天山雪莲SikTrxh基因在植物抗逆中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种天山雪莲SikTrxh基因在培育抗逆植物中的应用，本发明从天山雪莲中克隆SikTrxh基因，利用上述基因构建植物表达载体，通过遗传转化获得抗逆转基因植物。本发明从天山雪莲中克隆SikTrxh基因，并在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗逆性，通过该基因的过量表达，使植物对低温、干旱、盐以及氧化胁迫的抵抗性能得到提高，最终获得抗逆能力明显增强的植物。从天山雪莲中筛选、克隆出与抗寒直接相关的基因，并将其用于农作物品种改良，具有重要的学术和经济价值。
【专利说明】天山雪莲SikTrxh基因在植物抗逆中的应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种从菊科凤毛菊属植物天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.etKir)中克隆得到SikTrxh基因，构建组成型植物表达载体，转化植物，并对抗逆效果进行评价，增强植物的抗逆性。
【背景技术】:
[0002]低温、干旱和盐等非生物胁迫是影响作物产量和品质的重要因素。植物遭受非生物胁迫时会产生大量的活性氧(ROS)，直接损害植物细胞，使膜系统破坏，细胞脱水，从而影响细胞代谢。通常植物会通过调节自生抗氧化酶类来消除或减缓过多的ROS带来的损害，而机体内的硫氧还蛋白也是消除细胞过多ROS的重要成员(Xu WS, Ngo L, Perez G,Dokmanovic M，Marks PA(2006).1ntrinsicapoptotic and thioredoxin pathways inhuman prostate cancer cell response to histone deacetylase inhibitor.Proc NatlAcad Sci USA，103:15540-15545)。
[0003]目标蛋白氧化还原的调节，越来越多的通过巯基二硫化的转变而改变。硫氧还蛋白(Thioredoxins，Trxs)是一类广泛存在于生物体内的小分子稳定类蛋白，在进化中形成高度保守的氧化还原位点WCGPC，通过这两个Cys残基参与氧化还原反应(HolmgrenA (1989).Thioredoxin and ghtaredoxinsystems.J Biol Chem，264:13963-13966)。高等植物包含两类硫氧还蛋白系统:铁氧还蛋白/硫氧还蛋白系统(FTR/Trx)和NADP/硫氧还蛋白系统(NTR/Trx)。前者是定位在叶绿体，由核编码的硫氧还蛋白f和m组成，通过FTR提供电子将硫氧还蛋白还原；后者由硫氧还蛋白h组成，在非光合组织中通过NTR提供电子还原硫氧还蛋白(Buchanan, BB (1991).Regulation of CO2 assimilation inoxygenicphotosynthesis:the ferredoxin/thioredoxin system.Perspective on its discovery,present status andfuture development.Arch Biochem Biophys，288:1-9)。对拟南芥完整的基因组测序显示，高等植物硫氧还蛋白属于多基因家族，根据氨基酸序列同源性将硫氧还蛋白分为六大类(Trxf，Trxh, Trxm, Trxo, Trxx 和 Trxy)。Trxf，Trxm, Trxx 和 Trxy 定位在叶绿体，通过调节碳代谢相关酶活来参与磷酸戊糖和C4途径(Gelhaye E，Rouhier N，Navrot N，Jacquot J P (2005).The plant thioredoxin system.Cell Mol LifeSci,62:24-35)。而Trxo定位在线粒体，具有调节线粒体的基本功能(Balmer，Y.，Vensel，I H.，Tanaka，C.K.，Hurkman, W.J.，Gelhaye, E.，Rouhier，N.，J acquot，J.P.，Manieri，W.，Schiirmann, P., Droux, M.，et al.，(2004).Thioredoxin links redox to the regulationof fundamental processes of plant mitochondria.PNAS,101(8):2642-2647)。
