专利名称：一种Lactobacillus casei Zhang(CGMCC 1697)的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测Lactobacillus casei ZhangCCGMCC 1697)的检测方法的设计，应用该方法可以对肠道中的Lactobacillus casei ZhangCCGMCC 1697)进行检测，可准确，快速的完成发酵乳制品，发酵食品以及人体肠道中益生菌Lactobacillus caseiZhang (CGMCC 1697)定性和定量测定。
背景技术：
Lactobacillus casei Zhang (CGMCC 1697)是从内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库保藏的243株分离自自然发酵酸马奶中的乳杆菌中优选的I株具有优良益生特性的乳杆菌。该菌株在消化系统中具有优异的耐受胃酸、胆盐和牛磺胆酸钠水解能力。其具有乳杆菌共同的特性，即为革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性、硝酸盐还原试验阴性、不液化明胶、无运动性、能在PH4. 5的BLB液体培养基中生长发育。L. casei ZhangCCGMCC 1697)属同型乳酸发酵乳杆菌，葡萄糖发酵不产气，经EMP途径只产生乳酸，且产生L-乳酸。能够利用核糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖、山梨醇以及七叶苷、水杨苷和甘露醇产酸，而不从阿拉伯糖、木糖、蜜二糖、棉子糖产酸，不代谢乳糖或弱发酵乳糖，不发酵鼠李糖。Lactobacillus casei ZhangCCGMCC 1697)菌株已经在申请号为 200610127362. 2、200710129939. 8的中国专利申请中公开，在此将上述专利文献公开的全部内容引入作为参考。进一步经16S rDNA 序列分析,表明 L. casei Zhang (CGMCC 1697)与 L. casei 标准菌株ATCC 334的同源性为100%。L. casei Zhang (CGMCC 1697)具有较强的抗人工胃液消化能力，在pH值为3. 0和PH值为4. 0的人工胃液中持续消化3h后其活菌数量不受影响，人工胃液消化后进入人工肠液消化24h后，仍保持较高数量的活菌。L. casei Zhang (CGMCC 1697)对胆盐具有极强的耐受性，能够耐受介质中胆盐的最大浓度为I. 6g/100mL。L. casei Zhang (CGMCC 1697)在生长过程中可以分解培养介质中的牛磺胆酸钠释放出游离胆酸，对介质中胆固醇的脱除量为74. 41mg/L，胆固醇降低率为49. 61%。用L. casei Zhang (CGMCC 1697)饲喂高脂血症模型大鼠，可显著降低血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和LDL-C浓度，HDL-C浓度显著升高。研究表明L. casei Zhang (CGMCC 1697)通过菌体对胆固醇的吸收吸附及减少肝肠循环中的胆酸来达到降血脂的功效。给小鼠灌服L. casei Zhang (CGMCC 1697), L. casei Zhang (CGMCC 1697)菌株能够在小鼠肠道内定殖，并对病原菌具有拮抗作用。小鼠灌服L. casei Zhang (CGMCC 1697)可以显著增加小鼠血清中IgG含量和肠粘膜SIgA含量，可以显著提高小鼠外周血中⑶3+、⑶4+、⑶8+的比例，优化了⑶4+/⑶8+比值，显著上调血清中IFN-Y和IL-12含量，下调IL-Ia和TNF-a水平。这些结果说明了 L. casei Zhang (CGMCC 1697)对小鼠的细胞免疫、体液免疫及肠黏膜局部免疫具有调节功能。动物实验表明L. casei ZhangCCGMCC 1697)具有显著抑制肝癌细胞H22细胞株具有显著的抑制作用。2007年，通过代谢调控的手段，完成了益生乳酸菌L. casei Zhang (CGMCC 1697)高密度发酵的小试和中试。200L发酵罐9次发酵发酵液中菌体密度平均可达2. 9X IOltlCfu/ml，发酵液经离心收集菌体后冷冻干燥可得到平均活菌数2. 65X10ncfu/g的菌粉，能够满足益生菌制剂和发酵剂对高活菌数的要求，已达到国际水平。为进一步研究L. casei Zhang (CGMCC 1697)在高密度发酵过程中的生长和代谢机制，采用荧光定量PCR (quantitative PCR, q-PCR)技术研究了发酵过程中一些关键基因的表达变化。