专利名称：一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤诊断应用研究領域中的通过毛细管电泳检测基因突变实现肿瘤早期诊断的研究領域，尤其涉及一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法。
背景技术：
目前，随着外界环境的变化和人类饮食习惯的改变，消化道肿瘤作为我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年提高，发病年龄也趋于年轻化，严重威胁着人们的健康与生命。虽然传统的消化道肿瘤诊断方法例如X光、B超、CT、核磁共振、内窥镜等的影像学及染色体检查等在普通临床诊断中发挥了巨大作用，但是对于消化道肿瘤的早期诊断具有无法逾越的鸿沟——预警，往往等确诊消化道肿瘤时已错过最佳治疗时间，大大降低了术后存活率。消化道肿瘤和其它肿瘤发生机理ー样，都是ー个多因素、多基因、多步骤的癌变 过程，涉及大量相关基因结构和表达调控的改变，尤其是癌基因的活化和抑癌基因的失活起着重要作用。其中，P53、APC、C-myc和K_ras基因突变与消化道肿瘤发生息息相关。打破传统，从肿瘤标记物入手，寻找并建立准确、快速的用于肿瘤临床早期诊断的方法势在必行。外周静脉血液具有容易采集及携帯大量遗传信息等优点是作为早期诊断较为合适的检测对象。采用毛细管电泳技术结合单链构象多态分析方法检测外周静脉血液中消化道肿瘤发生发展相关基因来实现消化道肿瘤早期诊断是有据可依的。毛细管电泳(CE)是ー种新型电泳与色谱相结合的分离分析技术，具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、应用范围广等特点。近年来，CE与各种基因突变检测技术例如SSCP (单链构象多态性检測)、RFLP (限制性内切酶片段长度多态性)相结合时，在突变基因检测方面显示了无可比拟的优越性。在1984 2010年中国专利数据库中记载了申请号为03824891. 3的中国专利《诊断结肠癌和消化道肿瘤的方法》、申请号为200510049824.9的中国专利《一种从血清中早期检测消化道肿瘤的方法》、申请号为200610088963. 7的中国专利《一种用于消化道肿瘤诊断的药物及其制备方法》、申请号为200610030119. 9的中国专利《消化道肿瘤辅助诊断的基因序列及其应用》申请号为200810043822. 2的中国专利《ー种消化道肿瘤诊断方法》、申请号为03108102.9的中国专利《ー种消化道肿瘤荧光诊断试剂》、申请号为98803363.1的中国专利《早期消化道肿瘤的诊断》，上述专利仅仅公开了采用质谱检测血清中蛋白质组成的指纹图谱，采集生物学信息进行分析、采用基因序列和基因芯片试剂盒，辅助诊断消化道肿瘤、采用抗原抗体特异结合后，采用核医学影像技术对肿瘤定位、采用荧光诊断试剂配合胃镜及病理切片诊断消化道肿瘤、通过检测尿液中目标分子蛋白含量等技术进行消化道肿瘤临床诊断。上述方法仍然无法打破早期诊断的瓶颈。而通过采用毛细管电泳结合SSCP、RFLP用于检测血液中相关特异基因突变而实现消化道肿瘤临床早期诊断却未见文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供ー种简便、易行，达到预警目的的用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法。为解决上述问题，本发明所述的一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，包括以下步骤
⑴毛细管柱内壁修饰将内径为5(T75um的毛细管内壁用O. 15 O. 2mol/L NaOH清洗后，依次将Y -甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷/甲醇溶液和质量浓度为3. 4%丙烯酰胺单体溶液充填入毛细管柱内进行共价涂层修饰；
⑵含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入IXTBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2. 5^3. 5%、pH值为7. 5^9. O后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用
O.22、. 45um水系微孔滤膜过滤后，所得滤液即为聚环氧乙烷筛分介质；
⑶血液样品收集分别收集临床消化道肿瘤患者及正常健康体检患者外周静脉血液样品2 3ml，该收集血液样品全部采用pH值为8. O且2 mmol/L的EDTA抗凝，_80°C分装保存；
⑷血液样品中基因组DNA提取在所述步骤⑶中所得的血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55 57°C水浴孵育2飞h ;孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，得到沉淀DNA ;该沉淀DNA经室温自然干燥，即得基因组DNA ；
所述Tris缓冲液I与所述血液样品的体积比为1:2 3 ;所述Tris缓冲液II与所述血液样品的体积比为1:0. 5^1 ;所述蛋白酶K与所述血液样品的体积比为1:0. 03、. 05 ;所述酚-氯仿与所述血液样品的体积比为1:广1. 5 ;所述无水乙醇与所述血液样品的体积比为I 1. 5 2. O ；
(5)需检测基因目的片段扩增将所述基因组DNA作为扩增模板，采用pp5分别设计p53、k-ras、APC和C-myc基因目的片段扩增引物，针对同一所述血液样品中的不同基因进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品、APC基因PCR扩增样品和C-myc基因PCR扩增样品；
(6)样品处理将所述p53基因PCR扩增样品、所述k-ras基因PCR扩增样品、所述APC基因PCR扩增样品或所述C-myc基因PCR扩增样品分别进行变性，经94、7°C变性8 10min后，冰浴5 lOmin，得到变性DNA样品溶液；
