甜瓜杂交种红优指纹图谱的建立的制作方法
【专利摘要】本发明为一种甜瓜杂交种“红优”及其亲本DNA指纹图谱的建立方法和应用。建立方法包括：1)甜瓜DNA的提取及纯化；2)用获得的高纯度甜瓜DNA为模版进行ISSR和SRAP分析；3)选择有代表的多态性扩增带构建供试材料DNA指纹图谱；在该DNA指纹图谱中“红优”甜瓜杂交种及其亲本都有特异的DNA指纹，可以相互区分开来。由于本发明DNA指纹图谱是用图的形式表示，看起来比较直观、易懂；并将其转换成数码表示形式，便于计算机识读和分析。本发明能从遗传本质上对“红优”甜瓜杂交种的种子进行纯度鉴定，结果准确、可靠，检测迅速。
【专利说明】甜瓜杂交种红优指纹图谱的建立
一、【技术领域】:
[0001]本发明涉及甜瓜种子纯度鉴定技术，具体的说是甜瓜的DNA指纹图谱的建立方法和应用。
二、【背景技术】:
[0002]甜瓜(Cucumis melo L.)是葫芦科甜瓜属中的栽培种，为重要的经济作物之一，杂种一代在国内外广泛栽培。但是在人工杂交制种过程中由于去雄不及时或不彻底，常混有母本自交系种子，同时甜瓜品种较为繁杂，且一些品种之间植物形态非常接近，很难鉴别。传统的鉴定方法是通过表型特征判断，耗时耗力，通过同工酶和种子蛋白电泳技术进行鉴别也受环境或发育阶段等方面影响，存在较大的缺点，而分子标记技术检测的是在基因组DNA水平上的差异，不受外界环境的影响，因此结果非常稳定。在已建立的分子标记技术中，ISSR(简单序列重复区间)标记是一种基于微卫星序列发展起来的十分有效的分子标记，具有模版需要量少、无需试剂盒、结果记录方便、试验成本低、操作简单、试验稳定性较高等优点；SRAP (序列相关扩增多态性)是一种新型的基于PCR的标记系统，具有简便、稳定、中等产率、可产生共显性标记及便于克隆测序目标片段等特点，且扩增结果的多态性丰富。
三、
【发明内容】
:
[0003]本发明的目的是提供一种用于甜瓜种子鉴定技术的DNA指纹图谱及其建立方法和应用，以克服现有技术存在的不足。
[0004]本发明的技术构思如下:
[0005]利用DNA指纹图谱鉴定种子是以DNA的多态性为基础的分子标记方法，可以弥补和克服在种子纯度的形态学鉴定及同工酶、种子蛋白电泳鉴定的许多缺陷和难题。本发明利用ISSR和SRAP技术构建了上海等南方地区甜瓜设施栽培品种“红优”与其亲本的DNA指纹图谱，可以为此品种的鉴定和纯度检测提供科学依据，进而保护生产者和使用者的合法权益。
[0006]本发明的甜瓜杂交种“红优”及其亲本的DNA指纹图谱，是由“I”和“0”组成，ISSR引物1-19父本为110011，母本为111010，“红优”为1111111 ；SRAP引物Mel5-Em8父本为111011，母本为110111，“红优”为111111。其中所述数字“I”表示图谱中某个位置上有扩
增带存在，数字“ 0 ”表示在某个位置上没有扩增带存在。
[0007]所说的“红优”甜瓜杂交种是上海是农业科学院园艺研究所公开销售的产品。
[0008]甜瓜DNA指纹图谱的建立方法，包括如下步骤:
[0009]I)提取及纯化甜瓜基因组的DNA ；
[0010]2)用获得的甜瓜DNA为模版进行ISSR和SRAP分析；
[0011]3)选择有代表性的多态性扩增带，根据所选择条带的有、无构建供试材料DNA指纹图谱。
[0012]其中所述“红优”甜瓜杂交种及其亲本都有其特异的DNA指纹，可以相互区分开来。所述的ISSR扩增中采用的引物1-19碱基序列为(TC)7CC;SRAP扩增中采用的引物Mel5-Em8，其碱基序列为 5' TGAGTCCAAACCGGTAC-3'，5' GACTGCGTACGAATTCTG-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。
[0013]本发明的DNA指纹图谱可以应用于“红优”甜瓜种子纯度的鉴定。
[0014]本发明具有如下优点:
[0015]1.本发明创建了“红优”甜瓜杂交种及其亲本的DNA指纹图谱，公开了用DNA指纹分析技术对甜瓜种子鉴定的研究结果，建立的方法能从遗传本质上对甜瓜种子进行鉴定，因此准确、可靠,具有法律效应。
