专利名称：集胞藻高效双同源重组载体及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及具体涉及集胞藻高效双同源重组载体及其构建方法与应用，特别涉及一种集胞藻PCC6803遗传转化高效双同源重组载体及其构建方法与在集胞藻PCC6803脂肪酸合成中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
蓝藻(cyanobacteria)又称蓝细菌，是一类能进行光合作用的原核生物。蓝藻细 胞可以利用简单的无机物合成有机物，所表达的外源基因产物不形成包含体，并且多数蓝藻及其提取物对人畜无毒，是转基因研究的良好受体。集胞藻PCC 6803 (Synechocystissp. strainPCC6803)做为一种单细胞蓝藻，具有生长速度快、培养条件简单、不产生毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等特点，适合于利用广核生物反应器大规模生产，是很好的蓝藻基因工程受体。鉴于蓝藻表达的外源基因产物易纯化、不含毒素、藻细胞培养成本低且不容易污染等的优点，随着藻类基因工程的发展，使利用蓝藻作为外源基因表达载体以生产药物等高附加值产品成为可能。蓝藻基因改造大体分为三个阶段第一，外源DNA通过基因转移系统进入宿主细胞；第二，外源DNA在宿主细胞中稳定复制并得以表达；第三，外源DNA与宿主细胞染色体或内源质粒结合，或者在宿主细胞中进行自主复制。外源DNA进入蓝藻细胞在以下几种情况下可以稳定存在首先，外源基因重组进宿主染色体；其次，外源基因重组进宿主内源质粒；第三，外源基因以质粒形式存在并且能自主复制。同源重组分单交换形式和双交换两种类型。其中同源重组双交换载体是在外源基因两侧均有一段与宿主细胞染色体同源的片段，当重组质粒进入宿主细胞后，载体上外源基因两端的同源序列分别与宿主细胞内染色体的相应部位发生交换。这样，重组载体上的外源基因就随着同源序列进而整合进宿主细胞染色体上，载体上其余片段没有进入宿主细胞染色体中。所以，外源基因在外源基因的表达单元自带的调控元件的作用下表达或者在宿主染色体调控下表达。因为同源重组载体中不含蓝藻中复制的起始位点，所以在宿主细胞内会因为无法复制继而渐渐丢失。同源重组整合载体上没有能在藻细胞中自主复制的复制子，不能独立复制，但含有与宿主染色体同源序列,质粒载体进入宿主细胞以后,可通过与宿主细胞染色体同源序列发生同源重组单交换或者双交换，进而将外源基因整合到宿主细胞染色体上，以低拷贝数基因存在并表达。目前集胞藻PCC6803遗传转化方法已经很成熟，而其双同源重组载体构建方法种类繁多，但国内外对同源重组载体启动子兼做的上游臂且高效表达外源基因的报道很少。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种集胞藻PCC6803遗传转化高效双同源重组载体及其构建方法与在集胞藻PCC6803脂肪酸合成中的应用。本发明技术方案如下集胞藻高效双同源重组载体，核苷酸序列如SEQ ID NO. 8或SEQ ID NO. 9所示。上述集胞藻高效双同源重组载体的构建方法，步骤如下(I) PCR扩增集胞藻PCC 6803的psbA2基因ATG前510bp基因片段作为psbA2启动子基因片段、Genbank登录号为X13547.1的集胞藻PCC 6803的psbA20RF基因片段、Genbank登录号为U02439.1的大肠杆菌终止子T1T2基因片段、Genbank登录号为D13780.1的集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脱氢酶基因片段和Genbank登录号为LI 1421.1的集胞藻PCC6803Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段； (2)将步骤(I)获得的psbA2启动子基因片段分别与步骤(I)制得的集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脱氢酶基因片段和集胞藻PCC6803 Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段进行融合PCR扩增，分别制得基因片段Promotor+Delta 15和基因片段Promotor+Delta6 ；(3)将步骤(I)制得的大肠杆菌终止子T1T2基因片段用PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript SK连接,得到质粒pBluescript SK T1T2 ；然后将步骤(I)制得的psbA20RF基因片段用SacII和SacI双酶切后与经相同酶切的质粒 pBluescript SK T1T2 连接,得到质粒 pBluescript SK TlT2-downstream ；对质粒pBluescript SK TlT2_downstream 和质粒 pUC4K 进行 BamHI 单酶切，电泳后分别回收pBluescript SK TlT2_downstream载体片段和pUC4K中的npt片段,对载体片段去磷酸化后与npt片段连接,得到质粒pBluescript SK TlT2-npt_downstream ;(4)将步骤(2)制得的基因片段Promotor+Deltal5，或者，基因片段Promotor+DeIta15 和基因片段 Promotor+Delta6 插入步骤(3)制得的质粒 pBluescriptSKTlT2-npt-downstream 中，制得重组载体；(5)将步骤(4)制得的重组载体转化至集胞藻PCC6803中，制得转基因集胞藻；(6)将步骤(5)制得的转基因集胞藻在20 30°C条件下通气培养8 12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。根据本发明优选的，所述步骤(I)中，PCR扩增psbA2启动子基因片段的引物为
