一种AraC突变体蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种AraC突变体蛋白及其应用，具体涉及AraC突变体蛋白在高通量筛选合成四氢嘧啶的菌株中的应用。本发明提供的AraC突变体蛋白为序列表的序列3所示的蛋白质。编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。本方法提供的AraC突变体蛋白能够特异性结合四氢嘧啶并受其诱导开启PBAD启动子表达下游报告基因，建立报告基因表达强度和四氢嘧啶浓度之间的对应关系，从而可以通过荧光强度或者颜色反应来筛选高产四氢嘧啶的菌株。本方法为四氢嘧啶高产菌株的筛选提供一种快速高效的高通量筛选方法，将促进四氢嘧啶工业化应用的发展。
【专利说明】一种AraC突变体蛋白及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种AraC突变体蛋白及其应用，具体涉及AraC突变体蛋白在高通量筛选合成四氢嘧啶的菌株中的应用。
【背景技术】
[0002]四氢嘧啶，中文全称为1，4，5，6-四氢-2-甲基_4_嘧啶羧酸，英文全称为1，4，5，
6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarbo xylic acid; ectoine。结构式见式(I)。
[0003]
【权利要求】
1.序列表的序列3所不的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下I)至3)中任一所述的DNA分子: 1)序列表的序列4所不的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子； 3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体为将权利要求2或3所述基因插入pMAL-p2x载体的多克隆位点得到的重组质粒。
6.—种试剂盒,包括质粒甲和质粒乙； 所述质粒甲为在表达载体的多克隆位点插入序列表的序列4自5’末端第4至879位核苷酸所示DNA分子得到的重组质粒； 所述质粒乙为在表达载体的多克隆位点插入特异DNA片段得到的重组质粒；所述特异DNA片段包括序列表的序列5中自5’末端第329至402位核苷酸所示的Pbad启动子和荧光蛋白的编码基因。
7.如权利要求6 所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括宿主菌；所示宿主菌为敲除大肠杆菌基因组中的araC基因得到的工程菌。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述宿主菌为JW0063-1菌株。
9.权利要求1所述蛋白质、权利要求2或3所述基因、权利要求4或5所述重组表达载体、或权利要求6、7或8所述试剂盒，的应用，为如下(a)或(b)或(c): (a)鉴定四氢嘧啶； (b)检测四氢嘧啶的含量； (c)筛选生产四氢嘧啶的菌株。
10.一种筛选受四氢嘧啶特异诱导的AraC突变体蛋白的方法，包括如下步骤: (1)将AraC突变体文库和辅助质粒共转化宿主菌，得到重组菌； (2)阴性筛选 将步骤(1)得到的重组菌进行IPTG诱导，分选荧光最低的细胞； (3)阳性筛选 将步骤(2)得到的细胞进行四氢嘧啶诱导，用分选荧光最强的细胞； 反复进行所述阴性筛选和所述阳性筛选，直至挑选得到的单克隆在有四氢嘧啶存在的情况下荧光蛋白荧光值比无四氢嘧啶存在时荧光蛋白荧光值高，且差值为2000以上，所述单克隆即为含有所述突变体蛋白的细胞； 所述AraC突变体文库为将序列表的序列2所示野生型araC基因进行突变并将突变得到的DNA分子插入表达载体得到的DNA文库； 所述辅助质粒为在表达载体的多克隆位点插入特异DNA片段得到的重组质粒；所述特异DNA片段包括序列表的序列5中自5’末端第329至402位核苷酸所示的Pbad启动子和荧光蛋白的编码基因； 所述宿主菌为敲除大肠杆菌基因组中的所述野生型araC基因得到的工程菌。
【文档编号】C12R1/19GK103626852SQ201210302998
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月23日 优先权日:2012年8月23日
【发明者】蒋培霞, 唐双焱 申请人:中国科学院微生物研究所