重组蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种重组蛋白，包括红细胞生成素、高糖基化片段、人类绒毛膜促性腺激素的羧基末端肽，以及促血小板生成素的羧基末端肽。本发明的重组蛋白具有红细胞生成素的生物活性，且具有较长的半衰期。
【专利说明】重组蛋白
[0001]【发明所属的【技术领域】】
[0002]本发明涉及一种重组蛋白，且特别涉及一种具有较长半衰期的高糖基化红细胞生成素。
【【背景技术】】
[0003]红细胞生成素(Erythropoietin,简称ΕΡ0)是一种糖蛋白质激素,骨髓中血红细胞前驱的细胞因子。在人体中，可进行红细胞的制造、荷尔蒙的调节。同时，它也具有其他的生物功能，例如，当神经受到伤害时，红细胞生成激素也参与伤口愈合过程。
[0004]红细胞生成作用是指红细胞的生成，其作用为弥补被破坏的细胞。红细胞生成是一种受控制的生理机制，使足够的红细胞可被运用于适当的组织氧合作用。人类红细胞红细胞生成素(hEPO)由肾所产生，为一种体液血浆因子，可刺激红细胞的生成(Carnot，P and Deflandre，C (1906) C.R.Acad.Sc1.143:432 ；Erslev, AJ(1953B 10d 8:349;Reissmann, RR(1950)Blood 5:372 ；Jacobson, L0, Goldwasser, E, Freid, W and Plzak,LF(1957)Naturel79:6331-4)。自然生成的EPO可刺激骨髓中红细胞前驱细胞的分裂及分化，并经由与红细胞前躯物受体的结合而展现其生物活性(Krantz，BS(1991)Blood 77:419)。
[0005]利用重组体DNA技术已可合成红细胞生成素(Egrie, JC, Strickland, Tff, Lane,J et al.(1986) Immunobiol.72:213-224),将经选殖的人类EPO基因嵌入，并以中国仓鼠卵巢组织细胞表达。EPO多肽在无糖情形下的分子量是18，236Pa。在完整的EPO分子中，分子量中约有40%为碳水化合物基团，其在蛋白质糖基化作用位置上将蛋白质糖基化(Sasaki, H, Bothner, B, Dell, A andFukuda, M(1987) J.Biol.Chem.262:12059)。
[0006]因红细胞生成素`是形成红细胞所必要的，所以EPO可用来治疗红细胞低下或缺失的血液失调症。就临床而言，EPO可用于治疗慢性肾衰竭病人(CRF) (Eschbach, Jff, Egri,JC, Downing, MR et al.(1987)NEJM 316:73-78 ；Eschbach, Jff, Abdulhadi，MH, Browne, JKet al.(1989)Ann.1ntern.Med.1ll:992 ；Egrie, JC, Eschbach, Jff, McGuire, T, Adamson,Jff(1988)Kidney Intl.33:262 ；Lim, VS,Degowin RL,Zavala,D et al.(1989)Ann.1ntern.Med.110:108-114)、AIDS 及接受化疗的癌症病人的贫血(Danna, RP, Rudnick, SA, Abels,RI In:MB, Garnick, ed.Erythropoietin in Clinical Applications-An InternationalPerspective.New York, NY:Marcel Dekker ； 1990:p.301-324)。然而，目前 EPO 蛋白质治疗的生物利用率，受限于不良的血浆半衰期，以及蛋白酶的降解作用，使其难以获得良好的临床效力。
【
【发明内容】
】
[0007]本发明的目的为提供一种具有较长半衰期的高糖基化红细胞生成素。
[0008]为达上述目的，本发明另提供一种重组蛋白，包括:红细胞生成素；高糖基化片段；人类绒毛膜促性腺激素的羧基末端肽，以及促血小板生成素的羧基末端肽。[0009]本发明更提供一种核苷酸序列，其编码上述重组蛋白。
[0010]本发明更提供一种细胞，其转染上述核苷酸序列以表达上述重组蛋白。
[0011]本发明更提供一种组合物，包括上述重组蛋白，以及药学上可接受的载体或佐剂。
[0012]为了让本发明的上述和其他目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图示，作详细说明如下:
【【具体实施方式】】