或分别在所述P53基因PCR扩增样品、所述k-ras基因PCR扩增样品、所述APC基因PCR扩增样品和所述C-myc基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液、内切酶，其中P53基因加入的内切酶为248密码子Msp I或282密码子Sma I，k_ras基因加入的内切酶为BstN I，APC基因加入的内切酶为Rsa I，Ciyc基因加入的内切酶为EcoR V ;在37°C孵育4 8h，在80°C灭活15 20min后，得到酶切DNA样品溶液；所述PCR扩增样品、三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1:1. 5^1. 8 :0. 2^0. 3 ;所述PCR扩增样品与内切酶的体积比为1:
O.Γ0. 2 ；
(7)样品检测取所述变性DNA样品溶液或所述酶切DNA样品溶液17 22ul，加入
10 X SYBR Green I荧光染料，混匀后再分别加入去离子水至体系为30 50 μ I ;然后，使用毛
细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为l(T20kv、温度为15 201的条件下采用负极-1Okv电动进样的方式进行高效毛细管电泳-单链构象多态性或高效毛细管电泳-限制性片段长度多态性检测；(8)统计所述步骤(7)中检测结果，计算p53、APC、C-myc和K_ras基因高效毛细管电泳-单链构象多态性(CE-SSCP)或高效毛细管电泳-限制性片段长度多态性(CE -RFLP)检测突变率之和，即得累积突变率。所述步骤⑴中的Y-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS)/甲醇溶液是指将Y-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷与甲醇按体积比为1:1混合所得。所述步骤⑴中的丙烯酰胺単体溶液是指将3. 4g丙烯酰胺溶于IOOml三蒸水所得。所述步骤⑵中IXTBE缓冲液是指将在800毫升去离子水中分别加入三羟甲基氨基甲烷10. 8克、硼酸5. 5克、こニ胺四こ酸ニ钠盐0. 74克经搅拌溶解后，加去离子水将溶液定容至IL所得的缓冲液。所述步骤⑷中的Tris缓冲液I是指由pH值为8. 0且10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8. 0且2 mmol/L的EDTA和25 mL /L的聚こニ醇辛基苯基醚混合而成的缓冲液。所述步骤⑷中的Tris缓冲液II是指由pH值为8.0且10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L 的氯化钾、10mmol/L 的氯化镁、pH 值为 8. 0 且 2 mmol/L 的 EDTA、0. 4 mol/L氯化钠和10 g/L十二烷基硫酸钠混合而成的缓冲液。所述步骤⑷中的酚-氯仿是指将饱和酚与氯仿等体积混合所得的溶液。所述步骤(5)中的扩增条件为94°C变性30 s，5(T60°C退火30 s，72°C延伸30 S，共行30个循环。所述步骤(6)中的Tango缓冲液是指由33 mM三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐、10 mM醋酸镁、66 mM醋酸钾、0.1 mg/ml N，0-双三甲娃基こ酰胺混合后,加去离子水定容至I升所得的缓冲液；所述三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐的PH值为7. 9，温度为37° C。所述步骤(7)中10X SYBR Green I荧光染料与所述变性DNA样品的体积比为1:3 1:4。本发明与现有技术相比具有以下优点1、本发明采用高效毛细管电泳-单链构象多态性分析或毛细管电泳-限制性片段长度多态性分析方法结合高灵敏度激光诱导荧光检测器检测基因突变，可同时检测p53、APC、K-ras和C-myc四种基因突变，累积突变检出率达83. 4%。2、本发明选取消化道肿瘤患者外周静脉血液样品作为消化道肿瘤早期诊断检测对象，采用毛细管电泳结合SSCP、RFLP突变检测技术，通过检测消化道肿瘤患者外周静脉血液中基因突变来辅助消化道肿瘤临床早期诊断，打破了传统检测手段，从而做到早发现、早治疗，提高患者愈后生命质量。3、本发明采用的检测方法以含有IXTBE缓冲液的聚环氧こ烷(PEO)作为筛分介质，具有良好分离效能。同时结合高灵敏度激光诱导荧光检测器，可完成对同一患者血液样品中p53、APC、K-ras和C-myc突变基因的检测(參见图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11)。另外，选用了 10XSYBR green I作为荧光染料，有效提高了检测的灵敏度。4、本发明操作简单、重现性好，可起到消化道肿瘤诊断预警的作用。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细的说明。图1为本发明实施例1的毛细管电泳图。图2为本发明实施例2的毛细管电泳图。图3为本发明实施例2的毛细管电泳图。图4为本发明实施例2的毛细管电泳图。图5为本发明实施例2的毛细管电泳图。图6为本发明实施例3的毛细管电泳图。 图7为本发明实施例3的毛细管电泳图。图8为本发明实施例4的毛细管电泳图。图9为本发明实施例4的毛细管电泳图。图10为本发明实施例5的毛细管电泳图。图11为本发明实施例5的毛细管电泳图。
具体实施例方式实施例1 一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，用于PBR322/BsuRIDNA Marker 的分离。⑴毛细管柱内壁修饰
将内径为5(T75um的毛细管内壁用O. 15 O. 2mol/L NaOH清洗后，分别依次将γ-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS) /甲醇溶液和浓度为3. 4%丙烯酰胺单体溶液充填入毛细管柱内进行共价涂层修饰。其中
Y-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS)/甲醇溶液是指将Y -甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷与甲醇按体积比为1:1混合所得。丙烯酰胺单体溶液是指将3. 4g丙烯酰胺溶于IOOml三蒸水所得。(2)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制
