菌液atp含量和od比值在发酵和发酵剂制备中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及菌株发酵培养领域，具体地，涉及一种在培养过程中通过测定菌液ATP 含量和OD值的比值以判断发酵终点的方法，以及该方法在菌株保存，特别是在制备乳酸菌 发酵剂中的应用，本发明还涉及一种发酵剂的制备方法，以及由该方法制备的发酵剂。
【背景技术】
[0002] 在乳酸菌饮料或是干酪或是其他发酵制品生产的过程中，高品质的直投式发酵剂 是保证产品质量的前提。直投式发酵剂制备的过程主要包括了菌体的高密度发酵及发酵剂 的冷冻制备两个部分。而这个过程中的诸多因素都会对终产品发酵剂的性能造成影响，比 如，发酵的条件、发酵收获时间，冷冻操作过程等。
[0003] 发酵剂对于菌体的要求首先是具有高活性。其次是要有较高的耐受性，而并不仅 仅局限于对菌数的要求。在现有的发酵剂的生产过程中一般都是通过监控发酵过程中的pH 值，0D600值等数据指标，以判断最适宜的菌种收获时间。但通过常规的判断方法所制备的 发酵剂不能够得到菌体最理想的状态，并且发酵剂的制备时间较长。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了克服以上缺陷，一方面，提供了一种菌株的发酵培养方法，该 方法包括：将菌株接种到培养液中进行发酵培养，其中，在发酵培养的过程中，测定菌液的 ATP含量和OD值的比值，并使其达到顶点，以结束发酵培养。
[0005] 第二方面，本发明还提供了如上所述的方法在菌株保存中的应用。
[0006] 第三方面，本发明还提供了一种发酵剂的制备方法，其中，该方法包括：按照如上 所述的方法对用于制备发酵剂的菌株进行培养，得到培养液。
[0007] 第四方面，本发明还提供了由以上方法制备的发酵剂。
[0008] 通过上述技术方案，在发酵培养的过程，测定菌液的ATP含量和OD值的比值，以该 比值达到顶点时作为发酵培养的终点以结束发酵过程。采用该方法培养得到的菌体具有较 高的活性和耐受性，且该时间点要早于通过单纯测定0D600值或是监测活菌数判断得到的 收获时间点，因此，具有更短的发酵时间，并且，将这样的菌体保存后再次用于发酵时能够 表现出优越的发酵性能。
[0009] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0010] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0011] 图1是保藏号为CGMCC No. 9800的副干酪乳杆菌在发酵培养过程中菌液ATP含量 随发酵时间的变化曲线。
[0012] 图2是保藏号为CGMCC No. 9800的副干酪乳杆菌在发酵培养过程中菌液pH值和 OD值随发酵时间的变化曲线。
[0013] 图3是保藏号为CGMCC No. 9800的副干酪乳杆菌在发酵培养过程中的菌液ATP/0D 值随发酵时间的变化曲线。
【具体实施方式】
[0014] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0015] 本发明的发明人在研宄的过程中发现，ATP普遍存在于所有活的生物体中，被用来 贮存和传递化学能，在微生物菌体中也不例外，微生物死亡后，在细胞内酶的作用下，其体 内的ATP会被很快的降解掉；而对于一定生理时期内的活体微生物，其体内的ATP会保持在 一个较为恒定的水平。而ATP作为一种能量的载体，同时也反应了菌体内能量代谢水平的 情况，菌体内含有的ATP含量越高，代表了菌体处于一个更活跃的能量代谢状态。而对于乳 酸菌来说，其产生ATP的途径主要是通过葡萄糖或乳糖向乳酸转化的过程实现的，ATP含量 越高，代表了葡萄糖向乳酸转化效率越高，表征了此时菌体具有更高的发酵活性。
[0016] 基于以上发现，本发明的发明人试图通过在菌体培养的过程中，通过测定菌体体 内ATP的含量，当其达到最高点时，结束发酵以进行乳酸菌发酵剂的制备，而不是通过常规 的通过测定OD值或是pH的方法，当培养进行对数末期时结束发酵，以进行乳酸菌发酵剂的 制备。但通过这样的方法制备得到的发酵剂性能的改善程度并没有达到预期的效果，并且 制备时间较长。