Promotor-F: 5，-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3，；Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’ ；扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸30s，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。根据本发明优选的，所述步骤(I)中，PCR扩增集胞藻PCC6803的psbA20RF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位点，在其3’端引入SacI酶切位点，所用引物为psbA2-F:5’ -CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’ ；psbA2-R:5， -AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3，；扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。根据本发明优选的，所述步骤(I)中，PCR扩增集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脱氢酶基因的引物为
Syl5-F:5’ -TAAGGAATTATAACCAAATGCGTCTAGAAATTTCATCG-3’ ；Syl5-R:5’ -CGGCTGCAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCAGGTTTCTTTTGATATC-3’ ；扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。根据本发明优选的，所述步骤(I)中，PCR扩增花生硫脂酶基因Delta6的引物为Sy6-F:5， _TAAGGAATTATAACCAAATGCTAACAGCGGAAAG_3，；Sy6-R:5， -GTCCTGCAGTCAATGATGATGATGATGATGCGATGCTTTGCCCATGGCCT-3，；扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。·根据本发明优选的，所述步骤(I)中集胞藻PCC 6803的psbA2基因ATG前510bp基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，集胞藻PCC6803psbA20RF基因psbA2的核苷酸序列SEQ ID NO. 2所示，集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脱氢酶基因Syl5的核苷酸序列如SEQID NO. 3所示，集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脱氢酶基因Sy6的核苷酸序列如SEQ IDNO. 4所示。根据本发明优选的,所述步骤(3)中质粒pBluescript SK T1T2的制备方法,具体如下扩增大肠杆菌T1T2终止子的质粒pKK233-2 (购自Clontech公司)，在其5’端引APstI酶切位点，在其3’端引入BamHI酶切位点，所用引物为T1T2-F:5’ 一ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC—3，；T1T2-R:5，一TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT—3，；扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸30s，35个循环后，72°C 10min，4°C保存；获得的片段经PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript SK 连接,得到质粒 pBluescript SK T1T2。上述集胞藻高效双同源重组载体在制备二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)中的应用。本发明通过对集胞藻PCC6803psbA2基因ATG前510bp片段作为同源重组载体启动子兼做上游臂，以psbA2基因ORF片段为下游臂，将集胞藻PCC6803脂肪酸代谢相关的基因Deltal5和Delta6脂肪酸脱氢酶基因进行过量表达，增强集胞藻PCC6803中Deltal5和Delta6脂肪酸脱氢酶基因的表达，转花生硫脂酶基因的集胞藻PCC6803中脂肪酸含量有明显变化，并具有较强的低温耐受性。