专利名称：特异分子标记法鉴定烟草 “中烟90” 品种纯度的方法
技术领域：
本发明涉及一种特异分子标记法鉴定烟草“中烟90”品种纯度的方法，属于烟草育种与生物技术领域。
背景技术：
种子是农业最基本的生产资料，种子质量的优劣直接影响农作物的产量和质量。目前主栽烟草品种混杂和种子退化比较严重，给农民带来了巨大的经济损失。开展种子纯度检验对保证种子质量和提高烟草生产效益具有重要意义。
种子纯度是评价烟草种子质量的重要指标之一，目前我国采用的烟草种子纯度鉴定方法主要为常规鉴定法。其中常规鉴定法主要包括种子形态鉴定法、幼苗形态鉴定法、物理化学鉴定法、大田期形态鉴定法。这些方法在烟草种子纯度和品种一致性的检测中起着重要的作用，但是这些方法都有一定的缺陷或局限性，主要为所需费用高、周期长的问题。特别是小区种植鉴定，需5-7个月才能完成，且许多性状受栽培技术及环境因素的影响，其结果会产生偏差，同时鉴定者的观测经验也制约着鉴定结果的准确性。另外，20世纪80年代开始，生化鉴定开始应用到烟草种子纯度，主要包括同工酶电泳、蛋白质电泳、高效液相色谱等方法，这些方法发展很快，检验种子纯度准确性高。但是，这类检测技术成本相对较高，且遗传信息量有限，加上烤烟品种遗传背景狭窄，这些方法揭示品种间的多态性有限，其应用受到了限制。随着分子标记技术的发展，作为育种的辅助工具，具有高效、准确、不受环境影响等特点，其应用越来越受到重视。特别是SSR标记技术，具有结果可靠，重复性好，多态性丰富，操作简单，呈共显性遗传等特点。十分有利于种子纯度检验。只要找到特异的SSR引物，在一个品种中具有特征带，就可以快速鉴定出杂种。“中烟90”是中国农科院烟草科学研究所通过SpeightG-28、单育2号和净叶黄三亲本复合杂交，经分类选择、定向培育的一个具有多抗性且推广面积较大的烤烟新品。通过与“K326”品种作对比试验，试验结果表明，“中烟90”品种具有以下优点1、优质适产。该品种与“K326”对比，平均每亩增加烟叶20干克；2、抗病性明显。“中烟90”对黑胫病、赤星病和气候斑病的抗性比“K326”的强。3、农艺性状好。“中烟90”植株呈筒型，叶为长椭圆形，株高90-120厘米，可留叶21片左右。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种特异分子标记法鉴定烟草“中烟90”品种纯度的方法；目的在于利用主栽烟草品种中的特征SSR引物，提供一种快速、高效鉴定烟草“中烟90”品种纯度的方法。一种特异分子标记法鉴定烟草“中烟90”品种纯度的方法，包括如下步骤(I)设计特异性引物，以烟草品种“中烟90”的基因组DNA (采用CTAB/NaCl法)为模板，得到“中烟90”特征条带，“中烟90”特征条带大小分别为159bp和98bp (图I)。
所述特异性引物为正向引物F 5/ — GAACAGATTGCTGAAACTGAGAGA—3'其序列如 Seq ID No 1 所示；反向引物R 5/ — GATGAGGTGGAGGCACAAG—3'其序列如 Seq ID No :2 所示；(2)进行品种鉴定以待测品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增PCR扩增总体积为15μ 1，具体为 I. 5μ I 的 10 X PCRbuffer, 2. 5mmol/L 的 MgCl2,0. 25mmol/L 的 dNTPs, Taq 酶 I. 0U，模板DNA20-25ng，步骤I)所述的正向和反向引物各O. 36 μ mol/L，不足部分ddH20补足；PCR扩增在MYCYCLE扩增仪上进行，扩增程序为DNA 94°C预变性4min ;94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C复性lmin，35个循环；72°C延伸IOmin ;最后扩增产物4°C保存。(3)对扩增产物进行凝胶电泳扩增产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为I X TBE,电压120V，电泳时间2. 5小时；电泳结束后，凝胶显色采用银染方法，在凝胶成像系统中进行观察、照相。(4)品种的鉴定依据步骤3)中待测样品的凝胶成像，对照步骤I)中“中烟90”的特征条带，若有“中烟90”的特征条带出现的，则为“中烟90”纯种；若无“中烟90”特征条带出现的，则为杂种。
本发明通过大量实验验证得到了扩增出“中烟90”特征条带的特异性引物，利用“中烟90”的特征引物进行纯度检验，检测结果可靠且直观，相比传统的常规检测方法操作简单，检测效率高，成本更低。
图I为本发明设计的特异性引物在9个品种中的扩增结果，其中1.K326 ；2.中烟 90 ;3. NC89 ;4. NC297 ;5.中烟 100;6.翠碧一号；7.红花大金元；8. K346 ;9.云烟 87;M. Marker ;箭头指向为“中烟90”特征带分别为159bp和98bp。图2为“中烟90”品种纯度鉴定，品种顺序如表I中的编号。
具体实施例方式实施例I确定中烟90特征带I、供试材料如表I:表I供试材料
权利要求
1. 一种特异分子标记法鉴定烟草“中烟90”品种纯度的方法，其特征在于包括如下步骤 1)设计特异性引物，以烟草品种“中烟90”的基因组DNA为模板，采用CTAB/NaCl法扩增得到“中烟90”特征条带，“中烟90”特征条带大小分别为159bp和98bp ； 所述特异性引物为 正向引物 F 5/ — GAACAGATTGCTGAAACTGAGAGA— 3'其序列如 Seq ID No 1 所示； 反向引物 R 5/ 一GATGAGGTGGAGGCACAAG— 3'其序列如 Seq ID No 2 所示； 2)进行品种鉴定 以待测品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增PCR扩增总体积为15 μ I，具体为I.5μ I 的 10 X PCRbuffer, 2. 5mmol/L 的 MgC12，0. 25mmol/L 的 dNTPs, Taq 酶 I. 0U,模板DNA20-25ng，步骤I)所述的正向和反向引物各O. 36 μ mol/L，不足部分ddH20补足；PCR扩增在MYCYCLE扩增仪上进行，扩增程序为DNA 94°C预变性4min ;94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C复性lmin，35个循环；72°C延伸IOmin ;最后扩增产物4°C保存； 3)对扩增产物进行凝胶电泳 扩增产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为1XTBE，电压120V，电泳时间2. 5小时；电泳结束后，凝胶显色采用银染方法，在凝胶成像系统中进行观察、照相； 4)品种的鉴定 依据步骤3)中待测样品的凝胶成像，对照步骤I)中“中烟90”的特征条带，若有“中烟90”的特征条带出现的，则为中烟90纯种；若无中烟90特征条带出现的，则为杂种。
全文摘要
本发明涉及一种特异分子标记法鉴定烟草“中烟90”品种纯度的方法，是利用SSR分子标记鉴定烤烟“中烟90”品种的纯度；本发明通过大量实验验证得到了扩增出中烟90特征条带的特异性引物，利用“中烟90”的特征引物进行纯度检验，检测结果可靠且直观，相比传统的常规检测方法操作简单，检测效率高，成本更低。利用本发明检验周期短，即在苗期阶段就可通过本方法检测种子纯度，且标准统一，不受人为以及环境的影响，结果准确可靠。
文档编号C12Q1/68GK102965443SQ20121052925
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者杨龙, 黄莉莎, 王玉军, 曹恒春, 王毅 申请人:山东农业大学