专利名称：二聚和三聚核酸染料以及相关的系统和方法
二聚和三聚核酸染料以及相关的系统和方法本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2006/009910，国际申请日为2006年3月17日，进入中国国家阶段的申请号为200680008515. X、发明名称为“二聚和三聚核酸染料以及相关的系统和方法”的发明专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2005年3月17日Mao等提交的名为“Dimeric and TrimericNucleicAcid Dyes, and Associated Systems and Methods (二聚和三聚核酸染料以及相关系统和 方法)”的美国临时申请号60/663，613的优先权，本申请与2006年3月16日与本文同时提交的待批美国申请号有关，该待批申请也要求美国临时申请号60/663，613的优先权。上述各份临时申请和上述申请全文纳入本文作为参考。对关于合作研究协议双方名称的声明Biotium, Inc. (Hay ward,加利福尼亚(CA))和 AlleLogic Biosciences Corp.(Hay ward,加利福尼亚)是涉及本发明的合作研究协议的双方。序列表和请求书的参考，二者纳为参考上述美国临时申请号60/663，613提交了含本文公开的SEQ ID NO: I到SEQIDNO: 10序列表的原始ASCII软盘和作为该原始软盘副本的另一张ASCII软盘以及该序列表的纸件，该临时申请涉及这些软盘和纸件并将其全文(包括其内容)纳入作为参考。同时提交了该序列表的纸件。据此要求上述美国临时申请号60/663，613已存档的符合规定的(compliant)计算机可读序列表可用于本申请。本申请序列表的纸件或光盘及其内容与上述美国临时申请号60/663，613所提交的序列表计算机可读副本一致。美国临时申请号60/663，613的序列表，同时提交的该序列表纸件和已存档的计算机可读序列表全文(包括其内容)纳入本文作为参考。背景荧光染料已用于检测和分析生物学样品。由于荧光染料灵敏度高，可利用它们来检测非常少量的荧光分子。可利用这种荧光染料检测与细胞相关的不到50个荧光分子。Barak 等，J. Cell Biol. 90，595 (1981)。可用荧光染料作为使活细胞或组织样品成像的探针。例如，利用与网柄菌细胞表面受体结合的荧光染料探针使荧光标记的单分子CAMP成像。Ueda等，Science294,864(2001)。可利用具有不同荧光波长的几种荧光探针在活细胞或组织样品中进行多色成像。与放射性探针相比，荧光探针灵敏度高，毒性较低并易于处理。可用荧光染料检测核酸(包括DNA和RNA)及含核酸的生物学样品。核酸聚合物，例如DNA和RNA参与将遗传信息从一代传递至下一代，以及参与活体的常规机能。因此，核酸令人感兴趣并成为研究目标。能特异性结合核酸并形成具有高度荧光的复合物的荧光核酸是这种研究的有力工具。可利用这些染料检测各种介质，例如纯溶液、细胞提取物、电泳凝胶、微阵列芯片、活的或固定细胞、死细胞和环境样品中是否存在DNA和RNA及其含量。可用这些染料定量检测实时聚合酶链式反应(qPCR)中的DNA，该实时聚合酶链式反应是基因组研究和医学诊断中所用的技术。
聚合酶链式反应(PCR)是一种引物延伸反应，它提供一种在体外扩增特定核酸的方法。在PCR期间，反应溶液短时维持于96°C、60°C和72°C这3种温度中的每一种，以分别进行解链或变性、退火和链延伸。利用能快速加热或冷却含反应混合物的试管的自动化热循环仪重复这种三温度时期30或40轮。通过重复该PCR循环，可在数小时内在一种酶促反应混合物中产生DNA样品的百万倍拷贝，从而使得研究人员能测定靶DNA的大小和序列。该DNA扩增技术已用于克隆和其它分子生物学操作。PCR的其它讨论见Mullis等，MethodsEnzymol. (1987)和 Saiki 等，Science (1985)。可用的一种PCR技术是定量实时PCR(qPCR)。简言之，qPCR的机理是以指数方式对靶DNA进行PCR扩增。通过进行PCR反应同时检测扩增反应期间给定时间点的DNA拷贝总数，能追溯计算起始DNA物质的量。荧光DNA检测通常是qPCR所用的一种灵敏、通用以及方便的检测方法。qPCR中使用两种类型的突光试剂。第一种类型以用一种或多种突光染料，或一种突光染料和一种粹 灭染料的组合标记的寡核苷酸为基础。这些标记的寡核苷酸会在与靶序列杂交后，或杂交接着切割寡核苷酸后，以与存在的DNA量成比例的方式发出荧光。各种专利和出版物描述了寡聚荧光试剂的机理和应用。