[0013]本发明提供一种长效型红细胞生成素，及其制备与使用方法。
[0014]在一个实施方案中，本发明提供一种重组蛋白，其包括一红细胞生成素以及一高糖基化片段。[0015]本发明所述的“红细胞生成素(EPO) ”包括任何来源的EPO蛋白，特别是指人类或动物ΕΡ0。本发明的EPO不限于自然的EPO蛋白，也包括其衍生物、相似物、修饰物、突变物等，只要其具有自然EPO蛋白的活性即可。
[0016]本发明也包括任何具有EPO活性的蛋白质，例如突变或其他修饰蛋白等。可藉由DNA重组技术在CHO、BHK、COS、HeLa或PER.C6或其他适合的细胞株中表达重组ΕΡ0,相关内容可参考美国专利 US5, 733，761、US5, 641，670、US5, 733，746、US5, 994，122、US5, 733，761、US5, 641，670、US5, 981，214 及 US5, 272，071。EPO 的制备与治疗上应用可参考 US5, 547，933、US5, 621，080，Huang, S.L.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1984) 2708-2712，Lai, P.H.et al., J.Biol.Chem.261 (1986) 3116-3121, Sasaki, H et al., J.Biol.Chem.262 (1987) 12059-12076。较佳的 EPO 种类为人类 EPO。
[0017]本发明所述的“高糖基化片段”系指具有至少一个糖基的10-30个氨基酸片段。本发明的高糖基化片段具有一个或多个N-或O-连接糖基化位置，可产生一个或多个糖基。例如，SEQ ID N0:l、2 及 / 或 3，或与 SEQ ID NO:1、2、3 所示序列同一性在 65%、70%、80%，优选为90%以上的序列。
[0018]高糖基化与EPO融合形成本发明的重组蛋白，高糖基化片段可位于EPO的氨基端(N端)或羧基端(C端)，且数目并无特别限制。例如，可于EPO的N端及/或C端连接一个或多个相同或不同的高糖基化片段。含有高糖基化片段的EPO具有较长的半衰期，以及较佳的活性。
[0019]上述本发明重组蛋白可更包括人类绒毛膜促性腺激素(human ChorionicGonadotropin, hCG)的羧基末端妝(carboxyterminal peptide)。
[0020]本发明所述的“人类绒毛膜促性腺激素的羧基末端肽(以下简称CTP) ”是指人类绒毛膜促性腺激素第112-118至145个氨基酸的片段，或具有相同生物活性的变异体或类似物。因可分别从hCG的第112、113、114、115、116、117或118个氨基酸开始，因此CTP可为具有28、29、30、31、32、33或34个氨基酸的片段。
[0021]本发明的CTP包括，但不限于，SEQ ID NO:4，或与SEQID NO:4所示序列同一性在65%、70%、80%，90%，优选为95%以上的序列。
[0022]本发明的CTP可位于EPO的N端或高糖基化片段的C端，且数目并无特别限制。例如，可在EPO的N端或高糖基化片段的C端连接一个或多个相同或不同的hCG的CTP。
[0023]本发明的CTP可作为蛋白质或肽的保护者，抑制蛋白质或肽的分解。在本发明中，hCG的CTP可延长重组蛋白的半衰期，以及增进重组蛋白的效价。
[0024]上述本发明重组蛋白可更包括促血小板生成素(Thrombopoietin, ΤΡ0)的羧基末端肽。
[0025]本发明所述的“血小板生成素的羧基末端肽(以下简称TPS) ”是指促血小板生成素第176至353个氨基酸的片段，优选为第337至353个氨基酸的片段，或具有相同生物活性的变异体或类似物。
[0026]本发明的TPS包括，但不限于，SEQ ID NO:5，或与SEQ ID NO:5所示序列同一性在65%、70%、80%，90%，优选为95%以上的序列。
[0027]在一实施例中，本发明的TPS可位于EPO的N端或高糖基化片段的C端，且数目并无特别限制。例如，可在EPO的N端或高糖基化片段的C端连接一个或多个相同或不同的TP S。
[0028]在另一个实施方案中，本发明TP S可位于EPO的N端或CTP的C端，且数目并无特别限制。例如，可在EPO的N端或CTP的C端连接一个或多个相同或不同的TPS。
[0029]本发明TPS可作为蛋白质或肽的保护者，抑制蛋白质或肽的分解。在本发明中，TPS可延长重组蛋白的半衰期，以及促进重组蛋白的效价。