本发明人根据先前登陆Genbank的集胞藻PCC6803脂肪酸脱氢酶基因序列(Deltal5 D13780.1 ；DeltaDelta6 L11421.1 )，通过 PCR 方法，扩增两类集胞藻 PCC6803 脂肪酸脱氢酶基因编码区全长序列，其中Deltal5基因全长序列为1080个碱基，编码359个氨基酸，Delta6基因全长序列为1080个碱基，编码359个氨基酸。分别将克隆Deltal5脂肪酸脱氢酶基因(Deltal5)及Delta 15和Delta 6脂肪酸脱氢酶基因连接在构建好的双同源重组表达载体pBluescript SK TlT2-npt_downstream上，并转化至集胞藻PCC6803中，得到转基因集胞藻。在转基因集胞藻中油酸含量明显高于野生型。本发明用于构建双同源重组表达载体的集胞藻PCC6803脂肪酸脱氢酶基因的光诱导启动子psbA2基因序列如SEQ ID NO :1所示；下游臂psbA20RF序列如SEQ ID N0:2所示；大肠杆菌T1T2终止子序列如SEQ ID NO 3所示；Deltal5的cDNA序列如SEQ ID NO 4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示；Delta6的cDNA序列如SEQ ID NO 5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示。有益效果(I)本发明提供了一种集胞藻PCC6803双同源重组载体及其构建方法与应用，该重组载体利用集胞藻PCC6803中psbA2基因ATG前510bp片段作为启动子兼做上游臂，以psbA2基因ORF片段为下游臂，将集胞藻PCC6803脂肪酸代谢相关的基因Deltal5和Delta6脂肪酸脱氢酶基因进行过量表达，结果表明，在集胞藻PCC6803中过表达集胞藻PCC6803Delta 15、Deltal5和Delta 6脂肪酸去饱和酶基因可明显提高集胞藻中十八碳四烯酸的含量； (2)本发明首次在集胞藻PCC6803中过表达Deltal5和Delta6脂肪酸脱氢酶基因，对于提高集胞藻PCC6803总脂肪酸含量、增强其生物量具有重要意义，为集胞藻PCC6803中多不饱和脂肪酸的研究提供了理论支持；(3)本发明中应用的基因可以为微藻及植物脂肪酸研究提供支持，为进行大规模生产EPA和DHA提供理论依据和实验方案。
图1为集胞藻PCC6803双同源重组载体结构图；图2为30°C混养条件下Deltal5脂肪酸脱氢酶基因在转基因集胞藻PCC6803中的Western blot 电泳图；其中1、野生型集胞藻PCC6803 ;2、转基因藻pSDSyl5 ；图3为20°C混养条件下Deltal5脂肪酸脱氢酶基因在转基因集胞藻PCC6803中的Western blot 电泳图；其中1、野生型集胞藻PCC6803 ;2、转基因藻pSDSyl5 ；图4为30°C混养条件下Deltal5脂肪酸去饱和酶基因和Delta6脂肪酸脱氢酶基因在转基因集胞藻PCC6803中表达的Western blot电泳图；其中1 :野生型集胞藻PCC6803 ；2 :转基因藻pSDSyl5Sy6 ；图5为30°C混养条件下Deltal5脂肪酸去饱和酶基因和Delta6脂肪酸脱氢酶基因在转基因集胞藻PCC6803中表达的Western blot电泳图；其中1 :野生型集胞藻PCC6803 ；2 :转基因藻pSDSyl5Sy6 ；图6为30°C混养条件下Deltal5脂肪酸脱氢酶基因在转Deltal5脂肪酸脱氢酶基因集胞藻PCC6803中的表达分析；图7为20°C混养条件下Deltal5脂肪酸脱氢酶基因在转Deltal5脂肪酸脱氢酶基因集胞藻PCC6803中的表达分析；图8为30°C混养条件下转集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸去饱和酶基因和Delta6脂肪酸脱氢酶基因在转Deltal5和Delta6脂肪酸脱氢酶基因集胞藻PCC6803中的表达分析；图9为20°C混养条件下转集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸去饱和酶基因和Delta6脂肪酸脱氢酶基因在转Deltal5和Delta6脂肪酸脱氢酶基因集胞藻PCC6803中的表达分析； 图10为30°C混养条件下转集胞藻Deltal5脂肪酸去饱和酶基因藻株脂肪酸成分气相色谱分析；图11为20°C混养条件下转集胞藻Deltal5脂肪酸去饱和酶基因藻株脂肪酸成分气相色谱分析；图12为30°C混养条件下转集胞藻Deltal5脂肪酸去饱和酶基因和Delta6脂肪酸去饱和酶基因藻株脂肪酸成分气相色谱分析；图13为20°C混养条件下转集胞藻Deltal5脂肪酸去饱和酶基因和Delta6脂肪酸去饱和酶基因藻株脂肪酸成分气相色谱分析。