将聚环氧乙烷加入I XTBE缓冲液中，使最终溶液浓度为3. 0%、pH值为8. 3后，并用河南巩义市予华仪器有限责任公司生产的DF-101S型磁力搅拌器以400转/分钟的速率搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用O. 45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。其中1 XTBE缓冲液是指将在800毫升去离子水中分别加入上海生物工程公司生产的三羟甲基氨基甲烷(Tris) 10. 8克、上海生工公司生产的硼酸5. 5克、上海生工公司生产的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)O. 74克经搅拌溶解后，加去离子水将溶液定容至I升所得的缓冲液。该方法在分离PBR322/BsuRI DNA Marker中的应用，包括以下步骤
①使用毛细管电泳仪(P/ACE 5000，美国Beckman公司)，在分离时使用压力为10 psi(磅/平方英寸)的压力系统自动填充含TBE的聚环氧乙烷筛分介质。②将10 X SYBR Green I的荧光染料(厦门百信威公司提供)与PBR322/BsuRI DNAMarker (BBI公司提供)按4 :1的体积比混匀，然后加入去离子水至体系为3(T50iU，以-1OKV负极电动进样10s。③在分离电压为15kV、电泳温度为15°C下进行电泳分离。其分离电泳图參见图1,共得到19个色谱峰。图中I为Ilbp ;2为18bp ;3为51bp ；4 为 57 ;5 为 64bp ；6 为 80bp ；7 为 89bp ；8 为 104bp ；9 为 123，124bp ；10 为 184bp ;11 为192bp; 12 为 213bp ；13 为 234bp ；14 为 267bp ；15 为 434 ；16 为 458bp ；17 为 502bp ；18 为540bp; 19为587bp共19个色谱峰。从图中可以看出，该方法对不同长度DNA片段进行了良好的分离，甚至是相差IbpDNA片段也得到分离。实施例2 —种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，包括以下步骤 ⑴毛细管柱内壁修饰同实施例1。
⑵含TBE的聚环氧こ烷筛分介质的配制
将聚环氧こ烷加入IXTBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2. 5%、pH值为8. 0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0. 22um水系微孔滤膜过滤后，所得滤液即为聚环氧こ烷筛分介质。其中I X TBE缓冲液同实施例1。⑶血液样品收集分别收集临床消化道肿瘤患者及正常健康体检患者外周静脉血液样品2 3ml，收集血液样品全部采用pH值为8. 0且2 mmol/L的EDTA抗凝，_80°C分装保存。(正常健康体检者检测结果为阴性，选择正常健康体检者目的在于做对照实验。)
⑷血液样品中基因组DNA提取
在步骤⑶中所得的血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55°C水浴孵育4h ;孵育结束后加入酹-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水こ醇，冰浴lh, IOOOOrmp离心2min,得到沉淀DNA ;该沉淀DNA经室温自然干燥，即得基因组DNA。Tris缓冲液I与血液样品的体积比为1:2 ；Tris缓冲液II与血液样品的体积比为1:0. 5 ;蛋白酶K与血液样品的体积比为1:0. 03 ;酚-氯仿与血液样品的体积比为1:1 ;无水こ醇与血液样品的体积比为1:1. 5。Tris缓冲液I是指由pH值为8. 0且10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8. 0且2 mmol/L的EDTA和25 mL /L的聚こニ醇辛基苯基醚(Triton X-100)混合而成的缓冲液。Tris 缓冲液 II 是指由 pH 值为 8. 0 且 10 mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8. 0且2 mmol/L的EDTA、0. 4 mo I/L氯化钠和10g/L十二烷基硫酸钠(SDS)混合而成的缓冲液。酚-氯仿是指将饱和酚与氯仿等体积混合所得的溶液。(5)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品。其中扩增条件为94°C变性30 s，5(T60°C退火30 s，72°C延伸30 S，共行30个循环。(6)样品处理将p53基因PCR扩增样品22ul，在96°C变性lOmin，立即冰浴5min，得到变性DNA样品溶液。(7)样品检测在20ul变性DNA样品溶液中加入10XSYBR Green I荧光染料，
10 X SYBR Green I荧光染料与变性DNA样品的体积比为1:3。混匀后加入去离子水至体系
为3(Γ50μ I ;然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为13kv、温度为15°C的条件下采用负极-1Okv电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可。其分离电泳图参见图2、图3、图4、图5。图2、图3分别为p53基因第248位密码子正常对照和消化道肿瘤样品CE-SSCP检测电泳图；图4、图5分别为p53基因第282位正常对照和消化道肿瘤样品CE-SSCP检测电泳图。图中I为未变性完全双链DNA，2，3为变性所得正常单链DNA，4为变性所得异常单链DNA。
从图中可以看出，本发明对双链DNA、单链DNA均能得到良好的分离。(8)统计步骤(7)中检测结果，计算P53基因CE-SSCP检测突变率之和，即得累积突变率。实施例3 —种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，包括以下步骤
