专利名称：生产达玛二烯和原人参二醇的重组微生物及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种生产达玛二烯和原人参二醇的重组微生物及其构建方法。
背景技术：
原人参二醇(Protopanoxadiol)是药用植物人参中提取的三職阜苷元,达玛二烯(Dammarenediol-II)为其生物合成的前体化合物。原人参二醇具有抗癌、抗抑郁、激活氯离子通道和抑制钠离子通道去极化的作用、抑制人胚肾HEK-293细胞和幽门螺旋杆菌生长等多种药理活性。原人参二醇的糖基化产物人参二醇型人参皂苷类化合物，如人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg3等在心脑血管，抗肿瘤等方面也有很好的药理活性，这类化合物的相关产品已在临床广泛使用。当前人参皂苷类化合物的主要来源是通过中药材人参中直接提取，但随着开垦荒地、荒山伐林人参野生资源的生长环境遭到严重破坏，人参资源极度紧·张；人工种植过程中也遇到品种退化，大量的土地和人力成本等因素。人参皂苷类化合物产量已经远不能满足社会的需求，严重影响了人参的临床应用和人参皂苷类制药原料中间体的开发和应用，亟待需要提供新的资源途径。目前利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在大肠杆菌中生产紫杉醇的前体紫杉二烯已达到1000mg/L(ParayiI Kumaran Ajikumar et al. , 2010, Science, 330:70-74);银杏内酯类(Ginkgol ides)前体左旋海松二烯(Levopimaradiene),在改造后的大肠杆菌工程菌中达到700mg/L 的产量(Effendi Leonard et al.，2010，PNAS, 107 (31) : 13654 - 13659);在酵母工程菌中生产青蒿素(Artemisinin)的前体青蒿酸(Artemisinic acid)最高达到IOOmg/L(Dae-Kyun Ro etal. , 2006, Nature, 440:940-943);目前国内在青蒿素，紫杉醇和丹参酮等药物分子的生物合成方面有相关研究。原人参二醇为人参植物体内萜类合成途径的产物，由人参细胞中线粒体、细胞溶质和内质网存在的甲羟戊酸代谢途径(MVA Pathway)与在质体中存在的丙酮酸/磷酸甘油醛代谢途径(MEP Pathway)共同合成。其中前体物质鲨烯(Squalene)为IPP和DMAPP经过法呢基焦磷酸合酶(FPS)和鲨烯合酶(SQS)共同催化得到，鲨烯可以被鲨烯环氧酶(SQE)和达玛二烯合酶依次催化为达玛二烯(dds)，达玛二烯能被原人参二醇合成酶(pros)和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶(CPR)共同催化生成原人参二醇。作为传统发酵工艺中常用菌株酿酒酵母在其体内存在生产萜类成分的甲羟戊酸途径，其中产三萜类成分麦角留醇(Ergosterol)能达到生物量的4. 6%(Arnezeder, C. et al. , 1990, Biotechnollett.，12:277-282) ; 二萜香叶酰香叶酰醇(GGOH)也能达到 283mg/L(Tokuhiro, K. etal.，2009，Appl Environ Microbiol.，75:5536-5543)。由此，利用合成生物学的方法和技术在酿酒酵母中构建和优化相关生物合成途径来生产达玛二烯和原人参二醇具有很大潜力。
发明内容
本发明的一个目的是构建重组菌的方法。本发明提供的构建重组菌的方法，包括如下步骤向酿酒酵母中导入达玛二烯合酶编码基因表达盒、原人参二醇合成酶编码基因表达盒和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒，得到重组菌I。上述向酿酒酵母中导入达玛二烯合酶编码基因表达盒、原人参二醇合成酶编码基因表达盒和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒为通过同源重组的方法向酿酒酵母的rDNA位点中导入达玛二烯合酶编码基因表达盒、原人参二醇合成酶编码基因表达盒和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒;所述同源重组的方法具体为向酿酒酵母中导入含有筛选标记基因A的rDNA位点上游同源臂rDNA-LEU2-up (来源于质粒prDNA_LEU2 )、达玛二烯合酶编码基因表达盒PrcK1-PgDDS-TADHlt (来源于质粒pM14-PgDDS)、原人参二醇合成酶编码基因表达盒Ptefi-PgPPDS-Tcyci (来源于质粒pM3-PgPH)S)、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒PTDH3-AtCPRl-Tmi (来源于质粒pMll-AtCPRl)和rDNA位点下游同源臂 rDNA-down (来源于质粒 prDNA_LEU2)；上述含有筛选标记基因A的rDNA位点上游同源臂rDNA-LEU2-up、达玛二烯合酶编码基因表达盒PrcK1-PgDDS-TADHlt、原人参二醇合成酶编码基因表达、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒PTDH3-AtCPRl-TTm、rDNA位点下游同源臂rDNA-down的制备方法均见实施例2的I )，而各自片段来源的质粒的制备方法均见实施例I。