具体实施例方式下面结合说明书附图及实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。实验材料来源大肠杆菌菌株(Escherichia coli) DH5 a及T3载体购自北京全式金生物技术有限公司；野生型集胞藻PCC6803购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库；质粒pKK233-2 购自 Clontech 公司；质粒pSDpbluescript SK购自天津博美科生物技术有限公司；质粒PUC4k购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；其它所使用的酶、试剂及试剂盒等均为市售产品。实施例1分离克隆用于构建转集胞藻PCC6803表达载体的集胞藻Deltal5脂肪酸去饱和酶基因Deltal5和Delta6脂肪酸去饱和酶基因Delta6的cDNA片段、双同源重组片段psbA2启动子、psbA20RF cDNA片段和大肠杆菌终止子TlT2cDNA片段。集胞藻PCC 6803的psbA2启动子基因片段克隆根据GenBank 登陆的集胞藻 PCC 6803 (登录号BA000022，AP012205)中psbA20RF前端序列设计引物，将psbA20RF前500bp作为启动子序列(序列如SEQ ID NO :1，Synchocystis sp. PCC6803 所不)，设计 PCR 引物:Promotor-F: 5，-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3，，Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTT ATGTAT-3’，扩增程序如下94°C预变性5min ;94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后；72°C延伸10min，4°C保存。PCR反应结束后进行电泳切胶回收，连接到T3载体后转化大肠杆菌DH5 a，筛选阳性克隆并测序，获得集胞藻PCC 6803的psbA2启动子基因片段。集胞藻PCC6803psbA20RF基因片段克隆根据GenBank 登陆的集胞藻 PCC6803 (登录号BA000022，AP012205，序列如 SEQID NO :2, Synchocystis sp. PCC6803 所不)中 psbA20RF cDNA 序列设计引物psbA2-F:5’ -CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’ ；
psbA2-R:5’ -AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3J ；扩增程序如下94°C预变性5min ;94°C变性30s，58°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后；72°C延伸10min，4°C保存。PCR反应结束后进行电泳切胶回收，连接到T3载体后转化大肠杆菌DH5 a，筛选阳性克隆并测序。获得集胞藻PCC6803psbA20RF基因片段。大肠杆菌T1T2终止子片段克隆根据GenBank登陆的大肠杆菌T1T2(U02439.1)片段序列(序列如SEQ ID NO :3，)设计引物
T1T2-F:5’ -ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’ ；T1T2-R:5， -TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3，；扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸30s，35个循环后，72°C 10min，4°C保存；基因片段Promotor+Deltal5 克隆根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803Deltal5序列(登录号为D13780.1)设计扩增引物，所用引物为Syl5-F:5， -TAAGGAATTATAACCAAATGCGTCTAGAAATTTCATCG-3，；Syl5-R:5’ -CGGCTGCAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCAGGTTTCTTTTGATATC-3’ ；扩增程序如下94°C预变性5min ;94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后；72°C 10min，4°C保存。PCR反应结束后进行电泳切胶回收，获得集胞藻PCC6803的Deltal5基因片段。分别取psbA 2启动子基因片段和Deltal5基因片段2iU为模板，进行融合PCR 反应，扩增程序为94°C 5min ；94°C lmin,55°C lmin,72°C 5min，2 个循环;加入引物Promotor-F 和 Deltal5_R 各 0. 5 y I，进行如下扩增程序94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，25个循环；72°C 10min，4°C保存。连接到T3载体克隆载体后转化大肠杆菌DH5 a，筛选阳性克隆并测序。获得基因片段Promotor+Deltal5。基因片段Promotor+Delta6 克隆根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803含有Del ta6序列(登录号为L11421.1)设计扩增引物，所用引物为Sy6-F:5’ _TAAGGAATTATAACCAAATGCTAACAGCGGAAAG_3’ ；Sy6-R:5， -GTCCTGCAGTCAATGATGATGATGATGATGCGATGCTTTGCCCATGGCCT-3，；扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。