⑴毛细管柱内壁修饰同实施例1。(2)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入IXTBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2. 5%、pH值为7. 5后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用O. 22um水系微孔滤膜过滤后，所得滤液即为聚环氧乙烷筛分介质。其中I X TBE缓冲液同实施例1。⑶血液样品收集分别收集临床消化道肿瘤患者及正常健康体检患者外周静脉血液样品2 3ml，收集血液样品全部采用pH值为8. O且2 mmol/L的EDTA抗凝，_80°C分装保存。 ⑷血液样品中基因组DNA提取
在步骤⑶中所得的血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，56°C水浴孵育2h ;孵育结束后加入酹-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴lh, IOOOOrmp离心2min,得到沉淀DNA ;该沉淀DNA经室温自然干燥，即得基因组DNA。Tris缓冲液I与血液样品的体积比为1:2. 5 ; Tris缓冲液II与血液样品的体积比为1:0. 55 ;蛋白酶K与血液样品的体积比为1:0. 04 ;酚_氯仿与血液样品的体积比为1:1.2 ;无水乙醇与血液样品的体积比为1:1. 7。Tris缓冲液1、Tris缓冲液I1、酹-氯仿同实施例2。(5)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计APC基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得APC基因PCR扩增样品。其中扩增条件同实施例2。(6)样品处理取APC基因PCR扩增样22ul，在94°C变性9min，立即冰浴7min，得到变性DNA样品溶液。
(7)样品检测在17ul变性DNA样品溶液中加入10XSYBR Green I荧光染料，
10 X SYBR Green I荧光染料与变性DNA样品的体积比为1:3. 5。混匀后加入去离子水至体
系为3(T50 u I ;然后，使用毛细管电泳仪压カ系统自动填充所述聚环氧こ烷筛分介质，在分离电压为10kv、温度为20°C的条件下采用负极-1Okv电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可。分离电泳图參见图6、图7。图6、图7分别为APC基因正常对照和肿瘤样品CE-SSCP检测电泳图；图中I为未变性完全双链DNA，2，3为变性所得正常单链DNA，4，5为变性所得异常单链DNA。从图中可以看出，本发明对双链DNA、单 链DNA均能得到良好的分离。(8)统计步骤(7)中检测结果，计算APC基因CE-SSCP检测突变率之和，即得累积突变率。实施例4 一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，包括以下步骤 ⑴毛细管柱内壁修饰同实施例1。⑵含TBE的聚环氧こ烷筛分介质的配制将聚环氧こ烷加入IXTBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2. 5%、pH值为7. 5后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0. 22um水系微孔滤膜过滤后，所得滤液即为聚环氧こ烷筛分介质。其中I X TBE缓冲液同实施例1。⑶血液样品收集分别收集临床消化道肿瘤患者及正常健康体检患者外周静脉血液样品2 3ml，收集血液样品全部采用pH值为8. 0且2 mmol/L的EDTA抗凝，_80°C分装保存。⑷血液样品中基因组DNA提取
在步骤⑶中所得的血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，56°C水浴孵育2h ;孵育结束后加入酹-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水こ醇，冰浴lh, IOOOOrmp离心2min,得到沉淀DNA ;该沉淀DNA经室温自然干燥，即得基因组DNA。Tris缓冲液I与血液样品的体积比为1:2. 5 ; Tris缓冲液II与血液样品的体积比为1:0. 55 ;蛋白酶K与血液样品的体积比为1:0. 04 ;酚_氯仿与血液样品的体积比为1:1. 2 ;无水こ醇与血液样品的体积比为1:1. 7。Tris缓冲液1、Tris缓冲液I1、酹-氯仿同实施例2。(5)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计k_ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得k-ras基因PCR扩增样品。其中扩增条件同实施例2。(6)样品处理取k-ras基因PCR扩增样品22ul，在94°C变性9min，立即冰浴7min，得到变性DNA样品溶液。(7)样品检测在17ul变性DNA样品溶液中加入10XSYBR Green I荧光染料，10 X SYBR Green I荧光染料与变性DNA样品的体积比为1:3. 5。混匀后加入去离子水至体
系为3(Γ50 μ I ;然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10kv、温度为20°C的条件下采用负极-1Okv电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可。(8)统计步骤(7)中检测结果，计算k-ras基因CE-SSCP检测突变率之和，即得累积突变率。实施例5 —种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，包括以下步骤
