专利名称：多角体基因前180bp片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及多角体基因前ISObp片段及其应用。
背景技术：
家香(Bombyx mori)多角体蛋白(Polyhedrin, Polh)基因共有738个核苷酸,编码由245个氨基酸组成的大小为29 kD的多肽，是多角体的主要结构成份。多角体蛋白构成的蛋白质晶体对包埋在其中的病毒体具有保护作用，它使病毒体在自然环境中保持稳定和侵染能力。多角体蛋白基因是一个超表达极晚期基因。在病毒感染的晚期，当其它病毒基因和宿主基因关闭后，此基因能持续高水平表达，在受感染细胞内产生的多角体蛋 白的量可达细胞蛋白质总量的25% 50%。近20年来，人们都致力于研究多角体蛋白基因的高效表达机制，并且利用它的这种特性使许多外源基因得到了高效表达，尤其是一些难以表达的蛋白例如膜蛋白。家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白具有它独特的性质，在大肠杆菌中表达的多角体蛋白在中性PH值条件下以包涵体的形式存在，只有在碱性条件(pH值10. 8及以上)下可溶，并且这种多角体蛋白具有与天然多角体蛋白晶体相同的性质。因此，可将目的蛋白基因与其融合表达，一方面能提高目的蛋白的表达量，另一方面，通过简单的PH梯度洗脱和差速离心的方法就可以获得较纯的融合蛋白，再经过特异性蛋白酶酶切消化，回收得到较纯的目的蛋白。但是，目前采用多角体融合外源蛋白表达时，由于多角体只有在碱性条件下才可溶，而在用蛋白酶进行酶切融合蛋白而获得单独的目的蛋白的过程中，蛋白酶反应的最适合PH值一般是中性(pH值疒9)条件下，这样就造成了无法简单地在酶最适的条件下通过酶切获得单纯的目的蛋白，而碱性条件下进行酶切时，蛋白酶就会丧失活性或者无法达到最大活性，所得到的目的蛋白的量也受到限制。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了家蚕多角体蛋白基因片段，该片段与目的基因融合表达后，除了能够满足大量表达的要求外，其溶解性质也发生改变，在蛋白酶适宜的PH值范围内即可溶解，大大简化了酶切及纯化步骤。本发明的多角体蛋白基因前180bp片段，核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。上述多角体蛋白基因前180bp片段在蛋白融合表达中的应用。—种表达载体，是由出发载体的多克隆位点依次插入所述多角体蛋白基因前ISObp片段和蛋白酶酶切位点片段构建而成。融合蛋白表达后用相应的蛋白酶进行酶切，获得目的蛋白。优选地，所述出发载体为pET系列载体、pcDNA3系列载体、pFastBac 系列载体、PKK系列载体或pBAD系列载体。其中pET系列载体的pET_28a为最佳。优选地，所述的蛋白酶酶切位点片段为凝血酶酶切位点片段。所述凝血酶酶切位点片段核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
一种融合蛋白表达载体，是在出发载体的多克隆位点依次插入上述多角体蛋白基因前ISObp片段、蛋白酶酶切位点片段和目的基因片段构建而成。优选地，所述目的基因为EGFP (增强型绿色荧光蛋白，Enhanced GreenFluorescent Protein)基因、LZM (溶菌酶，lysozyme)基因或MMgT (家蚕膜镁转运蛋白，membrane magnesium transporter protein) _因等。一种基因工程菌，包括上述融合蛋白表达载体。优选地，该基因工程菌为大肠杆菌。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明在多角体基因polh的基础上发现其部分序列比其全长序列具有更优异的性质，可以与其他目的基因共同表达融合蛋白，不但能够实现提高表达量的效果，还可以增加 融合蛋白在中性PH值条件下的溶解性，使其适用于蛋白酶酶切功能的最佳pH值，大大方便了目的蛋白的获取。
图I 是 pET-28a-polhl80_EGFP 质粒图谱。图2是多角体基因前180pb片段的PCR产物电泳图；其中，M:核酸分子量标准；1 目的基因PCR产物。图3 是 EGFP 的 PCR 扩增图，M marker ； I EGFP 扩增产物。图4是重组表达载体鉴定图，其中，M:核酸分子量标准；1 :EGFP基因PCR产物；2 :重组表达载体pET-28a-polhl80-EGFP经AcoR I和通o I酶切后产物条带。图5是pET-28a-polhl80_EGFP蛋白表达结果，M :蛋白分子量标准；I :pET-28a-polhl80-EGFP未诱导；2: pET-28a-polhl80_EGFP诱导；3 :pET_28a-poIh-EGFP诱导；4 pET-28a-EGFP 诱导。图6是poIh 180-EGFP融合蛋白溶解性分析图；其中，I、3、5、7、9、11、13是溶液pH为 8. 0,8. 4,9. 2,9. 6,10. 0,10. 4,10. 8 时的上清；2、4、6、8、10、12、14 是溶液 pH 为 8. 0,8. 4、9. 2,9. 6、10. O、10. 4、10. 8 时的沉淀。图7是polhl80_EGFP蛋白溶液使用Gly回调pH值的电泳图；其中，M:蛋白分子量标准；5 polhl80-EGFP 上清(pH10. 8) ；6 :polhl80_EGFP 上清(pH9. 0) ；7 :polhl80_EGFP上清(pH8.0) ;8 :polhl80-EGFP 沉淀(pH8. 0) ;9 :polh_EGFP 上清(pH10. 8) ；10 poIh-EGFP 沉淀(pH10. 8)。图8是polhl80_EGFP融合蛋白经过凝血酶酶切后的电泳结果图，其中M :蛋白分子量标准；1 pH7. 6时的上清原样；2 pH7. 6时凝血酶酶切后的样品。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。以下实施例中使用的生物材料如家蚕核型多角体病毒、载体pET_28a、质粒PGEX-4T-1-EGFP和E. coli TGl均购自特菲(天津)生物医药科技有限公司。实施例I :构建表达载体pET28a-/ o7A180(I )/7o7A基因序列已知，可以使用任何含有该基因片段的质粒或例如病毒等其他生物材料作为模版，本实施例以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组为模板扩增多角体基因前ISObp的片段。引物设计如下:
上游引物 F :5’-CGCGGATCCATGCCGAATTAITCATACAC-3’ (SEQ ID NO: 3，方框内为 I酶切位点)；
下游引物R :
5’_ GGCGAATTCCTCGTTCCTCGTGGTTCTAAAGG GATCTTCGGCAA-3’ (SEQ ID NO:4，方框内为 I酶切位点，下划线部分为凝血酶酶切位点)。(2)多角体蛋白基因前180bp片段扩增
以病毒基因组为模板，步骤(I)的F和R序列为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系在IOOu L的离心管中，加入下列组分
10 .■+: Taq Buffer I5 uL
2.5mM dKTPsSuL
Taq DKA p eras e1.5 uL
FI uL
RI uL
模板I吣
无菌取蒸水—
总体枳50成
各组分混匀后，放入PCR仪中，反应参数设计为94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C复性延伸20s，30个循环，72°C延伸3min。按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段(见图2)，同时切胶回收目的片段。扩增产物大小为180bp，经测序，与GenBank登录号JQ291703. I序列中前180bp —致。(3)上述得到的PCR产物经及I和及双酶切后的基因片段克隆至经及
I和及双酶切的载体pET-28a中，使PCR扩增的基因连接到载体pET_28a上，构建成重组载体pET-28a-polhl80，经酶切分析鉴定基因序列完全正确。实例2 :融合表达EGFP
(I)扩增EGFP基因序列
EGFP基因序列参见GenBank登录号JQ969017. 1，为已知序列，可以使用任何含有该基因片段的生物材料作为扩增模版，为方便操作，本实施例以质粒PGEX-4T-1-EGFP为模板，设计引物扩增EGFP基因片段。用Primer5. 0设计的EGFP基因ORF序列引物如下
上游引物 F’:5’ - GCCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA -3' (SEQ ID NO: 5，方框内为EcoRI酶切位点)；
下游引物 R’5’-CCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’ (SEQ ID N0:6，方框内为ZAo
I酶切位点)。PCR反应体系在100 u L的离心管中，加入下列组分
权利要求
1.多角体蛋白基因前180bp片段，其特征在于，核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.权利要求1所述的多角体蛋白基因前180bp片段在蛋白融合表达中的应用。
3.—种表达载体，其特征在于，由出发载体的多克隆位点依次插入权利要求1所述的多角体蛋白基因前180bp片段和蛋白酶酶切位点片段构建而成。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在干，所述出发载体为pET系列载体、pcDNA3系列载体、pFastBac 系列载体、pKK系列载体或pBAD系列载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述出发载体为pET-28a。
6.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述的蛋白酶酶切位点片段为凝血酶酶切位点片段，其核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
7.ー种融合蛋白表达载体，其特征在于，在出发载体的多克隆位点依次插入权利要求1所述的多角体蛋白基因前180bp片段、蛋白酶酶切位点片段和目的基因片段构建而成。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白表达载体，其特征在于，所述目的基因为EGFP基因、LZM基因、ORAI基因或MMgT基因。
9.ー种基因工程菌，其特征在于，包括权利要求7所述的融合蛋白表达载体。
10.根据权利要求9所述的基因工程菌，其特征在干，该基因工程菌为大肠杆菌。
全文摘要
本发明公开了多角体基因前180bp片段及其应用，属于基因工程技术领域。本发明的多角体基因前180bp片段核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。该片段可以应用于融合蛋白的表达。本发明还公开了一种表达载体，由出发载体的多克隆位点依次插入上述片段和蛋白酶酶切位点片段构建而成。本发明的多角体基因前180bp序列比其全长序列具有更优异的性质，可以与其他目的基因连接表达融合蛋白，不但能够实现提高表达量的效果，还可以增加融合蛋白在中性pH值条件下的溶解性，使其适用于蛋白酶酶切功能的最佳pH值，大大方便了目的蛋白的获取。
文档编号C12N15/12GK102952807SQ20121045334
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者张耀洲, 耿文杰, 毕臻乐, 舒特俊, 陈剑清 申请人:天津耀宇生物技术有限公司