PCR反应结束后进行电泳切胶回收，获得集胞藻PCC6803的Delta6基因片段。分别取psbA 2启动子和Delta6基因片段2 ill为模板，进行融合PCR反应，所用程序为94 °C 5min ；94 °C lmin, 55 °C lmin, 72 °C 5min, 2 个循环；加入引物 Promotor-F和 Deltal5-R 各 0. 1，进行如下扩增程序94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 3min，25 个循环，72°C 10min，4°C保存。连接到T3载体克隆载体后转化大肠杆菌DH5 a，筛选阳性克隆并测序。获得基因片段Promotor+Delta6。实施例2
转集胞藻PCC6803双同源重组表达载体的构建及转化通过过表达技术使在集胞藻PCC6803中过量表达集胞藻PCC6803的Deltal5基因片段和Delta6基因片段，根据转基因阳性集胞藻的表型和脂肪酸组成研究集胞藻PCC6803双同源从组载体的构建方法及在脂肪酸合成中的应用。质粒pBluscript SK plus_TlT2 的制备扩增大肠杆菌T1T2终止子的质粒pKK233-2 (购自Clontech公司)，在其5’端引APstI酶切位点，在其3’端引入BamHI酶切位点，所用引物为·
T1T2-F:5’ 一ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC—3’ ；T1T2-R:5’ 一TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT—3’ ；扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸30s，35个循环后，72°C 10min，4°C保存；获得基因片段经PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript SK 连接,得到质粒 pBluescript SK T1T2。转集胞藻PCC6803表达载体的构建方法如下将实施例1制得的psbA20RF阳性克隆(含psbA20RF基因片段)用SacII和SacI双酶切，回收psbA20RF基因片段；用同样的方法双酶切质粒pBluescript SK T1T2回收载体片段I。用回收的psbA20RF基因片段和载体片段I做连接反应，转化大肠杆菌DH5a。通过筛选阳性克隆，获得前期载体，命名为pBluescript SK TlT2_downstream。将质粒PUC4k用BamHI单酶切，回收卡那霉素抗性npt片段,质粒pBluescriptSKTlT2-doWnStream用BamHI单酶切，回收载体片段2。用回收的npt片段和载体片段2做连接反应，转化大肠杆菌DH5 a，通过酶切筛选阳性克隆，获得卡那霉素抗性载体，命名为pBluescript SK TlT2-npt-downstream。将实施例1中得到的阳性克隆Promotor+Deltal5、Promotor+Delta6质粒DNA分别用SalI酶切，回收基因片段Promotor+Deltal5和基因片段Promotor+Delta6。同样，对含有T1T2终止子且具有卡那霉素抗性的质粒pBluescript SK TlT2-npt_downstream进行Sal I单酶切，回收载体片段3。分别将基因片段Promotor+DeltalS和基因片段Promotor+Delta6和载体片段3做连接反应，转化大肠杆菌DH5 a。通过酶切筛选阳性克隆，获得集胞藻PCC6803原核表达载体，分别命名为表达载体pSDSyl5 (见图1A)、表达载体pSDSy6。将pSDSy6质粒经NdeI和SacII双酶切后，分别连入经相同双酶切的pSDSyl5质粒，得到串联表达的pSDSyl5Sy6质粒(见图1B)。通过自然转化方法(Williams,J. G. K. (1988)Construction of specificmutationsin photosystem 11 photosynthetic reaction center by geneticengineering methods inSynechocystis 6803. Methods Enzymol. 167:766-778.)将构建好的载体导入集胞藻PCC6803中，经抗生素筛选，鉴定得到转基因阳性集胞藻。具体步骤取对数培养期(0D730=0. 6)的集胞藻PCC680330ml于室温，4500g离心8min，弃上清；加新鲜BG-1l液体培养基洗涤一次后，加新鲜BG-1l液体培养基至终浓度0D730=4. 8，并立刻用来转化；将收集的藻液分装到到1. 5ml EP管中(每管400 )，每管加5-10 y g质粒，弱光条件下光照温育6小时，期间摇晃一次。将混合物涂到含有卡那抗生素(12ug/ml)的BG-1l平板培养基上。约10天可见转化子。制得含表达载体pSDSyl5的转基因集胞藻PCC6803、含表达载体pSDSyl5Sy6的转基因集胞藻PCC6803。