⑴毛细管柱内壁修饰同实施例1。(2)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入IXTBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2. 5%、pH值为7. 5后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用O. 22um水系微孔滤膜过滤后，所得滤液即为聚环氧乙烷筛分介质。其中I X TBE缓冲液同实施例1。⑶血液样品收集分别收集临床消化道肿瘤患者及正常健康体检患者外周静脉血液样品2 3ml，收集血液样品全部采用pH值为8. O且2 mmol/L的EDTA抗凝，_80°C分装保存。⑷血液样品中基因组DNA提取
在步骤⑶中所得的血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，56°C水浴孵育2h ;孵育结束后加入酹-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴lh, IOOOOrmp离心2min,得到沉淀DNA ;该沉淀DNA经室温自然干燥，即得基因组DNA。Tris缓冲液I与血液样品的体积比为1:2. 5 ; Tris缓冲液II与血液样品的体积比为1:0. 55 ;蛋白酶K与血液样品的体积比为1:0. 04 ;酚_氯仿与血液样品的体积比为1:1.2 ;无水乙醇与血液样品的体积比为1:1. 7。Tris缓冲液1、Tris缓冲液I1、酹-氯仿同实施例2。(5)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计C-myc基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得C-myc基因PCR扩增样品。其中扩增条件同实施例2。(6)样品处理取Ciyc基因PCR扩增样品22ul，在97°C变性8min，立即冰浴IOmin，得到变性DNA样品溶液。(7)样品检测在17ul变性DNA样品溶液中加入10XSYBR Green I荧光染料，
10 X SYBR Green I荧光染料与变性DNA样品的体积比为1:3. 5。混匀后加入去离子水至体
系为3(Γ50 μ I ;然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10kv、温度为20°C的条件下采用负极-1Okv电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可。(8)统计步骤(7)中检测结果，计算C-myc基因CE-SSCP检测突变率之和，即得累积突变率。
实施例6 —种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，包括以下步骤 ⑴毛细管柱内壁修饰同实施例1。(2)含TBE的聚环氧こ烷筛分介质的配制将聚环氧こ烷加入I XTBE缓冲液中，使最终溶液浓度为3. 5%、pH值为9. 0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0. 45um水系微孔滤膜过滤后，所得滤液即为聚环氧こ烷筛分介质。其中IXTBE缓冲液同实施例1。⑶血液样品收集分别收集临床消化道肿瘤患者及正常健康体检患者外周静脉血液样品2 3ml，收集血液样品全部采用pH值为8. 0且2 mmol/L的EDTA抗凝，_80°C分装保
存。 ⑷血液样品中基因组DNA提取在步骤⑶中所得的血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，57°C水浴孵育6h ;孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水こ醇，冰浴lh, IOOOOrmp离心2min,得到沉淀DNA ;该沉淀DNA经室温自然干燥，即得基因组DNA。Tris缓冲液I与血液样品的体积比为1:3 ； Tris缓冲液II与血液样品的体积比为1:1 ;蛋白酶K与血液样品的体积比为1:0. 05 ;酚_氯仿与血液样品的体积比为1:1.5 ;无水こ醇与血液样品的体积比为1:2. O。Tris缓冲液1、Tris缓冲液I1、酹-氯仿同实施例2。(5)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计k_ras目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得k-ras基因PCR扩增样品。其中扩增条件同实施例2。(6)样品处理
在k-ras基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液及BstN I内切酶，在37°C孵育4 8h，在80°C灭活15 20min后，得到酶切DNA样品溶液。k-ras基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1:1. 8 0. 3 ；k-ras基因PCR扩增样品与BstN I内切酶的体积比为1:0. 2。Tango缓冲液是指由33 mM三(轻甲基)氨基甲烧醋酸盐、10 mM醋酸镁、66 mM醋酸钾、0.1 mg/ml N，0-双三甲硅基こ酰胺混合后，加去离子水定容至I升所得的缓冲液；所述三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐的pH值为7. 9，温度为37° C。(7)样品检测在22ul酶切DNA样品溶液中加入10XSYBR Green I荧光染料，
10 X SYBR Green I荧光染料与酶切DNA样品的体积比为1:4。混匀后加入去离子水至体系
为3(T50ia ;然后，使用毛细管电泳仪压カ系统自动填充所述聚环氧こ烷筛分介质，在分离电压为15kv、温度为18°C的条件下采用负极-1Okv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。其分离电泳图參见图8、图9。图10、图8、图9分别为k-ras基因正常对照和肿瘤样品CE-RFLP检测电泳图。其中图8经酶切所得29bp和133bp两条片段，图9可见由于突变未能酶切开所得的162bp单一片段。
从图中可以看出，本发明对酶切消化道肿瘤及正常对照样品均能得到良好的分离。(8)统计步骤(7)中检测结果，计算κ-ras基因CE-RFLP检测突变率之和，即得累积突变率。实施例7 —种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，包括以下步骤