上述方法中，所述筛选标记基因A为LEU2 ；所述达玛二烯合酶编码基因表达盒包括启动子PGK1、达玛二烯合酶编码基因PgDDS、终止子 ADHlt ；所述原人参二醇合成酶编码基因表达盒包括启动子TEFl、原人参二醇合成酶编码基因PgPPDS和终止子CYCl ；所述烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒包括启动子TDH3、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因AtCPRl和终止子TPII。上述方法还包括如下步骤提高所述重组菌I中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，得到重组菌2。上述方法中，所述提高所述重组菌I中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性为向所述重组菌I中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒；上述向所述重组菌I中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒具体为通过同源重组向所述重组菌I的δ位点中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒；上述同源重组的方法进一步具体为向所述重组菌I中导入线性化的含有3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒的质粒P δ -tHMGl ；上述线性化质粒P δ-tHMGl的制备方法见实施例3，涉及的质粒P δ-tHMGl的制备方法见实施例I。
所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒进一步包括启动子PGKU3羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMGl和终止子ADHlt。上述方法还包括如下A-F中的任一一种A :提高所述重组菌2中的法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌3 ；B :提高所述重组菌2中的鲨烯合酶的活性，得到重组菌4 ；C :提高所述重组菌2中的鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌5 ；D :提高所述重组菌2中的鲨烯环氧酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌6 ； E :提高所述重组菌2中的鲨烯环氧酶和鲨烯合酶的活性，得到重组菌7 ；F :提高所述重组菌2中的鲨烯环氧酶、鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌8。A :所述提高重组菌2中的法呢基焦磷酸合酶的活性为向所述重组菌2中导入法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；所述向所述重组菌2中导入法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒为通过同源重组的方法实现；所述同源重组的方法进一步具体为向所述重组菌2中导入含有筛选标记基因B和所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒片段HIS3-PPGK1-ERG20-TADHlt (来源于质粒 pEHIS3_ERG20);所述 HIS3-Ppgk1-ERG20-T丽lt 的制备方法见实施例4，涉及的质粒pEHIS3-ERG20的制备方法见实施例I。B :所述提高重组菌2中的鲨烯合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A ;所述向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A具体通过同源重组实现；所述同源重组的方法进一步具体为向所述重组菌2中导入含有所述筛选标记基因B和所述鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A片段HIS3-PrcK1-ERG9-TADHlt (来源于质粒 pEHIS3-ERG9) ；HIS3-PPGK1-ERG9-TADHlt 的制备方法见实施例 5，涉及的质粒 pEHIS3_ERG9的制备方法见实施例I。C :所述提高重组菌2中的鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；所述向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒具体通过同源重组向所述重组菌2的Trpl位点导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒实现；上述同源重组进一步具体为向所述重组菌2中导入含有筛选标记基因B的Trpl位点的上游同源臂Trp-HIS3-up、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B Ptef1-ERG9-Tctc1、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒PPGK1-ERG20-TADHlt 和 Trpl 位点的下游同源臂 Trp-down ；含有筛选标记基因B的Trpl位点的上游同源臂(来源于质粒pTrp-HIS3)、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B (来源于质粒PM3-ERG9)、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒(来源于质粒PEHIS3-ERG20)和Trpl位点的下游同源臂(来源于质粒pTrp_HIS3)的制备方法均见实施例6，涉及的质粒的制备方法见实施例I。