[0030]本发明的高糖基化片段、CTP与TPS也包括经修饰的高糖基化片段、CTP与TPS。熟悉此【技术领域】人士可以一般传统的技术对肽或DNA序列进行修饰。例如，蛋白质序列的修饰可包括改变、置换、取代、插入或删除编码序列中的一个或多个氨基酸。改变、置换、取代、插入或删除序列所使用的方法为一般所熟知的技术。序列在改变、置换、取代、插入或删除后，优选仍保有原始高糖基化片段、CTP与TPS的活性。
[0031]在一个实施方案中，修饰包括，但不限于，N-端修饰、C-端修饰、多肽链修饰，如CH2-NH, CH2-S, CH2-S = 0、0 = C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S = C_NH、CH = CH 或 CF = CH、骨架修饰(backbone modifications)与残基修饰(residue modification)。妝化合物的制备方法已为熟知，例如，可参照 Quantitative Drug Design, C.A.Ramsden Gd.，Chapter 17.2,F.Choplin Pergamon Press (1992)。
[0032]在一个实施方案中，多肽中的肽键(-C0-NH-)可被取代，例如，可被N-甲基键(-N(CH3) -CO-)、酯键(-C (R) H-C-0-0-C (R) -N-)、酮甲基(ketomethylen)键(-CO-CH2-)、a -aza键(_NH_N (R) -CO-)，其中R为任意烷基、羟乙基键(一CH (OH) -CH2-)、硫代酰胺(thioamide)键(-CS-NH-)、烯双键(-CH = CH-)、酰胺键(-NH-C0-)、多肽衍生物(-N(R) -CH2-CO-)取代。
[0033]本发明另提供一种重组蛋白，包括红细胞生成素(EPO);高糖基化片段；人类绒毛膜促性腺激素的羧基末端肽(CTP)，以及促血小板生成素的羧基末端肽(TPS)。
[0034]在此重 组蛋白中，EPO的C端连接高糖基化片段，在高糖基化片段的C端连接CTP，在CTP的C端连接TPS。
[0035]在一个实施方案中，高糖基化片段包括，但不限于，SEQ IDN0:1、2及/或3。可在EPO的C端连接一个或多个相同或不同的高糖基化片段。例如，在EPO的C端连接SEQ IDN0:l、2或3，或连接2个以上的SEQ ID NO:1、2及/或3 ;或在EPO的C端依序连接SEQ IDNO: 1、2与3，或依序连接SEQ ID NO: 3、2与I。在一个实施方案中，EPO的C端依序连接SEQID NO:1、2 与 3。[0036]在一个实施方案中，CTP为SEQ ID NO:4。
[0037]在一个实施方案中，TPS为SEQ ID NO:5。
[0038]在一个实施方案中，本发明的重组蛋白包括SEQ ID NO:1、2、3、4与5。在另一个实施方案中，本发明的重组蛋白为SEQ ID N0:6。
[0039]本发明另提供一种核苷酸序列，其编码本发明的重组蛋白。
[0040]本发明的“核苷酸”是指单链或双链的核苷酸序列，其可由RNA序列、cDNA序列、基因序列表示和/或上述的组合。
[0041]在本发明的核苷酸序列可利用PCR技术或其它熟知的技术制备，相关技术可参考，例如，"Current Protocols in Molecular Biology" , eds.Ausubel et al., JohnWiley & Sons,1992。
[0042]本发明的核苷酸序列可插入表达载体以表达重组蛋白。在一个实施方案中，表达载体包括其它额外的多肽，使其可在原核或真核细胞中复制与重组。在另一个实施方案中本发明的表达载体包括转录与转译的起始序列(如，启动子或增强子)以及转录与转译的终止序列(如，聚腺苷酸)。
[0043]可使用各种真核或原核细胞作为宿主表达系统，以表达本发明的核苷酸序列。在一个实施方案中，此表达系统包括，但不限于，各种微生物，例如，细菌、真菌，植物细胞，真核细胞(例如，哺乳动物细胞，CHO细胞)等。