实施例3转基因集胞藻阳性植株中Deltal5和Delta6基因表达量水平检测以含表达载体pSDSyl5的转基因集胞藻PCC6803、含表达载体pSDSyl5Sy6的转基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803为材料，提取总RNA进行Real timequantitative PCR分析。具体方法如下采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)并利用液氮研磨法从Deltal5和Deltal5+Delta6基因的集胞藻和野生型集胞藻中提取总RNA。具体操作步骤如下取50ml0D=1.8的蓝藻，4°C，5000rpm离心IOmin收集藻细胞，液氮中研磨至细粉面状后加入1.5ml离心管中，迅速加入Iml TRIZOL (购自Invitrogen公司),颠倒混勻，室温静置5min,4°C, 11900rpm离心IOmin,取上清液至新的1. 5ml离心管中，加入200 U I三氯甲烧,用手剧 烈震荡15s,静置3 5min, 4°C，11900rpm离心10 15min。取上清到新的1. 5ml离心管中，加入500ml异丙醇,颠倒混勻后室温静置lOmin。4°C, 11900rpm离心lOmin。去上清,力口A Iml 75%乙醇(v/v),颠倒振荡几次，4°C,7500rpm离心lOmin。弃上清,室温下敞口晾干至沉淀透明，加入适量DEPC-H2O溶解沉淀，制得Deltal5基因片段和Deltal5+Delta6基因片段的集胞藻和野生型集胞藻PCC6803总RNA。以上述制得的Deltal5基因片段和Deltal5+Delta6基因片段的集胞藻和野生型集胞藻PCC6803总RNA为模板，用TaKaRa公司生产的PrimeScriptTM RT-PCRKit反转录成cDNA。具体操作步骤如下依次加入I ii I Oligo dT Primers (2. 5 u M)> I u I dNTP Mixture (10mM)>2 u g总RNA和DEPC-H2O至IOu I0于PCR仪上65°C，5min进行变性退火反应，离心20s秒钟，依次加入 4u I 5XPrimeScript Buffer、0.5u I RNase Inhibitor (40U/U I)>0.5 U IPrimeScript RTase (for 2step)和 5 u I RNase Free ddH20,42 °C 30min 后 95 °C 5min,即获得第一链cDNA ；以获得的第一链cDNA为模板，以集胞藻PCC6803rnpB基因为内参基因，以 TaKaTa 公司 PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)进行 Real-timequantitative PCR检测。其中集胞藻PCC6803rnpB内参基引物序列为上游Pl :5，-GTGAGGACAGTGCCACAGAA-3，；下游P2 :5，-TGCACCCTTACCCTTTTCAG-3’ ；Deltal5 基因的 Real-time quantitative PCR 引物序列为上游P3 :5，-CGTACTCACCATGCCAACAC-3，；下游P4 :5，-AGGCGATCAGAGGCAAGTAA-3，；Delta6 基因的 Real-time quantitative PCR 引物序列为上游P5 :5，-CTGGGCATGACCTACGATTT-3，；下游P6 :5，-ATACGTACTGCGCCATCTCC-3，。Real-time quantitative PCR 具体操作步骤如下依次加入12. 5iil 2 X SYBR premix Ex Taq ( )、上下游引物各1. Oyl、cDNA 模板 2. Oii I 和 8. 5 ii I ddH20。95°C 预变性 lmin ；95°C 10s, 60 °C 30s, 72 °C 30s, 42 个循环；95°C 10s，58°C 30s，72°C 5min ;55°C ls，81 个循环，每隔 0. 5s 检测一次。实施例4转基因集胞藻阳性植株中DeItal5和Delta6蛋白水平检测
以含表达载体pBluscrip-SD-Deltal5的转基因集胞藻PCC6803、含表达载体pBluscrip-SD-Deltal5+Delta6的转基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803为材料，提取藻总蛋白，利用Western blot方法检测转基因阳性集胞藻中Deltal5和Delta6蛋白质水平。具体方法如下取藻细胞离心收集后用5mL 40mM的Tris-Cl (pH8. 0)悬浮，然后加入适量的直径为0. 17mm左右的玻璃珠(购自sigma公司)至玻璃珠界面上方有0. 5mL的悬浮液。通过润旋振荡器以最大速率震荡lmin，然后置于冰上lmin，如此重复5次。在4000rpm低速离心IOmin收集上清，再将所收集的上清用较高转速6000rpm进行离心lOmin，收集上清。即得到藻细胞总蛋白。取适量样品，加等体积的2XBSA，沸水中煮10分钟。离心后放_20°C存放。取少量样品，稀释一定倍数(5\、10\、20\)，以40禮Tris-Cl (pH8. 0)为参照空白，测蛋白质浓度。利用10%SDS-PAGE进行蛋白质电泳，每个上样孔50iig蛋白。电泳结束后，通过印记法转移到PVDF(Millip0re，BillleriCa，MA)。