⑴毛细管柱内壁修饰同实施例1。(2)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入IXTBE缓冲液中，使最终溶液浓度为3. 5%、pH值为9. O后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用O. 45um水系微 孔滤膜过滤后，所得滤液即为聚环氧乙烷筛分介质。其中I X TBE缓冲液同实施例1。⑶血液样品收集分别收集临床消化道肿瘤患者及正常健康体检患者外周静脉血液样品2 3ml，收集血液样品全部采用pH值为8. O且2 mmol/L的EDTA抗凝，_80°C分装保存。⑷血液样品中基因组DNA提取在步骤⑶中所得的血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，57°C水浴孵育6h ;孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴lh, IOOOOrmp离心2min,得到沉淀DNA ;该沉淀DNA经室温自然干燥，即得基因组DNA。Tris缓冲液I与血液样品的体积比为1:3 ;Tris缓冲液II与血液样品的体积比为I 1 ;蛋白酶K与血液样品的体积比为1:0. 05 ;酚-氯仿与血液样品的体积比为1:1. 5 ;无水乙醇与血液样品的体积比为1:2. O。Tris缓冲液1、Tris缓冲液I1、酹-氯仿同实施例2。(5)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，采用PP5设计C-myc基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得C-myc基因PCR扩增样品。其中扩增条件同实施例2。(6)样品处理在C-myc基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，及EcoR V内切酶，在37°C孵育4 8h，在80°C灭活15 20min后，得到酶切DNA样品溶液。C-myc基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1:1. 6 :0. 25 ；C-myc基因PCR扩增样品与EcoR V内切酶的体积比为1:0.1。(7)样品检测在17ul酶切DNA样品溶液中加入10XSYBR Green I荧光染料，
10 X SYBR Green I荧光染料与酶切DNA样品的体积比为1:3。混匀后加入去离子水至体系
为3(Γ50μ I ;然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10kv、温度为20°C的条件下采用负极-1Okv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。其分离电泳图参见图10、图11。图10、图11分别为C-myc基因正常对照和肿瘤样品CE-RFLP检测电泳图；其中图10经酶切所得83bp和105bp两条片段，图11可见由于突变未能酶切开所得的188bp单一片段。从图中可以看出，本发明对酶切消化道肿瘤及正常对照样品均能得到良好的分离。(8)统计步骤(7)中检测結果，计算C-myc基因CE-RFLP检测突变率之和，即得累积突变率。实施例8 一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，包括以下步骤 ⑴毛细管柱内壁修饰同实施例1。(2)含TBE的聚环氧こ烷筛分介质的配制将聚环氧こ烷加入IXTBE缓冲液中，使最终溶液浓度为3. 0%、pH值为8. 5后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0. 40um水系微孔滤膜过滤后，所得滤液即为聚环氧こ烷筛分介质。
其中IXTBE缓冲液同实施例1。⑶血液样品收集分别收集临床消化道肿瘤患者及正常健康体检患者外周静脉血液样品2 3ml，收集血液样品全部采用pH值为8. 0且2 mmol/L的EDTA抗凝，_80°C分装保存。⑷血液样品中基因组DNA提取在步骤⑶中所得的血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，57°C水浴孵育6h ;孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水こ醇，冰浴lh, IOOOOrmp离心2min,得到沉淀DNA ;该沉淀DNA经室温自然干燥，即得基因组DNA。Tris缓冲液I与血液样品的体积比为1:3 ；Tris缓冲液II与血液样品的体积比为I 1 ;蛋白酶K与血液样品的体积比为1:0. 05 ;酚-氯仿与血液样品的体积比为1:1. 5 ;无水こ醇与血液样品的体积比为1:2. O。Tris缓冲液1、Tris缓冲液I1、酹-氯仿同实施例2。(5)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品。其中扩增条件同实施例2。(6)样品处理在p53基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，及248密码子Msp I或282密码子Sma I内切酶，在37°C孵育4 8h，在80°C灭活15 20min后，得到酶切DNA样品溶液。p53基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1:1. 5 :0. 2 ；p53基因PCR扩增样品与248密码子Msp I或282密码子Sma I内切酶的体积比为1:0. 15。(7)样品检测在17ul酶切DNA样品溶液中加入10XSYBR Green I荧光染料，
10 X SYBR Green I荧光染料与酶切DNA样品的体积比为1:3。混匀后加入去离子水至体系