分别于不同生长阶段和不同发酵条件下采集25组样品提取RNA，对涉及糖代谢和酸耐受能力的16个关键酶基因进行real-time PCR实验分析，包括葡萄糖激酶(gk), ￠-葡萄糖苷PTS E II (pts),磷酸-丝氨酸结合蛋白磷酸化酶(psh-p),代谢调节蛋白CcpA(ccpa),磷酸果糖激酶(pfk),果糖二磷酸醒缩酶(pba),磷酸甘油酸激酶(pgk),烯醇化酶(enolase),丙酮酸激酶(pk),乳酸脱氢酶(ldh), NAD依赖型醇脱氢酶(nad)、 FlFO-ATPase (atp), Malolactic enzyme (mal), citrate lyase (cit);大分子修复蛋白基因Gr0el，dnak。这些关键酶基因在发酵过程中的表达变化情况的研究为后续从分子水平深入研究乳酸菌的生长代谢调控机制奠定了良好的基础。同时也为乳酸菌高密度发酵剂的开发奠定了理论基础。10年前，当人类基因组计划顺利完成时，整个科学界都为之轰动一“生命密码”已经被破译，人类对自己的认识将愈发深刻。当科学家以为人类所有问题都将迎刃而解的时候，更多的事实却悄悄的指向了一个被我们忽视的领域——肠道菌群。正常的人体内存在大量的共生菌群，这些细菌大部分寄生在人的肠道中，超过1000万亿个，是人体细胞总数的10倍，其微生物基因数量约为300万个，大约是人类基因组基因数量的100多倍，如此海量的基因能够帮助微生物适应多变的环境，同时形成了与人体密不可分的互惠共生关系。经研究发现，肠道菌群的组成影响着每个人的健康，如肠道菌群结构紊乱与糖尿病、月巴胖症、高血压等代谢类疾病有关。同时也发现不同的人具有不同的肠道菌群组成结构，饮食、药物以及环境因素可以影响个体肠道菌群的组成。同样，不同肠道微生物结构和组成，也影响着宿主的营养物质加工、能量平衡、免疫功能、胃肠道发育及其他多种重要的生理活动。但是随着研究的深入，服用益生菌后，益生菌在体内的定植研究成为难点，怎样锚定目的菌种，怎样对目的菌种进行定量研究从而确定其体内定植数量是学者一直探索的问题。传统肠道菌群的研究是建立在纯培养技术之上的，但这些方法耗时费力，操作复杂，而且受到培养条件约束，并不能全面客观的反映肠道菌群的真实情况。分子生物学技术的飞速发展为肠道菌群研的究提供了全新的方法和思维，特别是荧光定量PCR技术(Q-PCR)，提供了基于非培养的微生物定性定量研究技术。本发明以L. casei Zhang (CGMCC 1697)的全基因组序列中一段特异性片段为依据，设计了针对该菌株的特异性引物，使用该引物对目的菌株进行PCR扩增和Q-PCR定量，可以快速准确的完成L. casei Zhang (CGMCC 1697)的定性定量研究。采用本发明的PCR和Q-PCR方法，能够对检测样品，例如包含益生菌的乳制品或食物、人体的消化道排泄物中所包含的L. casei Zhang (CGMCC 1697)进行准确的定性和定量研究。对L. casei ZhangCCGMCC 1697)的定性定量检测，意义重大。益生菌L. casei Zhang(CGMCC 1697)后续将应用于新型益生发酵乳制品以及益生菌饮品的生产，应用该技术可以快速精确的定性定量检测出上述食品中该益生菌的数量，为工业生产以及后续产品质量的检测提供重要保证和技术指导。此外，只有在对L. casei Zhang (CGMCC 1697)进行准确定量的基础上，才能够更有针对性地深入了解适宜L. casei Zhang (CGMCC 1697)体内定植的条件，从而更进一步地开发出具有相对更为优良的L. casei Zhang (CGMCC 1697)体内定植率的产品，更好地发挥L. casei Zhang (CGMCC 1697)的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速定性定量测定L. casei Zhang (CGMCC 1697)的方法。本发明以L. casei Zhang (CGMCC 1697)的全基因组序列中一段特异性片段为依 据，设计了针对该菌株的特异性引物，使用该引物对目的菌株进行PCR扩增分析和荧光定量PCR(Q-PCR定量)分析，可以快速准确的完成L. casei Zhang (CGMCC 1697)的定性定量研究，特别是发酵乳制品，发酵食品以及人体肠道中L. casei Zhang (CGMCC 1697)的定性
定量测定。本发明的定性定量检测L. casei Zhang (CGMCC 1697)方法主要包括如下步骤