[0004]Trxh主要定位在细胞质，但也发现存在于线粒体、内质网和细胞核MarcusF，Chamberlain SH, ChuC，Masiarz FR，Shin S，Yee BC, Buchanan BB (1991).Plant thioredoxin h:an animal-like thioredoxinoccurring in multiple cellcompartments.Arch Biochem Biophys, 287:195-198 ；Ishiwatari Y，Honda C，KawashimaI，Nakamura S，Hirano H，Mori S，Fujiwara T，Hayashi H，Chino M(1995)Thioredoxin his oneof the major proteins in rice phloem sap.Planta，195:456-463 ;Serrato AJ,Cejudo F J (2003).Type-hthioredoxins accumulate in the nucleus of developingwheat seedt issues suffering oxidative stress.Planta，217:392-399)。早期认为Trxh对种子的萌发和幼苗的发育起到重要作用(Marx C，Wong JH，BuchananBB (2003).Thioredoxin and germinating barley:targets and protein redox changes.Planta,216:454-460)，在大多数植物中也可做为信号蛋白(Schobert C，Baker L，SzederkenyiJ，Grossmann P，Komor E，HayashiH，Chino M，Lucas WJ (1998).1dentificationof immunologicalIy related proteins in sieve-tube exudatecoIlected frommonocotyledonous and dicotyledonous plants.Planta，206:245-252)。近年来随着分子生物学的发展，研究证明植物硫氧还蛋白是氧化胁迫应答中的关键因素，而活性氧(ROS)可以诱导植物硫氧还蛋白基因的表达。例如拟南芥在氧化胁迫条件下，AtTrxh5的表达明显增加(Laloi C，DominiqueMO, Marco Y，Meyer Y，Reichheld JP (2004).TheArabidopsis cytosolic thioredoxin h5 geneinduction byoxidative stress and itsW-box-mediated response to pathogen elicitor.Plant Physiol，134:1006-1016)。甲基紫精处理水稻幼苗也增加了 OsTrxh的转录水平(Tsukamoto SiMorita SiHira no EiYokoiHiMasumura T，Tanaka K (2005).A novel cis-element tha is respon-sive to oxidativestress regulat es three antioxidantdefense genes in rice.Plant Physiol,137(I):317-327) o AtTrxt^可做为分子伴侣增强拟南芥热休克(PariiSK，Jung YJ，Lee JR，Le eYM, Jang HH, Lee SS, Park JH, Kim SY, Moon JC, Lee SY, et al (2009).Heat-shock andredox-dependent functional switching of an h-type Arabidopsis thioredoxin froma disulfidereductase to a molecular chaperone.Plant Physiol，150:552-561)。拟南芥中还存在一类基质蛋白CDSP32，它包含2个硫氧还蛋白活性位点，在质体抵抗氧化胁迫中起重要作用(Broin M，Cuine S，Eymery F，Rey P (2002).The plastidic 2-cysteineperox-1redoxin is a target for a thioredoxin involved in theprotection of thephotosynthetic apparatus against oxidative damage.Plant Cell，14: 1417-1432)。此外，硫氧还蛋白还参与调节SOD、CAT、GLP等酶活，保护植物减缓氧化胁迫的损伤。在体外，OsTRXhl也同样具有活性，它能够对过氧化氢敏感的Trx缺失酵母突变体重新获得抗性(Zhang CJ, Zhao BC, GeWN, Zhang YF, Song Y，Sun DY，and Guo Y (2011).An ApoplasticH-Type Thioredoxin Is Involved in theStress Response through Regulation of theApoplastic Reactive Oxygen Species in Rice.Plant Physiology, 157:1884-1899)。
[0005]作为新疆的特色植物，新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir)，又名天山雪莲、雪莲花等。属菊科凤毛菊属，主要生长于海拔2400~4100m的高山草甸、高山冰碛石和流石滩石隙、悬崖峭壁石缝等处。那里气候多变，冷热无常，雨雪交替，最高月平均温3~5°C，最低月平均温-19~_21°C，年降水量约800毫米，无霜期仅有50天左右。
