专利名称：多角体基因前120bp片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及对一种多角体基因前120bp片段及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
大肠杆菌表达系统目前是应用最广泛的蛋白表达系统之一，其具有成本低廉、生产率高、操作简单等优点。该系统主要有表达载体、表达宿主菌、表达条件等组成。目前，越来越多的研究人员关注于融合表达载体的应用，研究成功的融合表达载体主要有=GST (谷光甘肽-S-转移酶)系统、半乳糖苷酶系统、麦芽糖结合蛋白(MBP)系统、蛋白A系统、纯化标签融合系统等。家香(βοπ γχ mori)多角体蛋白(Polyhedrin, Polh)基因共有738个核苷酸,编码由245个氨基酸组成的大小为29 kD的多肽。它是多角体的主要结构成份；多角体蛋白 构成的蛋白质晶体对包埋在其中的病毒体具有保护作用，它使病毒体在自然环境中保持稳定和侵染能力。多角体蛋白基因是一个超表达极晚期基因。在病毒感染的晚期，当其它病毒基因和宿主基因关闭后，此基因能持续高水平表达，在受感染细胞内产生的多角体蛋白的量可达细胞蛋白质总量的25% -50%。近20年来,人们都致力于研究多角体蛋白基因的高效表达机制，并且利用它的这种特性使许多外源基因得到了高效表达，尤其是一些难以表达的蛋白例如膜蛋白。家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白具有它独特的性质，在大肠杆菌中表达的多角体蛋白在中性PH条件下以包涵体的形式存在，只有在碱性条件(pH
10.8及以上)下可溶，并且这种多角体蛋白具有与天然多角体蛋白晶体相同的性质。因此，可将目的蛋白基因与其融合表达，一方面能提高目的蛋白的表达量，另一方面，通过简单的PH梯度洗脱和差速离心的方法就可以获得较纯的融合蛋白，再经过特异性蛋白酶酶切消化，回收得到较纯的目的蛋白。张耀洲等在纯化标签融合系统上进行改造，将具有高效表达的能力多角体蛋白作为一种标签，将不表达或者难表达的蛋白基因融合上去，从而使其表达或者提高其表达量。同时，利用多角体的溶解特性，通过简单的PH调节和差速离心的方法得到比较纯的融合蛋白，之后进行蛋白酶切得到纯的目的蛋白。但是，蛋白酶的最佳作用pH范围在7. 0-8. 5，而多角体蛋白只有在ρΗΙΟ. 8时才会溶解，所以在这一条件下进行酶切时，蛋白酶丧失活性或者无法达到最大活性，所得到的目的蛋白的量也受到限制。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种多角体基因前120bp片段及其应用。本发明通过在常用载体的基础上，插入该多角体蛋白基因前120bp片段，后面可继续克隆上外源基因，用于融合表达；表达出来的融合蛋白，可用调节PH值的方法等进行快速纯化该目的蛋白，还能在低pH值(pH7. 6)下溶解，所溶解的pH值符合一般蛋白酶反应需要的条件。本发明的技术方案如下
本发明提供一种多角体基因前120bp片段，其碱基序列如SEQ ID NO: I所示。本发明还提供上述多角体基因前120bp片段在表达融合蛋白及降低其溶解性中的应用。本发明还提供上述多角体基因前120bp片段与蛋白酶酶切位点连接而成的重组基因，其喊基序列如SEQ ID N0:2所不。进一步地，其中所述蛋白酶为凝血酶。本发明还提供一种含上述多角体基因前120bp片段的重组载体。进一步地，其中所述重组载体由多角体基因前120bp片段与转移载体构建而成。
进一步地，其中所述转移载体为pET22b、pET28a、pET28b、pET28c、pET32a、pcDNA3或 pFastBac 。进一步地，其中所述转移载体为pET28a。本发明进一步提供一种含上述多角体基因前120bp片段的基因工程菌。进一步地，其中所述基因工程菌为大肠杆菌。本发明主要是在常用的表达载体中利用多角体基因前120bp片段(polhl20)和外源基因产进行融合表达，同时与全长多角体融合方式比对。本发明中的融合方式在具有全长多角体性质的同时，还降低了溶解融合蛋白所需溶液的PH值，使融合蛋白在中性缓冲液中即可溶解，并适用于蛋白酶等酶切反应的进行。
图I是本发明构建的重组表达载体的质粒 图2是本发明多角体基因前120bp片段的PCR产物电泳图；其中，M:核酸分子量标准；I :目的基因PCR产物；
图3是本发明的重组表达载体鉴定图；其中，M:核酸分子量标准；1 基因PCR产物；2 :重组质粒EcoR I和Xho I的酶切产物；