(I)从检测样品中提取DNA，制备用于进一步扩增的模板DNA，其中提取DNA的方法和常用试剂是本领域技术人员公知的，例如可采用CTAB法等来提取获得模板DNA。(2)PCR扩增。以L. casei Zhang (CGMCC 1697)的全基因组序列为依据，设计如下引物序列LcZF: tgagccgctatctgatagtctt ；LcZ R: ccgacgtaccagctcact。利用设计的引物通过 PCR 扩增步骤I中提取得到的模板DNA。(3)通过琼脂糖凝胶电泳来检测PCR扩增产物，定性检测样品中的L. casei Zhang (CGMCC 1697)。(4)通过突光定量PCR检测样品中L. casei Zhang(CGMCC 1697)的数量。荧光定量PCR包括应用已知数量的L. casei Zhang (CGMCC 1697)进行Q-PCR扩增制作标准曲线，然后以标准曲线为依据，用上述特异性引物通过荧光定量PCR 检测样品中 L. casei Zhang (CGMCC 1697)的数量。本发明的定性定量检测L. casei Zhang (CGMCC 1697)的方法可用于检测发酵乳制品或粪便样品中的L. casei Zhang (CGMCC 1697)，具体检测步骤如下I.发酵乳制品(或者粪便)样品中宏基因组DNA的提取采用液氮冻融-CTAB法取I. Og样品洗涤处理，将洗脱的菌体于I. 5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65°C水浴中融化(约5min)，反复冻融3次，加0. ImL10%SDS和10. 0 ii L 10mg/mL蛋白酶K，于37°C恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心IOmin,收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于12000g离心IOmin(为了使沉淀、水相和有机相分层)，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0. I倍体积的醋酸钠，I倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。2. L. casei Zhang (CGMCC 1697)特异性引物特异性的测定以L. casei Zhang (CGMCC 1697)的全基因组序列为依据，设计如下引物序列LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ;LcZ R:ccgacgtaccagctcact。在设计 L. casei Zhang(CGMCC 1697)特异性引物后，我们对该引物的特异性进行了验证，挑选了再分类学地位上与 L. casei Zhang (CGMCC 1697)同源性较高的已知菌种，如Bacteroides fragilis JCM110191, Bifidobacterium animal is DSM 10140, B. breve ATCC 157001, B. Longum ATCC15697, Clostridium coccoides JCM 1395T, Enterococcus faecalis ATCC 194331, E.faecium ATCC 194341, Escherichia coli JCM 1649T Lactobacillus acidophilus ATCC4356t, L. brevis ATCC 148691, L. buchneri ATCC 4005T, L. crispatus JCM 1185T, L.fermentum ATCC 149311, L. gal I inarum JCM 2011T, L. gasseri DSM 202431, L. johnsoniiJCM 2012t, L. plantarum ATCC 149171, L. reuteri JCM 1112T, L. rhamnosus ATCC 7469T,L. casei ATCC 393T进行了扩增对比分析。扩增结果表明，该引物只能扩增出L. caseiZhang (CGMCC 1697)，不能扩增出上述同源性较高的对比菌株，该对比扩增实验表明所设计的引物特异性良好。3. L. casei Zhang (CGMCC 1697)特异性引物灵敏度检测应用设计的L. casei Zhang (CGMCC 1697)特异性引物对已知数量的L. caseiZhang (CGMCC 1697)进行定量扩增，扩增结果显示，当L. casei Zhang (CGMCC 1697)的数
