专利名称：一种水稻抗细菌性条斑病相关基因OsDRxoc6的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗细菌性条斑病相关基因0sDRxoc6的分离克隆和功能验证及应用。0sDRxoc6基因位于水稻细菌性条斑病抗性 QTLqBlsr5a，该基因没有内含子，它是水稻抗病反应中的正调控因子。抑制0sDRXOC6基因表达的转基因植株对水稻细菌性条斑病的抗性水平显著降低，而超量表达该基因的转基因植株抗病能力显著提高。
背景技术：
植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。
植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两类(I)抗病基因，又称R (resistance)基因和(2)抗病相关基因。
根据目前人们对抗病基因功能的认识，这类基因的产物主要是作为受体，直接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Tang等，1996 ；Baker等， 1997 ；Jia等，2000 ；Dangl和Jones, 2001 ；Nimchuk等，2001);抗病基因介导的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但迄今为止尚未从水稻体内克隆到一个主效抗病基因来抵抗水稻细菌性条斑病菌(简称水稻条斑病菌)的侵染，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制； 目前仅从玉米B73中克隆得到了一个与水稻条斑病菌无毒基因avrRxol相对应的抗性基因 Rxol (Zhao等，2004)，抗病基因的资源特别有限。此外，由于病原的快速突变，一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。
抗病相关基因是指除抗病基因外所有参于抗病反应的基因，它们的编码产物参于合成植物体内抗病信号分子、参于信号传导、阻止信号传导或参于防卫反应等。这类基因在植物体内表达量的升高或减少与植物的抗病性相关联。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小，尤其是抗性QRL需要多个微效抗病相关基因共同作用起到抗病的效果。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源(1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因是具有持久抗性的基因资源；(2)大多数抗病相关基因参与的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；(3)这类基因的资源丰富。目前鉴定的许多抗性相关基因如0sWRKY13，0sDR8, GH3-8，0sMPK6等，这些基因在各自的QTL 中均发挥着重要的作用(Wang等，2010)。现在，对于水稻条斑病的抗性研究，科学家更多的精力集中在水稻条斑病抗性数量位点(QTL)的发掘上。比如，水稻5号染色体短臂上的抗性QTL qBlsr5a的精细定位有可能在水稻条斑病抗性的遗传改良上具有较大的应用前景 (韩庆典等，2008)。水稻中虽然鉴定了很多抗细菌性条斑病的相关数量位点(QTL)(李小辉， 2005 ;邓云，2007)，但是，这些基因在水稻抗病反应中的作用机理、以及单个抗病相关基因是否会引起水稻抗病表型的改变都不清楚。抗性QTL qBlsr5a的精细定位有可能为抗条斑病带来很好的契机，L0C_05g01380和L0C_05g01444基因是此QTL的两个重要的候选基因， 预测对QTL qBlsr5a的抗病贡献更大(韩庆典等，2008)，但其功能作用有待进一步考证。
水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。因此，了解病害的发病机制，有助于利用高效途径改良水稻品种的抗性，控制病害的发生，减少或避免植物病害所带来的损失。
分离克隆抗病相关基因是对水稻抗病机理研究的前提。同时，与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过超量表达作为抗病反应正调控因子的抗病相关基因的功能进行水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性， 拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。因此如何获得一种切实可靠的水稻抗细菌性条斑病相关基因成为亟待解决的问题之一。发明内容
本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一个水稻抗细菌性条斑病相关基因编码序列，编码核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示,该编码序列所在的基因0sDRxoc6,其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，以及该基因的分离克隆方法和功能验证及应用，该OsDRxoce基因位于水稻细菌性条斑病抗性 QTL qBlsr5a，该基因没有内含子，它是水稻抗病反应中的正调控因子。发明人还发现抑制 0sDRxoc6基因表达的转基因植株对水稻细菌性条斑病的抗性水平显著降低，而超量表达该基因的转基因植株抗病能力显著提高。