[0006]天山雪莲经过长期的自然选择，形成了稳定的特殊结构、功能和遗传基因，产生了适应极端环境条件下的生理和生化机制，这种与环境相适应的机制，与一般的耐冷、抗寒应答性的适应机制不同，主要表现在其低温条件下能够正常的生长发育，而一般的抗寒性植物在相应的低温条件下，生长发育受到抑制。近年来植物抗寒基因工程得到迅速发展，并研究出了多种转基因抗寒植物，为培育抗寒植物开辟了新途径。雪莲生活在极端环境中，是一种极好的抗寒基因的资源，至今，国内外对雪莲硫氧还蛋白的研究还未见文献报道。利用这种具有特色稀有植物，从中筛选、克隆出与抗寒乃至更多抗逆直接相关的基因，揭示雪莲适应性的机制，研究其遗传基础，充分发掘其潜在的基因资源，并将其用于表作物品种改良，具有巨大的学术和经挤价值。
【发明内容】
:
[0007]在前期的研究中，我们利用GateWay技术构建的低温胁迫下天山雪莲叶片组织的cDNA文库，从天山雪莲文库中筛选克隆到了天山雪莲硫氧还蛋白基因SikTrxh。为了研究该基因的功能，我们构建了该基因的植物表达载体，并将此基因导入烟草中，提高植物的抗逆性。
[0008]本发明的一个目的是为植物抗逆育种提供有价值的天山雪莲硫氧还蛋白基因SikTrxh，其发明目的还在于构建植物表达载体:PBI121-SikTrxh，在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗寒性、抗旱性和耐盐性，通过该基因的过量表达，使植物的抗逆胁迫性能得到提高，最终获得抗寒性、抗旱性和耐盐性能力明显增强的植物。
[0009]本发明的目的是通过以下过程和方法实现的:
[0010]本发明所述的从天山雪莲中克隆SikTrxh基因，其序列为〈210>1。
[0011]本发明的从天山雪莲中克隆SikTrxh基因的过程如下:
[0012]提取经低温处理的天山雪莲RNA，并以RNA反转录成的cDNA为模板，利用Primer5.0设计分别带有 BamHI和SacI的PCR引物Pl和P2进行扩增，得到目的基因；
[0013]构建SikTrxh基因植物表达载体pBI121_SikTrxh ；
[0014]利用上述基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化获得转基因植物:
[0015]将生长在光照培养室中2个月的对照植株和2种不同株系的转基因植株，经低温、干旱、盐胁迫处理，分别剪取叶片进行相关生理指标的测定，所有实验每个指标重复测定3次。
[0016]低温胁迫试验中，随着温度的下降，转SikTrxh基因烟草的相对电导率、MDA含量始终低于对照组烟草，且上升趋势小于对照组烟草，伤害率较对照低；S0D、CAT、APX酶活力呈现明显的上升趋势。转SikTrxh基因烟草在低温胁迫下表现出较强的抗寒性。
[0017]在200mmol.T1NaCl胁迫中，转SikTrxh基因烟草的相对电导率、MDA含量始终低于对照组烟草，且上升趋势小于对照组烟草，伤害率较对照低；S0D、CAT、APX酶活力呈现明显的上升趋势。转SikTrxh基因烟草在盐胁迫下表现出较强的抗盐性。
[0018]干旱胁迫试验中，转SikTrxh基因烟草的相对电导率、MDA含量始终低于对照组烟草，且上升趋势小于对照组烟草，伤害率较对照低；S0D、CAT、APX酶活力呈现明显的上升趋势。转SikTrxh基因烟草在干旱胁迫下表现出较强的抗旱性。
[0019]转天山雪莲硫氧还蛋白基因SikTrxh烟草的抗逆功能研究表明，转基因烟草对低温、高盐和干旱都表现出了较强的抗性水平。
【专利附图】
【附图说明】:
[0020]图1 是天山雪莲 SikTrxh 基因 PCR 扩增图 Figl:SikTrxh gene PCR amplified
[0021]图 2 是 pGM-SikTrxh PCR 鉴定图Fig2:PCR identification ofpGM-SikTrxh
[0022]图 3 是 SikTrxh 进化分析图Fig3:Phylogenetic analysis SikTrxh
[0023]图 4 是 pBI121-SikTrxh PCR 鉴定Fig4:PCR identification ofpBI121-SikTrxh
[0024]图 5 是 pBI121_SikTrxh 酶切鉴定Fig5 !Restriction enzyme digestionidentification of pBI121_SikTrxh
[0025]图 6 是转化 GV3101PCR 鉴定Fig6:PCR identification ofpBI121-SikTrxh-GV3101
[0026]图7 是转化烟草 PCR 检测Fig7:PCR identification oftransformed tobacco
[0027]图8 是转基因烟草 RT-PCR分析Fig8:RT_PCR analysis on transgenictobacco
[0028]图9是低温、盐和干旱胁迫下烟草叶片相对电导率 Fig9:Change of relativeelectric conductivity intobacco leaves under low temperature， salt and droughtstress
[0029]图10是低温、盐和干旱胁迫下烟草叶片MDA含量 Fig.10:Change of MDAcontent in tobaccoleaves under low temperature， salt and drought stress