量在4. 5 LoglO CFU到9. 5 LoglO CFU时，该菌株定量结果线性关系良好并可以被准确定量，所述引物检测的灵敏度比较高。4. L. casei Zhang (CGMCC 1697)的特异性片段的扩增扩增引物以L. casei Zhang (CGMCC 1697)的全基因组序列为依据，采用本实验室自主设计的上述引物进行特异性片段的扩增，该引物序列及扩增片段的具体信息见图I。扩增体系反应体系50 ii L : 10 XPCR Buffer 5u L,25mmol/L Mg2+ I. 0 y L，2. 5mmol/L dNTPs4 u L, 5mmol/L 上下游引物各 2 y L, DNA 模板 IOOng 左右，5U/ u L Taq 酶(Promega) 0. 5uL,dd H2O 补足至 50 u L0扩增条件95°C 变性 5min ;循环 30 次95°C 变性 lmin，65 °C 退火 45s，72 °C 延伸 lmin，然后72°C 延伸 7min，4°C 保存。5.琼脂糖凝胶电泳检测将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20_30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果；其中设置以含有目的扩增片段的质粒DNA作为模板的阳性对照，以灭菌水作为模板的阴性对照，根据在336bp处是否出现预期性特征条带，定性确定样品中是否含有 L. casei Zhang (CGMCC 1697)。6.采用荧光定量PCR检测样品中L. casei Zhang (CGMCC 1697)的数量首先应用已知数量的L. casei ZhangCCGMCC 1697)通过荧光定量PCR扩增制作标准曲线，然后以标准曲线为依据，用上述特异性引物定量检测样品中L. casei ZhangCCGMCC1697)的数量。Q-PCR扩增体系反应体系20 ii L : 10 XPCR mix 10 y L，10mmol/L 上下游引物各 0. 4 y L，DNA 模板IOOng 左右，dd H2O 补足至 20 u L。Q-PCR扩增条件95°C变性 20s ;循环 40 次95°C变性 5s，65°C退火 30s，72°C延伸 35s。
本发明的有益效果是，可以在不进行Lactobacillus casei Zhang (CGMCC 1697)菌培养的基础上，简便、快速、准确地定性定量检测样品中Lactobacillus casei Zhang(CGMCC 1697)菌,所述方法检测特异性高,能够区分Lactobacillus casei Zhang (CGMCC1697)菌和同源性较高的其他菌株，检测的灵敏度高，能够对样品中包含的微量菌株进行检测。
图I Lactobacillus casei Zhang (CGMCC 1697)株特异性引物和扩增的目的基
因信息；图2人幾便样品和发酵乳制品样品中宏基因组DNA电泳图；样品I :发酵乳制品样品，样品2 :粪便样品2，M :入-DNA/HindIII Markers图3 4 个样品中 Lactobacillus casei Zhang (CGMCC 1697)的特异性扩增条带；条带I为样品I发酵乳制品样品，条带2为阳性对照，条带3为阴性对照，条带4为样品2粪便样品图4 Lactobacillus casei Zhang (CGMCC 1697)的 Q-PCR 扩增标准曲线，样品在标准曲线上所处的位置。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述，以下实施例仅具有说明性，本发明并不受这些实施例的限制。I.发酵乳制品(或者粪便)样品中宏基因组DNA的提取
采用液氮冻融-CTAB法取I. Og样品洗涤处理，将洗脱的菌体于I. 5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65°C水浴中融化(约5min)，反复冻融3次，加0. ImL10%SDS和10. Oii L 10mg/mL蛋白酶K，于37°C恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心IOmin,收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于12000g离心IOmin(为了使沉淀、水相和有机相分层)，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0. I倍体积的醋酸钠，I倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。