[0016]2.采用本发明，在对“红优”甜瓜种子样品进行真实检测时，用目前广泛应用的快速、微量DNA提取法提取待测样品的DNA，用提取的DNA作为模版，进行ISSR或SRAP分析，
[0017]在几个小时内就可以知道该DNA指纹，因此，能迅速判断出他的真实性。
[0018]3.由于本发明DNA指纹图谱是用图的形式表示，看起来比较直观、易懂；并由于转换成了数码形式，便于计算机识读和分析。
【专利附图】
【附图说明】:
[0019]图1为本发明建立SRAP引物Mel5_Em8的指纹图谱，图2为本发明建立ISSR引物1-19的指纹图谱。其中I为“红优”父本；2为“红优”母本；3为“红优”;M为Mark。
四、【具体实施方式】:
[0020]实施例1
[0021]1 材料
[0022]甜瓜杂交种“红优”及其亲本由上海市农业科学院园艺所提供。
[0023]2 试剂
[0024]试验所用的提取DNA、PCR试剂和琼脂糖均购自上海生工生物工程有限公司。
[0025]3 方法
[0026]3.1DNA的提取及检测。
[0027]DNA采用CTAB微量法提取步骤:
[0028](l)2ml离心管加入离心管盖大小的新鲜叶片I~2片。
[0029](2)加入700ulCTAB缓冲液,用研磨机进行研磨5min。
[0030](3)65。〇水浴111。
[0031](4)置于4°C冰箱或室温冷却至15°C以下。
[0032](5)加入700 ill 24: I氯仿/异戊醇，上下混匀5min，保证样品和氯仿充分混
八
口 o
[0033](6) 13000rpm 离心 lOmin。
[0034](7)取上清液500 iil，加入预先加好500 ill异丙醇的1.5ml离心管中，轻轻上下颠倒混匀。
[0035](8)4°C冰箱静置30min以上。
[0036](9) 13000rpm 离心 IOmin,弃上清液。
[0037](10)吹干DNA，让异丙醇挥发干净。[0038](11)加入 100 U I ddH20 (含 I U 110mg/ml 的 RNase)溶解 DNA。
[0039](12) 37 °C水浴或室温I小时去除RNA。
[0040](13)配置％的琼脂糖凝胶(称取Ig琼脂糖，加入100mlTBE Buffer加热溶解后，冷却到50~60°C )，加入一滴EB(0.g/ml)倒入胶槽中，插入梳子，待胶凝固后检测。取5u I的DNA，加入IiU Lodading Buffer，进行检测，在3个点样孔分别点入4 yl、5 yl、6u I ADNA(45ng/u I)作为对照，进行样品DNA浓度的检测。一般浓度在50~IOOng之间。
[0041]附:CTAB溶液成分:
[0042]100ml IM TRIS pH7.5140ml 5M NaCl
[0043]20ml 0.5M EDTA pH8.0740ml MiliQ H2O
[0044]20g CTAB (65°C水浴溶解)(注意:切忌样品量过多和吸取过量的上清)
[0045]3.2PCR扩增及产物检测
[0046]SRAP 扩增反应采用 20ii L 的反应体系，其中 25mmol/L MgCl22.0 u L, IOXPCRBuffer 2.0ii L，10mmol/L dNTP 0.4u L,5U/u L Taq DNA 聚合酶 0.2 y L，0.liimol/L 弓丨物各3.0 ii L, IOng/ V- L模板DNA 3.0 u L,灭菌双蒸水6.4 ii L。反应程序:94°C预变性5min ；94°C变性 lmin, 35°C退火 lmin, 72°C延伸 1.5min, 5 个循环；94°C变性 lmin, 50°C退火 lmin,72°C延伸1.5min,35个循环；72°C延伸IOmin后4°C保存。
[0047]ISSR扩增反应采用20ii L的反应体系，其中包含25mmol ? [1MgClJ yl，10XPCRBuffer2.0u I, IOmmol ? I^dNTP0.4u 1,5U ? L-1Taq E 0.2u I, IOng ? L-1 模板 DNA 3u I,
0.1iimol ? [1Primerf iil，灭菌双蒸水9.4u 10扩增程序:94 °C预变性5min ;94°C变性lmin, 52°C退火 lmin, 72°C延伸 1.5min, 35 个循环，72°C延伸 IOmin 后 4°C保存。