[0030]图11是低温、 盐和干旱胁迫下烟草叶片SOD酶活性、APX酶活性和CAT酶活性Fig.11:Changesof SOD activity, APX activity and CAT activity in tobacco leavesunder low temperature, salt and droughtstress
[0031]图12是pBI121_SikTrxh的植物表达载体构建流程图
[0032]图1 中:
[0033]1:阴性对照；2:SikTrxh ；M:Marker I
[0034]图2 中:
[0035]1-8:pGM-SikTrxh ；9:阴性对照；10:阳性对照；M =Marker I
[0036]图4 中:
[0037]1:阳性对照；2:pBI121-SikTrxh ；M =Marker I
[0038]图5 中:
[0039]1,2:pBI121-SikTrxh ；3:阴性对照；M =Marker I
[0040]图6 中:
[0041]1-12:pBI121-SikTrxh-GV3101 ；13:阳性对照；14:阴性对照；M =MarkerIII
[0042]图7 中:
[0043]1-8:烟草DNA PCR产物；9:阳性对照；10:空白烟草对照；M =MarkerIII
[0044]图8 中: [0045]1:阳性对照；2:空白烟草对照；4，5，6，8，10:烟草cDNA PCR产物；M =MarkerIII【具体实施方式】:
[0046]实验所涉及的药品琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为北京康为世纪公司生产；M_MLV酶购自 TaKaRa 公司；RNA 酶、Taq 酶、pGM_T、T4-DNA 连接酶(T4-DNA ligase)、Marker、TRNzol总RNA提取试剂购于TIANGEN公司；BamH1、SalI等限制性内切酶为Fermentas公司原装；IPTG、X-gaI及抗生素、植物激素购自上海Sangon公司；其他试剂及配制MS培养基的各种试剂均为国产分析纯。具体实验操作依据[美]J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔的《分子克隆实验指南》。
[0047]实施例1:从天山雪莲中克隆到SikTrxh基因
[0048]1.1天山雪莲总mRNA的提取
[0049]1)将研钵及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的枪头、离心管均使用0.1 %的DEPC处理，高压灭菌；
[0050]2)取植物幼嫩叶片约0.1g于研钵中，加液氮充分研磨至粉末状；
[0051]3)将粉末分装至1.5mL的小离心管中，加入1ml的TRNzol提取试剂，充分快速混匀，室温放置3-5min。
[0052]4) 10000rpm,4°C离心5min,吸上清至一新的离心管,加入200 μ I氯仿,剧烈振荡混匀；
[0053]5) 10000rpm，4°C离心5min，吸取上层液体至另一新的离心管后，加入600 μ I预冷的异丙醇，于-2011C沉淀30min ；
[0054]6) 10000rpm，4°C离心10min后，倒掉液体，在离心管底部即可见到白色沉淀，即为总 RNA。
[0055]7)用70%的乙醇(DEPC处理)洗涤沉淀2次后，吸干液体，吹干后加入30 μ IddH20 (DEPC处理)溶解，保存于_20°C备用。
[0056]1.2cDNA第一链的合成
[0057]在DEPC 处理的 0.2ml 离心管中加入 RNA 5 μ 1，Oligo dT 2 μ 1，ddH20 5 μ I 后，在75°C水浴IOmin后迅速置于冰上2min。然后在离心管中加入dNTP(2.5mmol/L) 2ul,Rnase Inhibitor I μ 1，M-MLV-RT 反转录酶 I μ 1，DEPC ddH20 5ul,42°C lhr,70°C 15min后，-20°C保存。
[0058]1.3cDNA第二链的合成及扩增
[0059]在PCR反应管中加入cDNA第一链反应产物，用Pl和P2为引物进行扩增，同时以去离子水为模板作为阴性对照进行扩增。
[0060]P1 为:5 ’ -GGATCC AAAATGGCGGAAGAAGGA-3，
[0061]BamHI
[0062]P2:为:5，-GAGCTC GGAAACACATAAGTTGCT-3 ’
[0063]Sacl
[0064]PCR 反应体系(20 μ I)为:
[0065]
【权利要求】
1.一种从天山雪莲中克隆的SikTrxh基因，其序列为〈210>1，其特征在于该基因编码区全长354bp，编码117个氨基酸。
2.根据权利要求1所述核苷酸序列构建的植物表达载体。
3.根据权利要求1所述核苷酸序列的用途，其特征在于利用上述基因构建植物表达载体，通过遗传转化获得的抗逆转基因植物 。
【文档编号】C12N9/02GK103882036SQ201210556121
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2012年12月20日
【发明者】祝建波, 刘超, 王爱英, 沈海涛, 冯玉杰 申请人:石河子大学