然后按照何庆芳等人的方法进行免疫化学分析，检测 Deltal5 和 Delta6 蛋白质水平(Qingfang He 等,Eur. J. Bilchem.，1999, 263，561-570)。结果表明，转基因集胞藻中，均检测出Deltal5和Delta6蛋白质水平，而野生型中则没有信号，见图2，3，4，5。实施例5转基因集胞藻阳性植株中脂肪酸成分分析在30°C，30 ii E. m_2. s—1持续光照下，取含表达载体pSDSyl5的转基因集胞藻PCC6803、含表达载体pSDSyl5Sy6的转基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻，离心后收集菌体，40°C干燥，经甲酯化后进行气象色谱分析；具体步骤如下( I)称取适量样品于厌氧培养管中。(2)加入氯乙酰甲醇4mL。氯乙酰甲醇=1:10 (体积比)。(3)精确加入ImL含有C19:0内标的正己烷溶液。内标浓度为lmg/mL。(4)盖紧管盖，80°C水浴两小时。取出冷却至室温。(5)加入7%的碳酸钾溶液5mL,振荡均勻,静置lOmin, I, OOOrpm离心5min分层。(6)吸取上层液相，由中国农大农业部饲料研究中心进行气相色谱分析。与对照野生型集胞藻PCC6803相比，在30 V及20°C混养条件下含表达载体pSDSyl5的转基因集胞藻PCC6803、含表达载体pSDSyl5Sy6的转基因集胞藻PCC6803脂肪酸含量变化见表I和表2。表I
膽_酸含量
嫌株温度(FatlyackIsCTKiteiU <%)
I Strains) (tl CI :1 (li;2 CIiiJnf. Ctl;Jn3 C1 :4
野‘1.: J( 7— 7工《,9 Ll.S^xLO 1626±U I—45x(>.2 144x4.3
'WTI 20 3.y4i .2 tl ,75±0.6 14.72*1.3 2.53±(l.3 1.54^0.2 l.53±3.(
30 2—73*11.3 2^80i<l5I 1732*2.1 9J]iL3 ft 34±7.3
pSDSvI5
' 2 3J ±I>.7 .23dU 23.05±2.3 10 * Lft m.li±5.7表权利要求
1.集胞藻高效双同源重组载体，核苷酸序列如SEQID NO. 8或SEQ ID NO. 9所示。
2.权利要求1所述集胞藻高效双同源重组载体的构建方法，其特征在于，步骤如下 (1)PCR扩增集胞藻PCC6803的psbA2基因ATG前510bp基因片段作为psbA2启动子基因片段、Genbank登录号为X13547.1的集胞藻PCC 6803的psbA20RF基因片段、Genbank登录号为U02439.1的大肠杆菌终止子T1T2基因片段、Genbank登录号为D13780.1的集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脱氢酶基因片段和Genbank登录号为L11421.1的集胞藻PCC6803Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段； (2)将步骤(I)获得的psbA2启动子基因片段分别与步骤(I)制得的集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脱氢酶基因片段和集胞藻PCC6803Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段进行融合PCR扩增，分别制得基因片段Promotor+Delta 15和基因片段Promotor+Delta6 ； (3)将步骤(I)制得的大肠杆菌终止子T1T2基因片段用PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript SK连接,得到质粒pBluescript SK T1T2 ； 然后将步骤(I)制得的psbA20RF基因片段用SacII和SacI双酶切后与经相同酶切的质粒 pBluescript SK T1T2 连接,得到质粒 pBluescript SK TlT2-downstream ； 对质粒pBluescript SK TlT2_downstream和质粒pUC4K进行BamHI单酶切，电泳后分别回收pBluescript SK TlT2_downstream载体片段和pUC4K中的npt片段，对载体片段去磷酸化后与npt片段连接,得到质粒pBluescript SK TlT2-npt-downstream ； (4)将步骤(2)制得的基因片段Promotor+DeltalS，或者，基因片段Promotor+DeIta15 和基因片段 Promotor+Delta6 插入步骤(3)制得的质粒 pBluescriptSKTlT2-npt-downstream 中，制得重组载体； (5)将步骤(4)制得的重组载体转化至集胞藻PCC6803中，制得转基因集胞藻； (6)将步骤(5)制得的转基因集胞藻在20 30°C条件下通气培养8 12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(I)中，PCR扩增psbA2启动子基因片段的引物为Promotor-F:5’ -GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3’ ；Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’ ； 扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸30s，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。