[0048]PCR扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶(含E B)电泳分离，电压120V，时间约1.5h，GelDoctmEQ 170-8060凝胶成像仪进行观察并拍照分析。
[0049]4引物筛选及扩增结果分析
[0050]用40对SRAP和40个ISSR引物对供试材料进行PCR扩增，其中40对SRAP弓丨物和15个ISSR引物均能得到较为稳定的扩增图谱，但大多数引物的扩增结果在双亲及杂种之间是一致的，不能起到鉴别作用。最终筛选出一对SRAP特异引物Mel5-Em8(图1)和I个ISSR引物1-19(图2)可以把杂交种与其父母本分开。
[0051]5数字指纹的建立
[0052]根据上述扩增结果，以I和0分别代表某个等位基因位点扩增出的DNA条带的有无，按照从上到下即由小片段向大片段的读带方向，将指纹图谱转换为由I和0组成的字符串，即构成数字指纹。ISSR引物1-19父本为110011，母本为111010，“红优”为1111111 ；SRAP引物Mel5-Em8父本为111011，母本为110111，“红优”为111111。其中所述数字“I”表示图谱中某个位置上有扩增带存在，数字“0”表示在某个位置上没有扩增带存在。
[0053]实施例2
[0054]本发明的DNA指纹图谱用于“红优”杂交种纯度的鉴定:从制种基地生产的杂交种随机抽取100粒，进行发芽，用微量CTAB法提取DNA，用提取的DNA作为模版，用引物1_19和Mel5-Em8分别进行ISSR和SRAP扩增，扩增产物在2.5%的琼脂糖上进行电泳分析。如果利用ISSR引物1-19标记分析查出的单株DNA指纹是1111111，即为“红优”真杂交种，DNA指纹是110011或111010，即为“红优”亲本自交种，也就是假杂交种。如果利用SRAP弓丨物Me 15-Em8标记分析查出的单株DNA指纹是111111，即为“红优”真杂交种，DNA指纹是111011或110111，即为“红优”亲本自交种，也就是假杂交种。然后用假杂交种数除以100，即可获得制种基地生产的甜瓜杂交种的纯度，较大田种植调查纯度既省时又便捷，可以为甜瓜杂交种子的销售及时的提供纯度信息。如果鉴定的纯度低于95%，就不能够作为商品种子进行销售，就可能避免假`种子事件的发生。
【权利要求】
1.甜瓜DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)提取及纯化甜瓜基因组的DNA； 2)用获得的甜瓜DNA为模版进行ISSR和SRAP分析； 3)选择有代表性的多态性扩增带，根据所选择条带的有、无构建供试材料DNA指纹图P曰。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，甜瓜杂交种“红优”及其亲本都有其特异的DNA指纹，可以相互区分开来，具体的指纹数据是由“ I ”和“0”组成，ISSR引物1-19父本为110011，母本为111010，“红优”为1111111 ；SRAP引物Mel5-Em8父本为111011，母本为110111，“红优”为111111。其中所述数字“I”表示图谱中某个位置上有扩增带存在，数字“ 0 ”表示在某个位置上没有扩增带存在。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ISSR扩增中采用的1-19碱基序列为(TC)7CC ;SRAP 扩增中采用的引物 Mel5-Em8，其碱基序列为 5' TGAGT CCAAACCGGTAC-3'，5' GACTGCGTACG AATTCTG-3'。
4.权利要求2所述的方法所建立的DNA指纹图谱的应用，其特征在于，用于甜瓜杂交种“红优”种子纯度的鉴定 。
【文档编号】C12Q1/68GK103627780SQ201210300585
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月22日 优先权日:2012年8月22日
【发明者】张永平, 陈幼源, 杨少军, 陈绯翔 申请人:上海市农业科学院, 上海科园种子有限公司