参见，例如Holland等，Proc. Natl. Acad. Sci USA(1991)；Lee 等，Nucleic Acids Res. (1993);和美国专利号 5，210，015 ;5，538，848 ;6，258，569 ;5，691，146 ;5，925，517 ;5，118，801 ;5，312，728 和 6，635，427。虽然 qPCR 的寡聚荧光试剂的优点在于对靶序列高度特异，但它们的设计非常复杂，因而使用昂贵。qPCR所用的第二种类型的荧光试剂以通常称为荧光核酸染料或染色剂的DNA结合荧光染料为基础。由于荧光核酸染料是较简单的分子，它们易于制备，因此使用廉价。它们在qPCR中的应用是用于研究实验室的常规遗传检测。不是所有常规可用的荧光核酸染色剂都能用于qPCR。为适用于qPCR，理想地，荧光核酸染料应符合某些标准。首先，其在PCR和保存期间应是化学稳定的。由于PCR在高温下进行，所述染料应对热稳定。此外，由于PCR所用的Tris缓冲液的pH可从在低温下(4°C )为碱性(pH 8. 5)，显著变化至在高温下为中性或微酸性，所述染料应能耐受酸或碱辅助的分解作用。其次，当存在于PCR溶液中时，所述染料不应抑制PCR过程。第三，在无DNA存在时，所述染料应没有荧光或荧光极低，有DNA存在时，应变得有高度荧光。第四，所述染料应能吸收或发出与现有仪器相容的波长，所述仪器通常装配了为以下常规荧光染料优化的光通道(optical channel):例如FAM、J0E、VIC(Applied Biosystems,Foster City,加利福尼亚)、TAMRA、R0X、德克萨斯红、Cy3和Cy5。第五，所述染料结合DNA时，序列偏好应低或没有。第六，DNA-染料复合物应具有与存在的DNA含量线性相关的荧光强度。考虑到上述标准，就不奇怪可用于qPCR的核酸结合染料极少。溴化乙锭(EB)是一种DNA染料，已用其证明了 qPCR使用简单染料的可行性。Higuchi等，Bio-Technol10 (4) ,413(1992)。然而，EB的问题是灵敏度低和波长不理想。qPCR广泛使用的染料是Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon (OR))的 SYBR 绿 I。Wittwer 等，Biotechniques22 (I), 130 (1997) ο SYBR绿I是环状取代的不对称花青染料。Zipper等，Nucleic AcidsRes. 32(12)，el03 (2004);和美国专利号 5，436，134 和 5，658，751。SYBR 绿 I 的优点在于它能激发并发出与FAM的波长非常匹配的波长(该波长与大多数仪器相容)，以及在于结合DNA时具有高度的荧光。近年来，qPCR使用了称为LC绿的DNA染料，虽然该染料的结构未公开。虽然LC绿染料看来具有与大多数PCR仪器常规使用的FAM光学通道相匹配的理想波长，但它的灵敏度远低于SYBR绿I。最近，有报道说qPCR使用了称为BEBO的DNA小沟结合剂和称为BOXTO的相关染料,二者均是不对称花青染料。Bengtsson等，Nucleic AcidsRes. 31(8)，e45(2003);和美国专利申请公布号2004/0132046。与LC绿相似，在灵敏度方面，BEBO和BOXTO远逊于SYBR绿I。虽然SYBR绿I广泛用作qPCR的DNA染料，但它仍有几方面的不足。一个不足是SYBR绿I对PCR过程有抑制作用，从而限制了增加染料浓度可达到的最大信号强度。使用SYBR绿I的qPCR的荧光信号强度先与染料浓度成比例，直至染料浓度达到染料开始明显抑制PCR过程之时。进一步增加染料浓度实际上会因DNA扩增减少而降低了信号强度或增加了循环数(Ct)。另一不足是在碱性条件，例如PCR缓冲液在低温保存时的碱性条件下SYBR绿I化学不稳定。有报道说，4°C保存在Tris缓冲液中的SYBR绿I在数天期间明显分解，染料分解产物明显是强效抑制剂。Karsai等，BioTechniques 32 (4)，790 (2002)。还有另一不足是SYBR绿I只提供一种荧光颜色。许多商品化可购得的荧光检测仪器具有多条光学通道(FAM光学通道和其它光学通道)，因而能检测多种荧光颜色。需要开发荧光染料或所述染料的制备或利用。概述(本发明)提供了产生或设计适合于有用应用(例如qPCR过程)的荧光染料的方法。该方法包括通过可弯曲且基本上中性(例如，中性或略带电荷)的桥(bridge)连接两个或三个单体染料。如本文所述，产生或设计染料的方法可开发的荧光核酸染料具有迄今为止未获得的波长和/或其它光谱特性。(本发明)提供了适合于有用领域(例如本文所述的)的荧光染料。按照本文所述方法产生的二聚或三聚染料可形成发夹结构，据信该结构使得所述染料通过本文进一步描述的请求式释放(release-on-demand)机理使核酸着色。本文所述染料可具有以下至少一种特征或所有特征假使有的话，“荧光背景”也较低(无核酸存在下的荧光)，最好没有荧光背景；PCR抑制作用较低，最好没有PCR抑制作用；荧光信号强度较高；和稳定性较高。