4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(I)中，PCR扩增集胞藻PCC6803的psbA20RF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位点，在其3’端引入SacI酶切位点，所用引物为psbA2-F:5’ -CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’ ；psbA2-R:5’ -AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3’ ； 扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(I)中，PCR扩增集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脱氢酶基因的引物为Syl5-F :5’ -TAAGGAATTATAACCAAATGCGTCTAGAAATTTCATCG-3’ ；Syl5-R :5’ -CGGCTGCAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCAGGTTTCTTTTGATATC-3’ ； 扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。
6.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(I)中，PCR扩增花生硫脂酶基因Delta6的引物为Sy6-F :5’ -TAAGGAATTATAACCAAATGCTAACAGCGGAAAG-3’ ；Sy6-R :5’ -GTCCTGCAGTCAATGATGATGATGATGATGCGATGCTTTGCCCATGGCCT-3’ ； 扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。
7.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(I)中集胞藻PCC6803的psbA2基因ATG前510bp基因片段核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，集胞藻PCC6803psbA20RF 基因 psbA2 的核苷酸序列 SEQ ID NO. 2 所示，集胞藻 PCC6803Deltal5 脂肪酸脱氢酶基因Syl5的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脱氢酶基因Sy6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
8.如权利要求2所述的构建方法,其特征在于，所述步骤(3)中质粒pBluescriptSKT1T2的制备方法，具体如下 扩增大肠杆菌T1T2终止子的质粒pKK233-2，在其5’端引入PstI酶切位点，在其3’端引入BamHI酶切位点，所用引物为T1T2-F :5’ 一ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC—3’ ；T1T2-R:5’ 一TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT—3’ ； 扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸30s, 35个循环后，72°C 10min，4°C保存；获得的片段经PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript SK 连接,得到质粒 pBluescript SK T1T2。
9.权利要求1所述集胞藻高效双同源重组载体在制备二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸中的应用。
全文摘要
本发明涉及具体涉及集胞藻高效双同源重组载体及其构建方法与应用。集胞藻高效双同源重组载体，核苷酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。本发明还公开该集胞藻高效双同源重组载体的构建方法与应用。本发明所述集胞藻高效双同源重组载体在集胞藻PCC6803中过表达集胞藻PCC6803Delta 15、Delta15和Delta 6脂肪酸去饱和酶基因可明显提高集胞藻中十八碳四烯酸的含量。
文档编号C12R1/89GK103014053SQ20121052904
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者何庆芳, 陈高, 毕玉平, 张燕, 李伟智, 杨连群, 范仲学, 边斐, 马德源, 彭振英 申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心