[0044]本发明的表达载体可利用各种方法转染至细胞中。此方法可参考SambiOOk etal., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1989,1992), in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,Johnffiley and Sons, Baltimore, Md.(1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRCPress, Ann Arbor, Mich.(1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann ArborMich.(1995), Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths，Boston Mass.(1988)以及 Gilboa et at.[Biotechniques 4(6):504-512,1986]，且包括，例如，稳定或暂时性转染、脂质体转染、电穿孔转染、或感染重组病毒载体。
[0045]本发明另提供一种组合物，包括上述的重组蛋白，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
[0046]本发明所述的“药学上可接受的载体或赋形剂”是指不会刺激个体组织，且不会抑制给予药物或化合物的生物活性及特性的载体、赋形剂或佐剂。载体包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、或可溶于有机介质与水性介质的生物相溶性聚合物。赋形剂包括，但不限于，碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油与聚乙二醇。
[0047]本发明的组合物可用于治疗贫血患者。贫血患者包括，但不限于，慢性肾功能不全患者、终末期肾脏病患者、接受透析的患者、慢性肾功能衰竭患者、艾滋病患者，癌症患者、化疗患者，以及预定接受非心脏、非血管外科手术的贫血患者。
[0048] 在给予贫血患者治疗有效量的本发明组合物后,可有效地增加贫血患者的血球容积比，且于本发明的高糖基化红细胞生成素在个体中具有较长的半衰期。本发明的高糖基化红细胞生成素具有比市售红细胞生成素(如，KprcxE^ArancspA:)更长的半衰期，例如，本发明高糖基化红细胞生成素的半衰期是市售红细胞生成素的I倍以上，优选2倍以上，更优选3倍以上。在另一个实施方案中，本发明的高糖基化红细胞生成素具有比市售红细胞生成素(如，EpreX? 及 Aranesp? )更高的 AUC 值(area under curve)。
[0049]本发明所述的“治疗有效量”一般是指约I至100001.U./kg个体重量，优选约50至20001.U./kg个体重量，更优选约50至6001.U./kg个体重量，最优选约50至3001.U/kg个体重量。
[0050]本发明的组合物可在任何所需的频率或间隔给药。给药的方式，例如，可为每两周三次，每周一次，每两周一次，每三周一次，每月一次，每五周一次，每六周一次，或更频繁或不频繁的间隔，或在任何所需的频率，或任何的时间间隔组合。本发明的活性成份的剂量可依照个体的种类，个体的大小、疾病的严重性等做适当的调整。例如，若个体为接受化疗的癌症患者，则给药频率可为每三周一次，以配合化疗的时程(化疗大都每三周一次)。
【【专利附图】
【附图说明】】
[0051]图1:显示本发明EPO-NNCT基因片段的设计。
[0052]图2:显示本发明EPO-NNCT与市的活性比较。
[0053]图3:显示本发明EP0-NNCT、市售Eprex?以及Eprex?药物动力特性(ρκ)的比较(静脉注射)。
[0054]图4:显示本发明EP0-NNCT、市售Eprex?以及Eprex?药物动力特性(PK)的比较(皮下注射)。
【【具体实施方式】】
[0055]实施例1.宿主表达细胞
[0056]本实施例的宿主表`达细胞使用缺少二氢叶酸还原酶的中国仓鼠卵巢细胞(CH0dfhr-)，其购买自台湾食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(CCRC，60133)。将CHO dfhr-细胞培养于 IMDM培养基(Isocoves Modified Dulbecco’s Medium IMDM ；GibcoCat.12200-36)中，其中含有10 %的胎牛血清(Gibco Cat.10091148)、次黄嘌呤与胸腺嘧啶(Gibco, Cat.11067-030)、以及 2mM 的 L-麸酰胺(Gibco Cat.25030-081)。Dhfr (-)标志被用来表达及筛选。藉由使用二氢叶酸还原酶抑制剂“甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)”(Sigma Cat n0.M8407)使dhfr基因表达。当dfhr基因表达时，其他邻近基因也被一起表达，选择表达量高的细胞株，将细胞培养于37°C，5% CO2的培养箱中(Mode13326，Formascientific)。
