专利名称：一株用于肉制品发酵剂的具有ace抑制活性的菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー株地衣芽孢杆菌。
背景技术：
高血压是世界性难题，影响15-20%的成年人健康。在控制人体血压的多种因素
中，肾素-血管紧张素调节系统(Renia-angiotensin system,RAS)和激肽释放酶-激
肽系统(Kallikrein-kininsystem, KKS)是人体内两种重要的调节系统。其中血管紧张素转换酶(ACE)是系统调节过程中起关键作用的酶，是使血压升高的主要因素。抑制ACE的活性，就能有效的防治和治疗高血压的发生。现在已经研究发现有些食物中含有降血压肽，但种类有限，而利用微生物法生产的发酵食品就可以解决具有ACE抑制活性的降血压肽受到食物来源及食物品种限制的不足。通过人为在食品中添加微生物，开发具有抗高血压功能的健康食品。在微生物的作用下，食品中无生物活性的前体物质在微生物与酶的作用下被释放出来，使食品具有ACE抑制活性，产生具有ACE活性抑制肽，即降血压肽。源于食品的降血压肽与化学合成的降压药相比，有极高的安全性。而且这些肽属于生物活性肽，只对高血压患者起降血压作用，对血压正常者则无降压作用，这种降压作用的选择性是普通的化学合成降压药所不具备的。利用微生物生产降血压保健产品是国内外发展的ー种趋势。国内外已筛选出了一些降压微生物——乳酸菌。其中主要以瑞士乳杆菌为主。保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌的某些菌株也被测出了含有 ACE抑制活性。除乳酸菌外，国内外没看见有其它产ACE抑制活性微生物的研究。因此，筛选开发具有ACE抑制活性的微生物菌株，具有十分重要的研究和利用价值。
发明内容
本发明目的是提供一株用于肉制品发酵剂的具有ACE抑制活性的菌株。本发明用于肉制品发酵剂的具有ACE抑制活性的菌株，它为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) F2,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年9月18日，保藏编号为 CGMCC No. 6574。本发明中用于肉制品发酵剂的具有ACE抑制活性的菌株，它为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) F2，它在营养琼脂培养基中生长良好，呈梅花型水样菌落，菌落大小为5. 0 7. 0mm，边缘不整，在营养琼脂斜面培养基上呈蹼状；它为革兰氏阳性杆菌，
有芽孢，菌体大小为U 3丨|.1:1_广ぺリ丨1.11.い><リ:丨yuii 彳)。本发明中用于肉制品发酵剂的具有ACE抑制活性的菌株，它为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) F2,具有显著的蛋白酶活性,对金黄色葡萄球菌抑菌效果明显，对志贺氏菌、沙门氏菌及大肠杆菌有抑菌效果。
本发明中用于肉制品发酵剂的具有ACE抑制活性的菌株，它为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) F2，它的生长温度为25 40°C，最适生长温度为37°C;它在浓度为6%的食盐中正常生长；它能在含亚硝酸盐100mg/kg的亚硝酸盐培养基中生长；它在pH值为4. 5 8内均能生长，不产酸。本发明中用于肉制品发酵剂的具有ACE抑制活性的菌株，它为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) F2,其 ITS 序列与 GenBank 中登录的地衣芽抱杆菌{BacillusIicheniformis) HM006901.1的基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性为99. 9%,结合形态学观察结果，确定地衣芽孢杆菌^Bacillus licheniformis) F2属于芽孢杆菌属的ー个新种。本发明中用于肉制品发酵剂的具有ACE抑制活性的菌株，它为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) F2,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年9月18日，保藏编号为 CGMCC No. 6574。本发明用于肉制品发酵剂的具有ACE抑制活性的菌株，它为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) F2，其ACE抑制率为83. 13%。它的最适生长温度为37°C;它能耐受6%的NaCl及100mg/kg的亚硝酸盐,不产酸。同时，它具有显著的蛋白酶活性，对金黄色葡萄球菌抑菌效果明显，对志贺氏菌、沙门氏菌及大肠杆菌有抑菌效果，因此，本发明中用于肉制品发酵剂的具有ACE抑制活性的菌株,即地衣芽孢杆菌{Bacillus licheniformis)F2，它作为发酵剂菌株，在合适的条件下，可以和其他菌株协同作用生产发酵食品，或単独生产具有ACE抑制活性的食品或菌剂。