[0017] 本发明的发明人又发现，通过在发酵过程中，分别测定菌体体内ATP的含量以及 OD值，并计算两者的比值，也即，得到单位菌体密度的ATP含量，通过以该比值达到顶点为 基准，来判断发酵终点。这样基本上保证了每个菌体细胞内的ATP含量均处于一个最佳的 水平。以该方法制备得到的发酵剂的性能能够得到提高。例如，通过如上方法判断发酵培 养的终点，能够使菌体达到最大的活性，并且得到的菌体对环境也具有较高的耐受性，将这 样的菌体保存后再次用于发酵时能够表现出优越的发酵性能。并且采用该方法能够提早结 束发酵过程，使得发酵时间缩短，带来了较高的社会效益。
[0018] 基于以上发现，一方面，本发明提供了一种菌株的发酵培养方法，该方法包括：将 菌株接种到培养液中进行发酵培养，其中，在发酵培养的过程中，测定菌液的ATP含量和OD 值的比值，并使其达到顶点，以结束发酵培养。
[0019] 根据本发明，术语"顶点"并非是严格意义上指代的一个特定的具体点值，其根据 培养菌株的不同，培养条件的不同以及对所述顶点要求程度的不同而会在一定的范围内有 所差别。所述顶点即可以理解为菌液中ATP的含量和OD值的比值的顶点值，也可以理解为 当菌液中ATP的含量和OD值的比值达到顶点值时所对应的时间。
[0020] 根据本发明，确定菌液的ATP含量和OD值比值达到顶点的方法没有特别的限制， 本领域技术人员可以采用常规的方法进行确定。例如，可以在发酵培养的过程中较粗略的 获得该顶点：具体的，在菌体发酵培养的过程中，通过间隔取样或是在线时时监控的方法， 测定培养液中ATP的含量以及OD值，计算得出培养液中ATP的含量和OD值的比值，待观察 到的比值刚有所下降时立即结束发酵培养，该时间点便为所述顶点。其中，当通过间隔取样 的方法确定所述顶点时，当所述比值在上升缓慢阶段时，可以适当的缩短取样的间隔。还 例如，可以通过提前绘制曲线的方法精确获得所述顶点，具体的，将同一菌株进行预发酵培 养，培养基的组成以及培养条件与正常培养时完全相同，在培养的过程中通过间隔取样或 是在线时时监控的方法，测定培养液中ATP的含量以及OD值，计算得出培养液中ATP的含 量和OD值的比值，然后以培养时间为横坐标，ATP的含量和OD值的比值为纵坐标绘制发酵 曲线，从而得到所述顶点。
[0021] 其中，所述ATP的含量和OD值的测定方法可以为本领域常规的测定方法，例如，可 以使用微生物细胞活力分析仪（Microbial Cell Viability Assay)并按照其说明书进行 ATP含量的测定，可以通过常规的分光光度计或是酶标仪进行OD值的测定。
[0022] 其中，微生物细胞活力分析仪是通过如下的原理进行检测的：
[0023] ATP生物发光法的原理就是在荧光素酶E和Mg2+的作用下，荧光素 LH与ATP发生 腺苷酰化被活化，活化后的荧光素与荧光素酶相结合，形成了荧光素一AMP复合体，并放出 焦磷酸。该复合体被分子氧所氧化，形成激发态复合物Ρ*-Ε · AMP，放出CO2，当该复合物从 激发态回到基态时发射光，从而被仪器检测到。
[0024] 本发明对待培养的菌株没有特别的限制，由于采用本发明的方法可以获得活性和 耐受性较高的培养菌株，并且在后期使用时，所述获得的培养菌株能够较快的进入状态并 积极发挥活性。因此，本发明的方法特别适用于需要进行保存的任何菌株的培养，待培养结 束后，可以进行常规的保存，例如，甘油管的保存，制备成冻干粉的保存等等。
[0025] 在本发明一种特别优选的实施方式中，所述菌株为乳酸菌菌株，优选的，所述乳酸 菌菌种包括乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、双歧杆菌属和乳球菌属中的一种或多种。根 据本发明一种具体的实施方式，所述乳酸菌为保藏号CGMCC No. 9800的副干酪乳杆菌。
[0026] 因此，第二方面，本发明提供了如上所述的方法在菌株保存中的应用。
[0027] 所述菌株可以为任何需要保存的菌株。在本发明一种特别优选的实施方式中，所 述菌株为乳酸菌菌株，优选的，所述乳酸菌菌株包括乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、双歧 杆菌属和乳球菌属中的一种或多种。根据本发明一种具体的实施方式，所述乳酸菌为保藏 号CGMCC No. 9800的副干酪乳杆菌。
[0028] 另外，第三方面，本发明还提供了一种发酵剂的制备方法，其中，该方法包括：按照 如上所述的方法对用于制备发酵剂的菌株进行培养，得到培养液。
[0029] 根据