D:所述提高重组菌2中的鲨烯环氧酶ERGl和法呢基焦磷酸合酶ERG20的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A和所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；所述向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒具体通过同源重组的向所述重组菌2的Trpl位点导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；所述同源重组的方法进一步具体为向所述重组菌2中导入含有筛选标记基因B的Trpl位点的上游同源臂Trp-HIS3-up、鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A Ptefi-ERGI-Tctci、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒Praa-ERGZO-Tadh1P Trpl位点的下游同源臂Trp-down ；含有筛选标记基因B的Trpl位点的上游同源臂Trp-HIS3-up (来源于质粒pTrp-HIS3)、鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A Ptefi-ERGI-Tctci(来源于质粒pM13_ERGl)、·法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒PrcK1-ERG20-TADHlt (来源于质粒pEHIS3_ERG20)、Trpl位点的下游同源臂Trp-down(来源于质粒pTrp_HIS3)的制备方法均见实施例7,涉及的质粒的制备方法见实施例I。E:所述提高重组菌2中的鲨烯环氧酶和鲨烯合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A和鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A ;所述向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A和鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A具体通过同源重组向所述重组菌2的Trpl位点导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A和鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A ;所述同源重组的方法进一步具体为向所述重组菌2中导入含有筛选标记基因B的Trpl位点的上游同源臂Trp-HIS3-up (来源于质粒pTrp_HIS3)、鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A Ptefi-ERGI-Tcyci (来源于质粒pM13_ERGl)、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A Pj^-ERGg-I^mt (来源于质粒pEHIS3_ERG9)、Trpl位点的下游同源臂Trp-down (来源于质粒 pTrp_HIS3)；含有筛选标记基因B的Trpl位点的上游同源臂Trp-HIS3-up、鲨烯环氧酶编码基因 ERGl 表达盒 A Ptefi-ERGI-Tctci、鲨烯合酶编码基因 ERG9 表达盒 A Ppgki-ERGQ-Tadhio Trpl位点的下游同源臂Trp-down的制备方法均见实施例8,涉及的质粒的制备方法见实施例I。F :所述提高重组菌2中的鲨烯环氧酶、鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒B、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；所述向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒B、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒具体通过同源重组向所述重组菌2的Trpl位点导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒B、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；所述同源重组的方法进一步具体为向所述重组菌2中导入含有筛选标记基因B的Trpl位点的上游同源臂Trp-HIS3-up (来源于质粒pTrp_HIS3)、鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒BPtdh3-ERGI-Ttpii (来源于质粒 pMll-ERGl)、鲨烯合酶编码基因 ERG9 表达盒 B Ptefi-ERG9-TCYC1(来源于质粒PM3-ERG9)、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒PrcK1-ERG20-TADHlt (来源于质粒pEHIS3-ERG20)、Trpl位点的下游同源臂Trp-down (来源于质粒pTrp_HIS3)；含有筛选标记基因B的Trpl位点的上游同源臂Trp-HIS3-up、鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒B PTDH3-ERG1-TTPI1、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B PTEF1-ERG9_TCTC1、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒Ppm-ERGZO-I^mt、Trpl位点的下游同源臂Trp-down的制备方法均见实施例9，涉及的质粒的制备方法见实施例I。所述筛选标记基因B进一步具体为HIS3 ；所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒进一步具体包括启动子PGK1、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20和终止子ADHlt ；