图1为具体实施方式
一中纯菌株F2 连接到PMD19-T载体中的PCR鉴定结果图，其中1-7泳道分别为F2的7个转化菌落PCR产物，M泳道为DNA Marker ；
图2为具体实施方式
一中纯菌株F2与地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)HM006901.1的16S基因序列分析结果 图3为具体实施方式
一中纯菌株F2在不同pH条件下吸光度值的曲线 图4为具体实施方式
一中纯菌株F2的生长与温度关系的曲线图。
具体实施例方式 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式用于肉制品发酵剂的具有ACE抑制活性的菌株，它为地衣芽孢杆菌Qkicillus licheniformis) F2,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年9月18日，保藏编号为CGMCC No. 6574。本实施方式中具体的保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) F2的分类命名为地衣芽抱杆菌Bacillus licheniformis。本实施方式中用于肉制品发酵剂的具有ACE抑制活性的菌株，该菌株自用传统方法生产的发酵豆中分离纯化得到，其样本现存于黑龙江八ー农垦大学微生物实验室；它按以下步骤进行分离纯化培养1、培养基
营养琼脂(g/L):蛋白胨10. 0g、牛肉粉3. 0g、氯化钠5. 0g、琼脂15. 0g、蒸馏水1000mL、pH值7. 3±0. 1，121°C高压灭菌15分钟。营养肉汤(g/L):蛋白胨lO.Og、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、蒸懼水lOOOmL、pH值7. 2±0. 2，121°C高压灭菌15分钟。酪蛋白培养基I1:酪蛋白lg、酵母浸膏lg、氯化钠Sg、琼脂粉4g、蒸馏水200mL，pH值 7. 2 7. 4。脂肪酶活性检测培养基I1:15%猪油、0. 2g中性红指示剂、IOOmL营养琼脂培养基。2、试剂
血管紧张素转化酶(ACE) A-2580、马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL) (Sigma公司);pMD19_T载体、DL2000 DNA Marker (TaKaRa 公司)。硼酸缓冲液用去离子水配制，其中含硼酸100 mmol/L,NaCl 300 mmol/L，然后用6 mol/L NaOH 调整 pH 值至 8. 3。ACE液用去离子水溶解，配成0.1 U/mL。马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)溶液溶于硼酸盐缓冲液，配制成5 mmo/L的溶液。3、方法发酵豆采用稀释涂布法接种于营养琼脂平板中，37°C培养24h，然后将生长出的菌落用营养琼脂平板进ー步分离纯化得到纯菌株，命名为纯菌株F2。抑制率测定
纯菌株F2接种到营养肉汤培养基中，37°C培养24h，取培养液离心(4000 rpm, 5min)后取上清液用NaOH调整pH值到8. 3，根据表1，将各试剂加入到试管中，在37°C水浴中反应30min，反应结束后马上加入ImoL/L HCl以终止反应，然后各试管中加入こ酸こ酯1. 5mL,旋涡混合后进行离心(4000rpm，IOmin);吸取1. OmLこ酸こ酯于另ー试管中，放入真空烘箱中，100°C挥发溶剂30min，冷却后加入去离子水3mL，旋涡混合后用紫外分光光度计在228nm测定其吸光值，按以下公式计算ACE抑制率。
权利要求
1.一株用于肉制品发酵剂的具有ACE抑制活性的菌株，其特征在于它为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) F2,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年9月18日，保藏编号为 CGMCC No. 6574。
全文摘要
一株用于肉制品发酵剂的具有ACE抑制活性的菌株，它涉及地衣芽孢杆菌。用于肉制品发酵剂的具有ACE抑制活性的菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)F2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年9月18日，保藏编号为CGMCC No.6574。本发明中菌株F2，其ACE抑制率为83.13%，能耐受6%的NaCl及100mg/kg的亚硝酸盐，不产酸；它具有显著的蛋白酶活性，对金黄色葡萄球菌抑菌效果明显，它作为发酵剂菌株，在合适的条件下，可以和其他菌株协同作用生产发酵食品，或单独生产具有ACE抑制活性的食品或菌剂。
文档编号C12R1/10GK103045505SQ201210528248
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者俞龙浩, 王欣, 李艳青, 薛冰, 孟质文 申请人:黑龙江八一农垦大学