[0057]实施例2.pND/EPO-NNCT表达载体的构建
[0058]利用组合式PCR (assembly PCR)，将 EP0-NNCT 基因片段(SEQ ID NO:6)插入pcDNA3.1/Neo (+) /DHFR载体，形成pND/EPO-NNCT载体。此表达载体包含作为筛选标志的抗新霉素基因(neomycin-resistance gene)。EP0-NNCT的基因片段如图1所示，其中EPO为红细胞生成素，NI为高糖基化片段I (SEQ ID NO:1)，N2为高糖基化片段2 (SEQ ID NO:2),N3为高糖基化片段3 (SEQ ID NO:3)，CTP为人类绒毛膜促性腺激素的羧基末端肽(SEQ IDNO:4)，TPS为促血小板生成素的羧基末端肽(SEQ ID NO:5)。
[0059]实施例3.重组细胞株的建立
[0060]将含有人类EPO-NNCT基因的载体以电脉冲法(PA4000 PulseAgileKelectroporator, Cyto Pulse Sciences)转染至CHOdhfr-细胞内。首先将细胞以膜蛋白酶处理后，将细胞悬浮于CP-T缓冲液(Cyto pluse Cat.CP-T)中使细胞密度为3xl06细胞/ml。将200 μ I的细胞悬浮液(6χ105细胞)与10 μ g的pND/BMP2混合后进行电脉冲处理，将经电脉冲处理的细胞培养于不含筛选物质的完全培养基(含10%胎牛血清及HT补充物(HT Supplement)之MDM)使细胞恢复成长。培养于不含筛选物质的培养基48小时后，将细胞移至含有MDM、10%胎牛血清、L-麸酰胺及5nM甲氨蝶呤的含筛选物质的完全培养基中。在培养2周后，将细胞株移至96孔盘中，并利用ELISA定量分析筛选出高表达rhBMP-2的细胞株。将筛选出的细胞培养于筛选培养基中。将细胞稀释至I细胞/100 μ I的浓度后移至96孔盘中培养至生长成细胞丛。利用ELISA检测并定量ΒΜΡ-2蛋白，再依据ELISA的结果筛选出高产量细胞并逐步增加MTX浓度从0.005,0.01,0.02至0.05 μ Μ。
[0061]实施例4.批次培养
[0062]将实施例3所获得的高产量细胞进行批次培养。使用50ml搅拌式培养槽，接种4xIO5细胞/ml的细胞在无血清的培养基中培养一个批次，且每天记录细胞生长状况及收集培养基以进行定量，在给予0.02 μ M MTX的条件下，其产量可达140.69 μ g/ml，如表一所示。
[0063]表一、批次培养结果
[0064]
【权利要求】
1.一种重组蛋白，包括: 红细胞生成素； 闻糖基化片段； 人类绒毛膜促性腺激素的羧基末端肽，以及 促血小板生成素的羧基末端肽。
2.权利要求1所述的重组蛋白，其中所述红细胞生成素的羧基端连接所述高糖基化片段。
3.权利要求1所述的重组蛋白，其中所述高糖基化片段的羧基端连接所述人类绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。
4.权利要求1所述的重组蛋白，其中所述人类绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的羧基端连接所述促血小板生成素的羧基末端肽。
5.权利要求1所述的重组蛋白，其中所述高糖基化片段包括SEQID N0:l、2及/或3，或同一性在90%以上的序列。
6.权利要求1所述的重组蛋白，其中所述人类绒毛膜促性腺激素的羧基末端肽为SEQID NO:4，或同一性在90%以上的序列。
7.权利要求1所述的重组蛋白，其中所述人类绒毛膜促性腺激素的羧基末端肽为SEQID NO:5，或同一性在90%以上的序列。
8.权利要求1所述的重`组蛋白，其中所述重组蛋白为SEQIDNO:6，或同一性在90%以上的序列。
9.一种核苷酸序列，其编码权利要求1所述的重组蛋白。
10.一种细胞，其包括权利要求9所述的核苷酸序列，且表达权利要求1所述的重组蛋白。
11.权利要求10所述的细胞，其中所述细胞为CHO细胞。
12.—种组合物，包括权利要求1所述的重组蛋白，以及药学上可接受的载体或佐剂。
【文档编号】C12N5/10GK103864913SQ201210551666
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月18日 优先权日:2012年12月18日
【发明者】彭文君, 杨淑萍, 彭宏智, 陈郁鸿 申请人:联亚生技开发股份有限公司