发明人首先提供了一个从水稻中分离获得的水稻抗细菌性条斑病相关基因 0sDRxoc6,其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。更进一步的,发明人发现其中的DNA编码序列SEQ ID NO. 2所示，该基因的编码序列由930个核苷酸组成，没有内含子。对上述序列进行分析表明它是一个编码多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的水稻基因，其所编码的氨基酸序列如序列表SEQ IDN0. 3所示，共编码309个氨基酸。
发明人还发现，除了上述的相关基因0sDRXOC6，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示之外，其核苷酸序列基本上相当于SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，或者其功能相当于SEQ ID NO. I所示序列的亚片段也具有与之类似的功能,如超量表达序列表SEQ ID NO. I所示序列可以增强水稻对条斑病的抗性。
同理，在SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列；或在SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个氨基酸或其他的同源序列而生成的具有相同功能的氨基酸序列或衍生物，也具有与上述相同的功能。
更进一步的一种蛋白质或其功能类似物，其氨基酸序列与SEQ ID No. 3所示，或在 SEQ IDNo. 3所示的氨基酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个氨基酸或其他的同源序列而生成的具有相同功能的氨基酸序列或衍生物，也是具有上述的功能的。
同时本发明的发明人提供了上述基因的分离方法，同时还可以采用已经克隆的本发明所提供的OsDRxoce基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明的基因或同源基因。同样，米用PCR (polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsDRxoce基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsDRxoce基因的序列或者包含一段OsDRxoce基因的序列， 将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞超量表达其自身的0sDRXOC6基因，产生抗病转基因植物。采用这种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到的。
综上所述，本发明的发明人在国际上首次提供了一个水稻抗细菌性条斑病相关基因0sDRXOC6，以及该基因的分离克隆方法和功能验证及应用。该0sDRXOC6基因没有内含子，它是水稻抗病反应中的正调控因子，该基因的DNA编码序列SEQ ID NO. 2包含在如序列表SEQ IDN0. I所示的片段中或者基本上相当于SEQ ID NO. I所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ IDN0. I所示序列的亚片段。发明人还通过利用超表达和RNA干扰技术RNA interference, RNAi)使目标基因在植物体内过量表达和沉默，来鉴定该基因在抗病反应过程中所起作用，最终发现抑制表达0sDRXOC6基因的转基因植株对水稻细菌性条斑病的抗性水平明显降低，而超量表达该基因的转基因植株抗病能力显著提高。
图I.本发明分离水稻抗细菌性条斑病相关基因0sDRxoc6以及验证0sDRxoc6基因功能的流程图2. 0sDRxoc6基因在感病品种ZHll和抗病品种Acc8558中的本底表达水平差异示意图；图中可见Acc8558中基因的表达量明显高于ZHll体内的表达量；
图3. 0sDRxoc6基因在抗病品种Acc8558中接种条斑病菌RS105后的表达模式分析不意图；图中可见接菌8h后基因的表达量最闻；
图4. 0sDRxoc6基因在感病品种ZHll中接种RS105后的表达模式分析示意图；图中可见接种8h时基因表达量最高，24h和48h时也表现出很高的诱导表达水平；
图5. 0sDRxoc6基因抑制片段在中花11基因组DNA中的PCR分离扩增示意图；其中获得目的基因抑制表达条带大小570bp，M为Marker 2000 ；
图6. 0sDRxoc6基因完整片段在Acc8558基因组DNA中的PCR分离扩增示意图；其中超量表达条带大小1151bp, M为Marker 2000 ；
