一株好氧降解吲哚的伯克霍尔德菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株好氧降解吲哚的伯克霍尔德菌及其应用，属于微生物技术领域。技术背景
[0002]随着工业的发展，我国的水污染情况日益严峻。焦化废水、染料废水、制药废水、农药废水等工业废水中存在大量的氮杂环化合物，例如吡咯、吲哚、吡啶、喹啉、异喹啉及其衍生物等。氮杂环化合物具有共轭体系，不易在代谢过程中被破坏，生物降解性能很差，并且此类物质中多数具有致癌、致畸、致突变的效应，对环境和人体健康造成严重的威胁。因此，很多研宄者对含氮杂环化合物的生物降解特性展开了研宄。
[0003]吲哚作为一种典型的氮杂环化合物，在医药、染料、化妆品、香水和食品行业有广泛的应用。然而，吲哚在自然界中属于一种致突变、难降解的污染物，主要产生于焦化厂中的焦化和气化工艺。吲哚还具有弱碱性、较高的流动性和水溶性，在环境中易扩散，因此对环境和生物产生一定的威胁。最近的研宄表明，Π引噪作为一种胞外和胞内的信号分子，可以改变细胞膜组成、细菌抗药性和质粒稳定性，从而影响生态系统的性能。物理-化学方法，例如吸附、光催化降解以及生物处理已经被广泛应用于吲哚的降解研宄。其中，微生物降解吲哚由于其环境友好和低廉高效的特点备受青睐。
[0004]吲哚生物降解分为好氧和厌氧降解两种类型，它们的区别在于吲哚最初的加羟位置。厌氧降解的关键步骤是C2位置加羟，产生2-吲哚酮，这一步骤可以由产甲烷、硫还原、反硝化微生物行使。好氧吲哚代谢途径中，氧气分子攻击C3位置或C2/C3位置，产生吲哚酚或2，3- 二羟基吲哚。通常，厌氧条件下吲哚降解速率非常慢，往往需要很多天才能去除很低浓度的吲哚，好氧降解更加迅速、高效。
[0005]早在19世纪20年代，已经有研宄者尝试寻找潜在的好氧吲哚降解微生物。1953年Sakamoto等人从自来水中分离得到一株革兰氏阴性细菌，能够通过H引噪酸、靛红、N-氨基苯甲酸甲醋、邻氨基苯甲酸、水杨酸和儿茶酸途径降解[I引噪。随后，Alcaligenes sp.1n3，Pseudomonas sp.ST-200, Pseudomonasaeruginosa Gs，Isl ^ |M1 AspergiIlus niger,Pleurotus osireaiiAsiii被报道能够降解Π引噪。然而，这些菌株好氧降解Π弓丨噪的速率有限，目前为止文献报道的最高降解速率为60小时内降解100 mg/L吲哚，这对于工业废水的处理还远远不够。因此挖掘新的吲哚降解菌资源，加速吲哚的生物降解研宄显得尤为重要。
[0006]ifcr姑o7oferia菌属是典型的芳径降解菌，能够降解三氯乙稀、菲、喹啉、氟代苯、甲苯等一系列污染物，其中zeflorarafls是典型的多氯联苯的降解者。因此，利用及/r姑菌属的细菌进行生物修复是可行的。然而目前利用该菌属降解吲噪的研宄非常少，仅有利用外加碳源没食子酸的协助下降解吲哚的一篇报道。本发明采用的伯克霍尔德菌Burkholderia邓.1D03能以吲哚为唯一碳源、氮源和能源进行生长，而且吲哚降解速率与已有报道具有明显的优势，证明该菌在吲哚废水处理中具有潜在的应用前景。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一株好氧降解吲哚的伯克霍尔德菌及其应用，该菌株能利用多种芳香化合物作为唯一碳源生长，对吲哚具有较强的降解能力，菌株还具有良好的PH和温度耐受性，显示了其在含吲哚废水处理中的应用前景。
[0008]本发明所涉及的一株好氧降解吲哚的伯克霍尔德菌(拉丁文分类命名为:Burkholderia印.)，所述菌株的登记入册编号为CGMCC N0.10457，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研宄所，保藏日期为2015年I月28日。所述菌株属于伯克霍尔德菌，其16S rRNA基因序列Genbank登录号为KP895480。
[0009]所述菌株分离自反应器活性污泥，其纯化分离及生长培养基为无机盐培养基，无机盐培养基的组成为:2.0 g/L KH2PO4,3.28 g/L Na2HPO4* 12Η20、0.205 g/L MgS04*7H20、和0.00025 g/L FeCl3，在121 °C高温高压灭菌20 min的无机盐培养基中按实验要求添加100mg/L吲哚，30°C，150 rpm条件震荡培养。
[0010]所述菌株应用于吲哚的降解，在24小时内，菌株ID03在pH 4.0-8.0的范围内对100 mg/L吲哚的降解率保持在95%以上。
[0011]本发明的有益效果是:该菌株分离自反应器活性污泥，经16S rRNA基因序列测定，其与oferia具有较高的相似性，因此该菌分类命名为Burkholderias^.1D03，菌株16S rRNA基因序列的GenBank登录号为KP895480。该菌株利用多种芳香化合物作为唯一碳源生长，包括苯甲酸钠、色氨酸、苯酚、儿茶酚、水杨酸等，对吲哚具有较强的降解能力，能在14小时内完全降解100 mg/L的吲哚。在24小时内，菌株IDO在温度25_35°C、pH