图4是本发明的融合蛋白表达图；M :蛋白分子量标准；I:疋coli BL21pET28a-/ o从7%-從F/7 未诱导；2: B. coli BL21 游a-polhl20_EGFP 潘导·, > -.E. coliBL21 pET28a-/ o从-從F/7 诱导；4: B. coli BL21 pET28a_ -EGFP 诱导；
图5是本发明的融合蛋白溶解性分析图；其中，1、3、5、7、9、11、13是溶液pH为8.0、
8.4,9. 2,9. 6,10. ,10. 4,10. 8 时的上清;2、4、6、8、10、12、14 是溶液 pH 为 8. 0,8. 4,9. 2、
9.6、10. ,10. 4、10. 8 时的沉淀；
图6是本发明使用Gly回调pH值至7. 6时的电泳图；其中，M:蛋白分子量标准；1ρΗ7. 6时的上清蛋白样品；2 pH7. 6时的沉淀中蛋白样品；
图7是本发明的凝血酶酶切效果图；其中，M:蛋白分子量标准；1:ρΗ7. 6时的上清原样；2 pH7. 6时凝血酶酶切后的样品。
具体实施例方式应该指出，以下具体说明都是事例性的，旨在对本发明提供进一步说明，除非另有说明，本文中使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。以下实施例中使用的生物材料如家蚕核型多角体病毒、载体pET-28a、质粒pGEX-4T-l-從F八质粒pET28a_/7o7A和疋coliTGl^. coli BL21 (DE3)均购自特菲(天津)生物医药科技有限公司；所使用的反应试剂如无特殊说明，均为Fermentas公司产品。实施 例I :构建重组载体pET28a_/70从7%
I)以质粒pET28a-/7o7A为模板扩增多角体基因前120bp片段，引物设计如下
上游引物Fl:
5’7TCATGGCCAATTATTCATAC-3’ (斜体表示 I 酶切位点)
下游引物Rl
5’- GGCfi^77TCTCGTTCCTCGTGGTTCTATGTTCGACTAGGTGC-3’
(斜体表示I酶切位点，下划线部分为凝血酶酶切位点)。2) PCR反应参数设计为，94 °C预变性5min，94°C变性30s，59°C退火30s，72°C复性延伸lmin, 30个循环，72°C延伸IOmin0在100 μ L的离心管中，加入下列组分
权利要求
1.ー种多角体基因前120bp片段，其碱基序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.权利要求1所述的多角体基因前120bp片段在表达融合蛋白及降低其溶解性中的应用。
3.权利要求1所述的多角体基因前120bp片段与蛋白酶酶切位点连接而成的重组基因，其碱基序列如SEQ ID N0:2所示。
4.如权利要求3所述的重组基因，其特征在于，所述蛋白酶为凝血酶。
5.含权利要求1所述的多角体基因前120bp片段的重组载体。
6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体由多角体基因前120bp片段与转移载体构建而成。
7.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述转移载体可以为pET22b、pET28a、pET28b、pET28c、pET32a、pcDNA3 或 pFastBac 。
8.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述转移载体为pET28a。
9.含权利要求1所述的多角体基因前120bp片段的基因工程菌。
10.如权利要求9所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为大肠杆菌。
全文摘要
本发明涉及一种多角体基因前120bp片段及其应用，属于生物技术领域。本发明主要是在常用的表达载体中利用多角体基因前120bp片段和外源基因EGFP进行融合表达，同时与全长多角体融合表达方法比对。本发明中的融合表达方法在具有全长多角体性质的同时，还降低了溶解融合蛋白所需溶液的pH值，使融合蛋白在中性缓冲液中即可溶解，并适用于蛋白酶等酶切反应的进行。
文档编号C12R1/19GK102952806SQ20121045328
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者张耀洲, 耿文杰, 舒特俊, 陈剑清 申请人:天津耀宇生物技术有限公司