图7. 0sDRxoc6基因抑制载体的构建，改造后携带表达0sDRxoc6双链RNA片段 (570bp)的 pCAMIA1301 载体，即表达载体 DS1301: :0sDRxoc6。RB 和 LB 代表 pCAMIA1301 载体(Sun等，2004)上的T-DNA右和左边界；⑶S代表pCAMIA1301载体上的β —葡萄糖苷酸酶基因(标记基因)；Hpt代表潮霉素磷酸转移酶基因(筛选基因)；35S代表pMCG161载体构件上的花椰菜花叶病毒启动子；AdhI代表pMCG161载体构件上的玉米乙醇脱氢酶基因内含子I ;0CS代表pMCG161载体构件上的章鱼碱合成酸基因终止子；Waxy-a代表pMCG161载体构件上的水稻Waxy基因内含子。
图8. 0sDRxoc6基因超量表达载体的构建，携带完整0sDRxoc6基因的表达载体 PU1301,即重组表达载体pU1301: :0sDRxoc6。RB和LB代表PU1301载体上的T-DNA右和左边界；OTS代表PU1301载体上的β —葡萄糖苷酸酶基因(标记基因)；Hpt代表潮霉素磷酸转移酶基因(筛选基因)；Ubiquitin promoter代表玉米泛素超量表达启动子；Terminator 代表PU1301载体上转录的终止端。
图9. 0sDRxoc6基因表达载体的双酶切检测，抑制表达载体DS1301: : 0sDRxoc6第一链构建的双酶切检测，用KpnI和BamHI双酶切得到目的基因片段，M为Marker 2000 ；
图10. 0sDRxoc6基因表达载体的双酶切检测，抑制表达载体DS1301: :0sDRxoc6用 SpeI和SacI双酶切检测的第二链构建，M为Marker 2000 ；
图11. 0sDRxoc6基因表达载体的双酶切检测，超量表达载体PU1301: :0sDRxoc6 构建的双酶切检测，用KpnI和BamHI双酶切得到完整的超量目的基因片段，M为Marker 2000 ；
图12. 0sDRxoc6基因表达载体的Acc8558和中花11水稻品种的遗传转化植株结果示意灰度图中(A)Acc8558水稻材料的诱导愈伤和导入抑制表达载体DS1301: : 0sDRxoc6 的Acc8558转基因苗，即⑶45R ； (B)中花11水稻品种的愈伤组织和导入抑制表达载体 DS1301: :0sDRxoc6的中花11转基因苗，即CD44R ； (C)中花11水稻品种的愈伤组织和转入超量表达载体TO1301: :0sDRxoc6的中花11转基因苗，即CD43R。
图13.为含抑制表达载体DS1301: :0sDRxoc6的Acc8558遗传转化植株(CD45R)部分阳性植株的PCR检测示意图14.为含抑制表达载体DS1301: :0sDRxoc6的中花11遗传转化植株(CD44R)部分阳性植株的PCR检测示意图15.为含超量表达载体pU1301: :0sDRxoc6的中花11遗传转化植株(CD43R)部分阳性植株的PCR检测示意图16.为pU1301: :0sDRxoc6的中花11转化植株(CD43R)阳性植株的GUS染色检测结果示意灰度图17-22.阳性TO代遗传转化植株和野生型植株接菌后病斑检测以及用 Real-timeRT-PCR技术检测0sDRxoc6基因在对照材料和TO代遗传转化阳性植株中的表达量的结果示意图；Acc8558和中花11阳性TO代遗传转化植株(CD43R、CD44R和CD45R)接种水稻细菌性条斑病菌RS105，两周后形成的病斑与野生型植株(对照)相比，具有显著差异；
图17中Acc8558 TO代阳性遗传转化植株CD45R的病斑明显长于野生Acc8558，即抗病水平降低；
图18中0sDRxoc6基因在⑶45R阳性植株中表达量明显受到抑制；
图19和图21中中花11阳性TO代遗传转化植株⑶43R的株系⑶43R-18的病斑长度显著短于野生型水稻材料中花11，即抗性增强；而CD44R阳性株系的病斑明显长于野生型中花11，表现对病原菌更加敏感；
图20和图22中0sDRxoc6基因在⑶44R和⑶43R典型阳性植株中表达量分别显著降低和提高。
具体实施方式
以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；
实施例I 0sDRxoc6基因结构预测与分析
以0sDRxoc6基因的DNA编码序列SEQ ID No. 2作模板，用BLAST方法检索核苷酸数据库，发现SEQ ID No. 2序列定位在水稻品种日本晴5号染色体的短臂上，与Genebank 预测的L0C_05g01380基因在同一个位点，位于水稻细菌性条斑病抗性QTL qBlsr5a中。根据编码序列SEQ ID No. 2，可获得SEQ ID No. 3的氨基酸序列，由309个氨基酸组成。
实施例2 0sDRxoc6基因在不同水稻品种中的表达模式分析
I. 0sDRxoc6基因在抗病品种Acc8558和感病品种中花11中的本底表达