所述鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A进一步具体包括启动子PGKl、鲨烯合酶编码基因ERG9和终止子ADHlt ；所述鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B进一步具体包括启动子TEFl、鲨烯合酶编码基因ERG9和终止子CYCl ；所述鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A进一步具体包括启动子TEFl、鲨烯环氧酶编码基因ERGl和终止子CYCl ； 所述鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒B进一步具体包括启动子TDH3、鲨烯环氧酶编码基因ERGl和终止子TPII。上述方法中，所述编码基因PgDDS的核苷酸序列为序列表中的序列I ;
所述编码基因PgPros的核苷酸序列为序列表中的序列2 ；所述编码基因AtCPRl的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；所述编码基因ERG20的核苷酸序列为序列表中的序列4 ；所述编码基因ERG9的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；所述编码基因ERGl的核昔酸序列为序列表中的序列6 ；所述编码基因tHMGl的核苷酸序列为序列表中的序列7 ；所述启动子PGKl的核苷酸序列为序列表中的序列8 ；所述启动子TEFl的核苷酸序列为序列表中的序列9 ；所述启动子TDH3的核苷酸序列为序列表中的序列10 ；所述终止子CYCl的核苷酸序列为序列表中的序列11 ;所述终止子ADHlt的核苷酸序列为序列表中的序列12 ；所述终止子TPIl的核苷酸序列为序列表中的序列13 ；所述HIS3的核苷酸序列为序列表中的序列14 ；所述LEU2的核苷酸序列为序列表中的序列15。上述酿酒酵母具体为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742。由上述的方法得到的重组菌I也是本发明保护的范围；或由上述的方法得到的重组菌2也是本发明保护的范围；或由上述的方法得到的重组菌3、重组菌4、重组菌5、重组菌6、重组菌7或重组菌8也是本发明保护的范围。上述重组菌I、所述重组菌2或所述重组菌3-8中任意一种在生产达玛二烯和/或原人参二醇中的应用也是本发明保护的范围。本发明的另一个目的是提供一种生产达玛二烯和/或原人参二醇的方法。本发明提供的方法，为发酵上述重组菌I、所述重组菌2或所述重组菌3-8中任意一种，得到达玛二烯和/或原人参二醇。上述发酵采用的培养基为液体培养基，其中各组分及其终浓度如下终浓度为1%(质量百分含量)Yeast Extract (酵母膏)、终浓度为2% (质量百分含量)Peptone (蛋白胨)、终浓度为2% (质量百分含量)Dextrose (葡萄糖)，用水补足体积；固体培养基需再加2%琼脂粉。上述发酵的条件为30°C，250rpm/min、振荡培养8天。本发明中涉及的蛋白和基因的名称具体如下
ERG9为酵母藍烯合酶基因名，其编码的酶为藍烯合酶(Squalene synthase)；ERG20为酵母法呢基焦磷酸合酶基因名，其编码的酶为法呢基焦磷酸合酶(Farnesyl pyrophosphate synthase)；
ERGl为酵母鲨烯环氧酶基因名，其编码的酶为鲨烯环氧酶(Squaleneepoxidase)；pgDDS为来源于人参的达玛二烯合酶编码基因，其编码的蛋白为达玛二烯合酶(Dammarenediol-II synthase)；pgPPDS为来源于人参的原人参二醇合成酶编码基因，其编码的蛋白为原人参二醇合成酶(Protopanaxadiol synthase)；AtCPRl为来源于拟南芥的烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶I编码基因，其编码的蛋白为烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450reductase)；tHMGl为来源于部分酿酒酵母的3-羟基_3_甲基戊二酰辅酶A还原酶I编码基因，具体为酿酒酵母的3-轻基-3-甲基戍二酰辅酶A还原酶l(3-hydroxyl-3-methylglutaryl-CoA reductase)截取5’部分序列的功能蛋白。所述PGKl启动子为酿酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶启动子。所述TDH3启动子为酿酒酵母的3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子。所述TEFl启动子为酿酒酵母的翻译延伸因子I启动子。所述δ位点为酿酒酵母染色体上多个δ基因中的1-10个随机位置。所述rDNA位点为酿酒酵母染色体上多个核糖体基因中的1_10个随机位置。所述HIS3位点为酿酒酵母染色体上组氨酸生物合成途径中HIS3基因位置。所述Trpl位点为酿酒酵母染色体上色氨酸生物合成途径中Trpl基因位置。本发明的实验证明，本发明通过同源重组的手段，将PgDDS、AtCPRl和PgPTOS均导入酿酒酵母中得到初始重组菌，发现其可产生微量的达玛二烯和原人参二醇；再提高初始重组菌的tHMGl的活性，得到中间重组菌，其达玛二烯和原人参二醇产量明显提高；在中间重组菌的基础上又提高其ERG1、ERG9和ERG20 —个或者两个或者三个的活性，发现也能构建出达玛二烯和原人参二醇产量提高的重组菌；为人工合成达玛二烯和原人参二醇奠定了基础。