为3(T50ia ;然后，使用毛细管电泳仪压カ系统自动填充所述聚环氧こ烷筛分介质，在分离电压为20kv、温度为20°C的条件下采用负极-1Okv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。(8)统计步骤(7)中检测结果，计算P53基因CE-RFLP检测突变率之和，即得累积突变率。实施例9 一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，包括以下步骤⑴毛细管柱内壁修饰同实施例1。(2)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入IXTBE缓冲液中，使最终溶液浓度为3. 5%、pH值为9. O后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用O. 45um水系微孔滤膜过滤后，所得滤液即为聚环氧乙烷筛分介质。其中I X TBE缓冲液同实施例1。⑶血液样品收集分别收集临床消化道肿瘤患者及正常健康体检患者外周静脉血液样品2 3ml，收集血液样品全部采用pH值为8. O且2 mmol/L的EDTA抗凝，_80°C分装保存。⑷血液样品中基因组DNA提取在步骤⑶中所得的血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，57°C 水浴孵育6h ;孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴lh, IOOOOrmp离心2min,得到沉淀DNA ;该沉淀DNA经室温自然干燥，即得基因组DNA。Tris缓冲液I与血液样品的体积比为1:3 ；Tris缓冲液II与血液样品的体积比为I 1 ;蛋白酶K与血液样品的体积比为1:0. 05 ;酚-氯仿与血液样品的体积比为1:1. 5 ;无水乙醇与血液样品的体积比为1:2. O。Tris缓冲液1、Tris缓冲液I1、酹-氯仿同实施例2。(5)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计APC基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得APC基因PCR扩增样品。其中扩增条件同实施例2。(6)样品处理在APC基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，及Rsa I内切酶，在37°C孵育4 8h，在80°C灭活15 20min后，得到酶切DNA样品溶液。APC基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1:1. 6 :0. 25 ；APC基因PCR扩增样品与Rsa I内切酶的体积比为1:0.1。(7)样品检测在17ul酶切DNA样品溶液中加入10XSYBR Green I荧光染料，
10 X SYBR Green I荧光染料与酶切DNA样品的体积比为1:3。混匀后加入去离子水至体系
为3(Γ50μ I ;然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10kv、温度为20°C的条件下采用负极-1Okv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。(8)统计步骤(7)中检测结果，计算APC基因CE-RFLP检测突变率之和，即得累积突变率。本发明中的消化道肿瘤是指胃癌、结肠癌和食道癌。
权利要求
1.一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，包括以下步骤 ⑴毛细管柱内壁修饰将内径为5(T75um的毛细管内壁用0. 15 0. 2mol/L NaOH清洗后，依次将Y -甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷/甲醇溶液和质量浓度为3. 4%丙烯酰胺单体溶液充填入毛细管柱内进行共价涂层修饰； ⑵含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入IXTBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2. 5^3. 5%、pH值为7. 5^9. 0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用.0.22、. 45um水系微孔滤膜过滤后，所得滤液即为聚环氧乙烷筛分介质； ⑶血液样品收集分别收集临床消化道肿瘤患者及正常健康体检患者外周静脉血液样品2 3ml，该收集血液样品全部采用pH值为8.0且2 mmol/L的EDTA抗凝，_80°C分装保存；⑷血液样品中基因组DNA提取在所述步骤⑶中所得的血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55 57°C水浴孵育2飞h ;孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，得到沉淀DNA ;该沉淀DNA经室温自然干燥，即得基因组DNA ； 所述Tris缓冲液I与所述血液样品的体积比为1:2 3 ;所述Tris缓冲液II与所述血液样品的体积比为1:0. 5^1 ;所述蛋白酶K与所述血液样品的体积比为1:0. 03、. 05 ;所述酚-氯仿与所述血液样品的体积比为1:广1. 5 ;所述无水乙醇与所述血液样品的体积比为1:1. 5 2. 0 ； (5)需检测基因目的片段扩增将所述基因组DNA作为扩增模板，采用pp5分别设计p53、k-ras、APC和C-myc基因目的片段扩增引物，针对同一所述血液样品中的不同基因进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品、APC基因PCR扩增样品和C-myc基因PCR扩增样品； (6)样品处理将所述p53基因PCR扩增样品、所述k-ras基因PCR扩增样品、所述APC基因PCR扩增样品或所述C-myc基因PCR扩增样品分别进行变性，经94、7°C变性8 10min后，冰浴5 lOmin，得到变性DNA样品溶液； 或分别在所述P53基因PCR扩增样品、所述k-ras基因PCR扩增样品、所述APC基因PCR扩增样品和所述C-myc基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液、内切酶，其中P53基因加入的内切酶为248密码子Msp I或282密码子Sma I，k_ras基因加入的内切酶为BstN I，APC基因加入的内切酶为Rsa I，Ciyc基因加入的内切酶为EcoR V ;在37°C孵育4 8h，在80°C灭活15 20min后，得到酶切DNA样品溶液；所述PCR扩增样品、三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1:1. 