为检测0sDRxoc6基因在抗感病品种中本底表达水平是否有差异，验证其是否与抗病有关，本发明采用实时定量RT-PCR技术分析了 0sDRXOc6基因在水稻抗病品种 Acc8558和感病品种ZHll中的本底表达差异。取水稻植株叶片抽提总RNA，1-5 μ g总RNA 用DNaseI (Invitrogen,美国)处理30分钟以去除基因组DNA污染，然后参照Zhou (Zhou 等,2002)的方法,使用oligo (dT) 15寡聚引物和SuperScriptII反转录酶(Invitrogen)进行反转录。采用定量PCR分析试剂盒SYBR 'OtK n PCR Master Mix (大连Takara公司),在 ABI7500Real-Time PCR system (Applied Biosystems,美国)上进行定量 RT-PCR 反应，水稻内源肌动蛋白基因Actin的表达量用于RNA样品的均一化评价，利用2_ΛΛετ相对定量的方法比较分析基因表达量(Qiu等，2007)。定量RT-PCR技术中的0sDRxoc6基因特异PCR引物 0sDRxoc6-863F/0sDRxoc6-954R 和肌动蛋白基因 PCR 引物 OsActinFl/OsActinRl 序列详见表I。结果显示，在抗病品种Acc8558中，0sDRxoc6基因的本底表达量要比感病品种ZHl I 的表达量高出11倍以上(如图2)，说明0sDRXOC6有可能与细菌性条斑病抗性相关。
2. 0sDRxoc6基因在不同水稻品种接菌后的表达模式分析
为了进一步证实0sDRXOC6基因参与抗病反应的调控，我们采用上述定量RT-PCR 技术分析了 0sDRXOC6基因在不同水稻品种中接种水稻条斑病菌RS105后的表达模式。细菌性条病菌采用注射的方法进行接种。接种后分不同时间点0h、8h、24h和48h取接种叶片抽提总RNA，按上述方法进行反转录和定量分析。分析结果显示，在接种RS105后8h，0sDRxoc6 基因在Acc8558和ZHll中的表达量达到最高；尤其在感病材料ZHll中，接菌8h时的表达量最高，24h和48h时相较Oh的表达量，仍然有较高的表达水平(图3和图4)。这些结果证实0sDRXOC6基因可能作为抗病反应的正调控基因参与水稻对条斑病的抗性调控。
实施例3 0sDRXOC6基因的分离和植物表达载体的构建
I. 0sDRxoc6 基因的分离
以感病水稻品种中花11的基因组DNA为模板，通过PCR技术，利用引物 0sDRxoc6Fl/0sDRxoc6Rl扩增获得0sDRxoc6基因的部分抑制表达DNA片段，其序列如序列表SEQ ID NO. 4所示(SEQ ID NO. 2序列第11至580bp处)，1%的琼脂糖凝胶电泳检测其大小570bp (图5);以抗病水稻品种Acc8558的基因组DNA为模板，0sDRxoc6F2/0sDRxoc6R2 组合引物扩增完整的超量表达片段，1%的琼脂糖凝胶电泳检测得到大小1151bp目的条带 (图6)，其序列如序列表SEQ ID NO. I所示。引物序列见表I
表I.相关引物序列
权利要求
1.一种水稻抗细菌性条斑病相关基因，其特征在于 其编码核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，或如下所示的核苷酸序列 在SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列； 其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，或如下所示的氨基酸序列 在SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个氨基酸或其他的同源序列而生成的具有相同功能的氨基酸序列或衍生物。
2.根据权利要求I所述的水稻抗细菌性条斑病相关基因，其特征在于该基因为OsDRxoc6，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。
3.根据权利要求I所述的水稻抗细菌性条斑病相关基因，其特征在于该基因的其核苷酸序列基本上相当于SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，或者其功能相当于SEQ ID NO. I所示序列的亚片段。
4.一种蛋白质或其功能类似物，其氨基酸序列与SEQ ID No. 3所示，或在SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个氨基酸或其他的同源序列而生成的具有相同功能的氨基酸序列或衍生物。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一个水稻抗细菌性条斑病相关基因编码序列，编码核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，该编码序列所在的基因OsDRxoc6，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，以及该基因的分离克隆方法和功能验证及应用，该OsDRxoc6基因位于水稻细菌性条斑病抗性QTL qBlsr5a，该基因没有内含子，它是水稻抗病反应中的正调控因子。发明人还发现抑制OsDRxoc6基因表达的转基因植株对水稻细菌性条斑病的抗性水平显著降低，而超量表达该基因的转基因植株抗病能力显著提高。
文档编号C12N15/29GK102978215SQ20121051922
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者丁新华, 储昭辉, 常清乐 申请人:山东农业大学