图I为达玛二烯GC-MS分析图2为原人参二醇LC-MS分析图3为工程菌株中达玛二烯和原人参二醇含量分析
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、基因兀件克隆和含有对应基因原件的质粒构建一、基因元件的克隆分为以下三步
(I)酵母基因组DNA提取挑取酿酒酵母BY4742 (Saccharomyces cerevisiaeBY4742,记载在 Carrie bakerbrachmann et al.，1998，YEAST, 14:115 - 132,公众可从天津工业生物技术研究所和中国中医科学院中药研究所获得。)菌斑于YH)液体培养基(配方l%Yeast Extract (酵母膏)，2%Peptone (蛋白腺)，2%Dextrose (葡萄糖))中，30 °C, 200rpm,培养 24h。10000g,5 分钟收集菌体于I. 5ml离心管中，水清洗两次，菌体重悬于酵母破壁液中(25ul酵母破壁酶，470ul山梨醇缓冲液，5ul β -ME), 30°C温浴Ih后离心；菌体用500ul TENTS缓冲液(IOmMTris-HCl,pH 7. 5 ； ImM EDTA, pH8. 0 ； IOOmM NaAc ；2%triton-100 ；1%SDS)重悬，60°C 水浴Ih ;酚/氯仿抽提2次；上清液加3倍体积的EtOH，1/10倍体积的3M NaAc, -20°C冰箱放置2h ;13000g，4°C，离心lOmin，倒掉上清，沉淀用709ffit0H，洗剂沉淀2次后吹干，双蒸水溶解，-20°C保存备用，得到酵母基因组DNA。 (2)人参cDNA和拟南芥cDNA的获得
总RNA提取分别收集人参细胞(人参的愈伤组织细胞，Juan Wang etal. , 2013, Industrial Crops and Products. 41:57-63,公众可从天津工业生物技术研究所和中国中医科学院中药研究所获得。)组织(用茉莉酸甲酯诱导24小时)和新鲜拟南芥(col-0 生态型；Athanasios Theologis et al. , 2000, Nature 408 :816_820，公众可从天津工业生物技术研究所和中国中医科学院中药研究所获得。)叶片各200mg用液氮研磨后CTAB法提取总RNA :在I. 5ml离心管中加入Iml 2*CTAB提取液，65°C预热之后，加入20 μ I2-ΜΕ ;加入少量粉末(约50mg)，混合均匀，65°C保温IOmin,摇匀5次；4°C，12000rpm离心IOmin,移出上清,用等体积的氯仿/异戍醇抽提；4°C, 12000rpm离心IOmin,移出上清,用等体积的氯仿/异戍醇抽提；4°C, 12000rpm离心IOmin,移出上清,用1/6体积的氯仿/异戍醇抽提；4°C，15000rpm离心30min，移出上清，加入1/4体积的10mol/L LiCl，4°C放置过夜；40C，15000rpm离心30min，弃去上清，用75%乙醇洗涤沉淀2次，无水乙醇洗涤沉淀I次，超净台放置15min (室温)；用2(^1 milliQ DEPC处理水溶解，加入1/10体积的2mol/L NaAC(pH4. 0)，加入2体积的无水乙醇，_20°C放置2h ;4°C，12000rpm离心lOmin，弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤两次，无水乙醇洗涤沉淀I次；超净台放置15min(室温)，加15μ I milliQDEPC处理水使沉淀充分溶解，-70°C保存。第一链反转录-PCR :取无RNA酶PCR管，按第一链反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)配备体系Radom 6Mers 2ul、dNTP lul、total RNA Iul (200ng)、H206ul、TotallOul、瞬间离心，PCR 65°C 5min,冰上急冷；再加入以下体系中反应液5*primerBuffer 4ul、RNAs Inhibiter O. 5ul> R-Transcription lul、H20 4. 5ul,瞬间离心，PCR 仪进行反应30°C 10min、42°C 60min、70°C 15min、4°C保温。分别得到人参细胞cDNA和拟南芥cDNA。(3) PCR扩增及克隆基因元件以酵母基因组DNA为模板，用引物列表I中引物，扩增tHMGl、ERG20、ERG9、ERGl ；以人参细胞cDNA为模板扩增PgDDS基因和PgPPDS基因；以拟南芥cDNA为模板扩增 AtCPRl 基因。扩增体系为NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer IOul> dNTP(IOmMeach dNTP) lul、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 lul、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase (2. 5U/ul) 0. 5ul、补加蒸懼水至总体积 50ul。
