。
【文档编号】C12Q1/68GK103627781SQ201210303846
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月24日 优先权日:2012年8月24日
【发明者】刘晓志, 周兴军, 董向峰, 常亮, 陈雪静, 刘素霞, 赵伟, 高健, 段宝玲 申请人:华北制药集团新药研究开发有限责任公司