4.0-8.0的范围内对100 mg/L吲哚的降解率均保持在95%以上，具有良好的温度和pH耐受性，显示了其在含高浓度吲哚废水处理中的应用前景，并具有处理实际焦化废水的应用潜力。
【附图说明】
[0012]图1是一株伯克霍尔德菌株ID03对100 mg/L吲哚的好氧降解曲线及菌株生长曲线。
[0013]图2是一株伯克霍尔德菌株ID03对200 mg/L吲哚的好氧降解曲线及菌株生长曲线。
[0014]图3是一株伯克霍尔德菌株ID03在不同温度下对吲哚的降解率。
[0015]图4是一株伯克霍尔德菌株ID03在不同起始pH下对吲哚的降解率。
[0016]图5是一株伯克霍尔德菌株ID03在不同转速下对吲哚的降解率。
[0017]图6是一株伯克霍尔德菌株ID03在不同金属离子下12h后对B引噪的降解率。
[0018]图7是一株伯克霍尔德菌株ID03在不同金属离子下24h后对吲哚的降解率。
[0019]图8是一株伯克霍尔德菌株ID03在不同氮杂环化合物影响下对吲哚的降解率。
【具体实施方式】
[0020]实验材料和试剂
1.菌株:菌株ID03由发明人2015年从实验室反应器中分离获得，菌种以吲哚为唯一碳、氮源培养，经过反复平板涂布分离纯化，得到纯培养物。
[0021]2.培养基无机盐培养基:2.0 g/L KH2PO4,3.28 g/L Na2HPO4* 12Η20、0.205 g/L MgS04.7H20、和
0.00025 g/L FeCl3O
[0022]无机盐固体培养基:无机盐培养基+ 2%琼脂。
[0023]实施例1:伯克霍尔德菌菌株的筛选将来源于反应器活性污泥进行反复稀释平板涂布在无机盐固体培养基平板上，30°C培养。最终挑取一个长势良好的单菌落用液体无机盐培养基培养，30°C，150 rpm下获得菌液。
[0024]实施例2:菌株的16S rRNA分子鉴定
挑取无机盐固体培养基平板上生长的单菌落溶于10 PL灭菌水中，99°C变性后离心取上清液作为 PCR扩增反应的模板。使用 TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identificat1n PCRKit，以Forward primer/Reverse primer为引物，扩增目的片断。PCR反应体系总体积为50 M-L:PCR Premix 25 M-L, Forward Primer 0.5 M-L, Reverse Primer 0.5 ML，模板 DNA 5μ?，无菌超纯水19 μ?。PCR反应条件为:94°C预变性5 min，经过30个循环，其中，94°C变性I min，55°C退火I min，72°C延伸1.5 min，30个循环后，再于72°C延伸5 min，取5 M-LPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测。使用TaKaRa Agarose Gel DNAPurificat1n Kit Ver.2.0 (大连宝生物公司TaKaRa)切胶回收PCR产物。16S rRNA序列的测序工作上海生工生物工程有限公司完成。测序结果在Genbank中进行Blast比对，结果显示与其序列相似性达到99%的均为伯克霍尔德菌iBurkholderiemu )，因此将菌株ID03归属于伯克霍尔德菌属。
[0025]>ID03 16S rRNA gene sequenceCTTGGGGGGGCATGCTTACACATGCAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAA
CGGGTGAGTAATACATCGGAACATGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGAT
CTCTGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTATAGGGTTGGCCGATGGCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTA
AAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC
TCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAG
GCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGACCCTAATATGGTCGGGGGATGACGGTACCGGAA
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