表I引物序列
权利要求
1.一种构建重组菌的方法，包括如下步骤向酿酒酵母中导入达玛二烯合酶编码基因表达盒、原人参二醇合成酶编码基因表达盒和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒，得到重组菌I。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述向酿酒酵母中导入达玛二烯合酶编码基因表达盒、原人参二醇合成酶编码基因表达盒和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒为通过同源重组向酿酒酵母的rDNA位点中导入达玛二烯合酶编码基因表达盒、原人参二醇合成酶编码基因表达盒和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒； 所述达玛二烯合酶编码基因表达盒进一步具体包括启动子PGKl、达玛二烯合酶编码基因PgDDS、终止子ADHlt ； 所述原人参二醇合成酶编码基因表达盒进一步具体包括启动子TEF1、原人参二醇合成酶编码基因PgPPDS和终止子CYCl ； 所述烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒进一步具体包括启动子TDH3、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因AtCPRl和终止子 TPI1。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下步骤提高所述重组菌I中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，得到重组菌2。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述提高所述重组菌I中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性为向所述重组菌I中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因的表达盒； 所述向所述重组菌I中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒具体为通过同源重组向所述重组菌I的S位点中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒； 所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶I编码基因表达盒进一步具体包括启动子PGK1、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMGl和终止子ADHlt。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下A-F中的任一一种 A :提高所述重组菌2中的法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌3 ； B :提高所述重组菌2中的鲨烯合酶的活性，得到重组菌4 ； C :提高所述重组菌2中的鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌5 ； D :提高所述重组菌2中的鲨烯环氧酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌6 ； E :提高所述重组菌2中的鲨烯环氧酶和鲨烯合酶的活性，得到重组菌7 ； F :提高所述重组菌2中的鲨烯环氧酶、鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌8。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于 A :所述提高重组菌2中的法呢基焦磷酸合酶的活性为向所述重组菌2中导入法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒； 所述向所述重组菌2中导入法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒具体为通过同源重组的方法实现；B :所述提高重组菌2中的鲨烯合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A ;所述向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A具体通过同源重组实现； C :所述提高重组菌2中的鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒； 所述向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒具体通过同源重组向所述重组菌2的Trpl位点导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒实现；D:所述提高重组菌2中的鲨烯环氧酶和法呢基焦磷酸合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A和所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；所述向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒具体通过同源重组的向所述重组菌2的Trpl位点导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒； E:所述提高重组菌2中的鲨烯环氧酶和鲨烯合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A和鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A ； 所述向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A和鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A具体通过同源重组向所述重组菌2的Trpl位点导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A和鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A ； F :所述提高重组菌2中的鲨烯环氧酶、鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒B、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒； 所述向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒B、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒具体通过同源重组向所述重组菌2的Trpl位点导入鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒B、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒； 所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒进一步具体包括启动子PGK1、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20和终止子ADHlt ； 所述鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A进一步具体包括启动子PGK1、鲨烯合酶编码基因ERG9和终止子ADHlt ； 所述鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B进一步具体包括启动子TEFl、鲨烯合酶编码基因ERG9和终止子CYCl ； 所述鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒A进一步具体包括启动子TEF1、鲨烯环氧酶编码基因ERGl和终止子CYCl ； 所述鲨烯环氧酶编码基因ERGl表达盒B进一步具体包括启动子TDH3、鲨烯环氧酶编码基因ERGl和终止子TPII。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于 所述编码基因PgDDS的核昔酸序列为序列表中的序列I ; 所述编码基因PgPPDS的核苷酸序列为序列表中的序列2 ； 所述编码基因AtCPRl的核昔酸序列为序列表中的序列3 ；所述编码基因ERG20的核昔酸序列为序列表中的序列4 ； 所述编码基因ERG9的核昔酸序列为序列表中的序列5 ； 所述编码基因ERGl的核昔酸序列为序列表中的序列6 ； 所述编码基因tHMGl的核昔酸序列为序列表中的序列7 ； 所述启动子PGKl的核苷酸序列为序列表中的序列8 ； 所述启动子TEFl的核苷酸序列为序列表中的序列9 ； 所述启动子TDH3的核苷酸序列为序列表中的序列10 ； 所述终止子CYCl的核苷酸序列为序列表中的序列11 ； 所述终止子ADHlt的核苷酸序列为序列表中的序列12 ； 所述终止子TPIl的核苷酸序列为序列表中的序列13。
8.由权利要求I或2所述的方法得到的重组菌I; 或由权利要求3或4所述的方法得到的重组菌2 ； 或由权利要求5-7中任一所述的方法得到的重组菌3、重组菌4、重组菌5、重组菌6、重组菌7或重组菌8。
9.权利要求8所述重组菌I、所述重组菌2或所述重组菌3-8中任意一种在生产达玛二烯和/或原人参二醇中的应用。
10.一种生产达玛二烯和/或原人参二醇的方法，为发酵权利要求8所述重组菌I、所述重组菌2或所述重组菌3-8中任意一种，得到达玛二烯和/或原人参二醇。
全文摘要
本发明公开了一种生产达玛二烯和原人参二醇的重组微生物及其构建方法。本发明提供的一种构建重组菌的方法，包括如下步骤向酿酒酵母中导入达玛二烯合酶、原人参二醇合成酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因，得到重组菌1。本发明通过同源重组的手段，将达玛二烯合酶、原人参二醇合成酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因均导入酿酒酵母中得到初始重组菌，发现其可产生微量的达玛二烯和原人参二醇；再提高初始重组菌的tHMG1的活性，得到中间重组菌，其达玛二烯和原人参二醇产量明显提高；在中间重组菌的基础上又提高其ERG1、ERG9和ERG20一个或者两个或者三个的活性，发现也能构建出达玛二烯和原人参二醇产量提高的重组菌；为人工合成达玛二烯和原人参二醇奠定了基础。
文档编号C12N1/19GK102925376SQ20121045341
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者张学礼, 黄璐琦, 戴住波, 刘怡, 张夏楠, 施明雨, 马延和 申请人:天津工业生物技术研究所, 中国中医科学院中药研究所