对于这些特征中的至少一种，或者对于所有这些特征，所述染料优于现有染料，例如SYBR绿I (只是举例)。本文所述染料可具有某种特性，例如波长和/或另一种光谱特性，例如迄今为止未能获得的波长和/或光谱特性。(本发明)提供了能形成分子内二聚体或形成发夹结构的二聚和/或三聚核酸染料或染色剂。据认为，发夹形染料本身可以无荧光或荧光极低，但在有核酸存在下变得有高度荧光。据认为，染料经中间状态与核酸结合，其中部分染料形成开放的随机构象。还认为染料中存在少量的这种开放的随机构象并与发夹状态平衡。据认为，随着核酸含量增加，平衡可从发夹状态向染料的核酸结合状态偏移，因而得到的荧光信号强度基本上与核酸的存在量呈线性比例。上述机理可以称为DNA染色的请求式释放机理，其对于各种应用，例如定量实时PCR(qPCR)是理想的。据信，形成发夹结构可使“有效的染料浓度”低，从而使得本文所述染料对PCR过程的干扰极低，这只是解释。因此，与以前的染料，例如SYBR绿I相比，qPCR可使用较高浓度的本文所述染料。染料浓度较高可能明显增加DNA检测的灵敏度。(本发明)提供了测定样品中(是否有)核酸形成或缺乏核酸形成的方法。样品可以含或不含靶核酸。这种方法可包括提供含样品和荧光核酸染料的检验溶液(testsolution),其中所述突光核酸染料如下式所示
权利要求
1.一种具有下式的化合物
2.如权利要求I所述的化合物，其中所述桥具有下式 _L「[A1- (CH2) α -] a [A2- (CH2) 0-]b [A3- (CH2) y -] c [A4- (CH2) δ -] d [A5- (CH2) ε -]6[A6- (CH2) ζ -] f [A7- (CH2) n-] g [A8- (CH2) θ -] h [A9- (CH2) t_] J-A10-L2-其中L1和L2各自独立为含单键的部分；任选含有至少一个选自N、0和S的杂原子，具有包括端点的I至约12个碳的聚亚甲基单元；或任选含有至少一个选自N、0和S的杂原子的芳基AWmma9和Altl各自独立为核酸结合增强基团(NABEG);任选含有至少一个选自N、0和S的杂原子的支链烷基；或任选含有至少一个选自N、0和S的杂原子的至少一个饱和5-或6-元环； α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ和ι各自独立为O或包括端点的I至约20的整数；和 a、b、C、d、e、f、g、h和i各自独立为O或包括端点的I至约20的整数。
3.如权利要求2所述的化合物，其中所述桥具有下式 -(CH2) X-C (=0) NH- (CH2) α - [O- (CH2) 0 ] b- [O- (CH2) γ ] C_NH (O=C) - (CH2) χ-其中X各自独立为选自包括端点的1-11的整数；α是选自包括端点的2至约20的整数；β和Y各自独立为2或3 ;b是O或包括端点的I至约20的整数；和c是O或I。
4.如权利要求I所述的化合物，其中Q1和Q2是具有式II所示结构的不对称花青染料
5.如权利要求4所述的化合物，其中该化合物具有下式
6.如权利要求I所述的化合物，其中Q1和Q2各自独立地是具有式III的结构的吖啶染料
7.如权利要求6所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构
8.如权利要求1-7任一项所述的化合物，其中Ψ是Γ或Cl—。
9.一种确定样品中是否存在核酸的试剂盒,该试剂盒包括如权利要求1-8任一项所述的化合物；任选的缓冲液；以及关于该试剂盒使用的信息。
10.一种测定样品中是否存在核酸的方法，该方法包括将所述核酸暴露于如权利要求1-8任一项所述的化合物，使得如果该样品中存在核酸，则形成所述化合物和所述核酸的复合物；检测是否存在与该复合物相关的荧光。
11.一种进行核酸扩增反应的方法，该方法包括提供含有靶标核酸、用于扩增所述靶标的必要试剂、以及如权利要求1-8任一项所述的化合物的反应混合物； 使所述反应混合物在适于形成扩增的靶标核酸的条件下进行聚合反应； 用光对反应混合物进行照射；和 检测所述反应混合物发射的荧光，其中所述发射指示存在扩增的靶标核酸。
全文摘要
本发明提供了二聚体和三聚体核酸染料以及有关的系统和方法。这种染料可形成发夹样结构，该结构使得所述染料通过(例如)请求式释放机理使核酸着色。例如，这种染料在没有核酸存在下的背景荧光低，在有核酸存在下，与核酸结合后的荧光高。本发明提供的染料可用于各种领域，例如实时PCR中的DNA定量测定。
文档编号C12Q1/68GK102942566SQ20121044587
公开日2013年2月27日 申请日期2006年3月17日 优先权日2005年3月17日
发明者F·毛, W·-Y·里昂, X·辛 申请人:百奥提姆股份有限公司, 阿莱罗杰克生物科学股份有限公司