5 1. 8 :0. 2 0. 3 ;所述PCR扩增样品与内切酶的体积比为I .0.1 0. 2 ； (7)样品检测取所述变性DNA样品溶液或所述酶切DNA样品溶液17 22ul，加入10XSYBR GreenI荧光染料，混匀后再分别加入去离子水至体系为3(T50ia ;然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为l(T20kv、温度为15 20°C的条件下采用负极-1Okv电动进样的方式进行高效毛细管电泳-单链构象多态性或高效毛细管电泳-限制性片段长度多态性检测； ⑶统计所述步骤(7)中检测结果，计算p53、APC、C-myc和K_ras基因高效毛细管电泳-单链构象多态性或高效毛细管电泳-限制性片段长度多态性检测突变率之和，即得累积突变率。
2.如权利要求1所述的一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，其特征在于 所述步骤⑴中的Y-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS)/甲醇溶液是指将Y-甲基丙烯酰基-三(甲 氧基)硅烷与甲醇按体积比为1:1混合所得。
3.如权利要求1所述的一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，其特征在于 所述步骤⑴中的丙烯酰胺单体溶液是指将3. 4g丙烯酰胺溶于IOOml三蒸水所得。
4.如权利要求1所述的一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，其特征在于 所述步骤⑵中IXTBE缓冲液是指将在800毫升去离子水中分别加入三羟甲基氨基甲烷10.8克、硼酸5. 5克、乙二胺四乙酸二钠盐O. 74克经搅拌溶解后，加去离子水将溶液定容至 IL所得的缓冲液。
5.如权利要求1所述的一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，其特征在于 所述步骤⑷中的Tris缓冲液I是指由pH值为8. O且10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液、 IOmmoI/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8. O且2 mmol/L的EDTA和25 mL /L的聚乙二醇辛基苯基醚混合而成的缓冲液。
6.如权利要求1所述的一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，其特征在于 所述步骤⑷中的Tris缓冲液II是指由pH值为8. O且10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液、 IOmmoI/L 的氯化钾、10mmol/L 的氯化镁、pH 值为 8. O 且 2 mmol/L 的 EDTA、0. 4 mol/L 氯化钠和10 g/L十二烷基硫酸钠混合而成的缓冲液。
7.如权利要求1所述的一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，其特征在于 所述步骤⑷中的酚-氯仿是指将饱和酚与氯仿等体积混合所得的溶液。
8.如权利要求1所述的一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，其特征在于 所述步骤(5)中的扩增条件为94°C变性30 s，5(T60°C退火30 s，72°C延伸30 S，共行30个循环。
9.如权利要求1所述的一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，其特征在于 所述步骤(6)中的Tango缓冲液是指由33mM三(轻甲基)氨基甲烧醋酸盐、IOmM醋酸镁、66mM 醋酸钾、0. lmg/ml N，O-双三甲硅基乙酰胺混合后，加去离子水定容至I升所得的缓冲液； 所述三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐的PH值为7. 9，温度为37° C。
10.如权利要求1所述的一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，其特征在于 所述步骤(7)中10XSYBR Green I荧光染料与所述变性DNA样品的体积比为1:3 1:4。
全文摘要
本发明涉及一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，该方法包括以下步骤⑴毛细管柱内壁修饰；⑵配制含TBE的聚环氧乙烷筛分介质；⑶收集血液样品；⑷血液样品中基因组DNA提取；⑸将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5分别设计p53、k-ras、APC和C-myc基因目的片段扩增引物，得到p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品、APC基因PCR扩增样品和C-myc基因PCR扩增样品；⑹将p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品、APC基因PCR扩增样品或C-myc基因PCR扩增样品进行变性或进行内切酶，得到变性DNA样品溶液或酶切DNA样品溶液；⑺变性DNA样品溶液或酶切DNA样品溶液进行CE-SSCP或CE-RFLP检测；⑻计算CE-SSCP或CE-RFLP检测突变率之和，即得累积突变率。本发明操作简单、重现性好，可起到消化道肿瘤诊断预警作用。
文档编号C12Q1/68GK103014158SQ20121051906
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者王荣, 贾正平, 谢华, 谢希晖, 李文斌 申请人:王荣