2. L. casei Zhang (CGMCC 1697)特异性引物特异性检测以L. casei Zhang (CGMCC 1697)的全基因组序列为依据,设计如下引物序列LcZF:tgagccgctatctgatagtctt ;LcZ R:ccgacgtaccagctcact。在设计 L. casei Zhang (CGMCC1697)特异性引物后我们对该引物的特异性进行了验证。验证方法为挑选再分类学地位上与 L. casei Zhang (CGMCC 1697)同源性较高的已知菌种，如Bacteroides fragilisJCM 11019T, Bifidobacterium animal is DSM 10140, B. breve ATCC 157001, B. Longum ATCC15697, Clostridium coccoides JCM 1395T, Enterococcus faecalis ATCC 194331, E.faecium ATCC 194341, Escherichia coli JCM 1649T Lactobacillus acidophilus ATCC4356t, L. brevis ATCC 148691, L. buchneri ATCC 4005T, L. crispatus JCM 1185T, L.fermentum ATCC 149311, L. gal I inarum JCM 2011T, L. gasseri DSM 202431, L. johnsoniiJCM 2012t, L. plantarum ATCC 149171, L. reuteri JCM 1112T, L. rhamnosus ATCC 7469T,L. casei ATCC 393T，利用所设计的引物通过PCR分别扩增检测L. casei Zhang (CGMCC1697)菌株和上述对比菌株，扩增检测结果表明，该引物只能扩增出L. casei Zhang (CGMCC1697 )，不能扩增出其他菌株，所以该引物特异性良好。3. L. casei Zhang (CGMCC 1697)特异性引物灵敏度检测应用所设计的上述针对L. casei Zhang (CGMCC 1697)的特异性引物对已知数量的 L. casei Zhang (CGMCC 1697)进行定量扩增，扩增结果显示，当 L. casei Zhang (CGMCC1697)的数量在4. 5 LoglO CFU到9. 5 LoglO CFU时，该菌株定量结果线性关系良好并可以
被准确定量。4. L. casei Zhang (CGMCC I697)的特异性片段的扩增
扩增引物以L. casei Zhang (CGMCC 1697)的全基因组序列为依据，采用本实验室自主设计的引物前序列，该引物序列及扩增片段的具体信息见图I。引物具体序列为LcZF:tgagccgctatctgatagtctt ；LcZ R:ccgacgtaccagctcact。扩增体系反应体系50 ii L : 10 XPCR Buffer 5u L,25mmol/L Mg2+ I. 0 y L，2. 5mmol/L dNTPs4 u L, 5mmol/L 上下游引物各 2 y L, DNA 模板 IOOng 左右，5U/ u L Taq 酶(Promega) 0. 5uL,dd H2O 补足至 50 u L0扩增条件95°C 变性 5min ;循环 30 次95°C 变性 lmin，65 °C 退火 45s，72 °C 延伸 lmin，然后72°C 延伸 7min，4°C 保存。5.琼脂糖凝胶电泳将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20_30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果。其中设置以含有目的扩增片段的质粒DNA作为模板的阳性对照，以灭菌水作为模板的阴性对照，根据在336bp处是否出现预期性特征条带，确定样品中是否含有L.casei Zhang (CGMCC 1697)；6. Q-PCR 检测样品中 L. casei Zhang (CGMCC 1697)的数量首先应用已知数量的L. casei Zhang (CGMCC 1697)通过Q-PCR扩增制作标准曲线，然后以标准曲线为依据，用上述特异性引物定量检测样品中L. casei Zhang (CGMCC1697)的数量。Q-PCR扩增体系反应体系20 ii L : 10 XPCR mix 10 y L，10mmol/L 上下游引物各 0. 4 y L，DNA 模板IOOng 左右，dd H2O 补足至 20 u L。Q-PCR扩增条件95°C变性 20s ;循环 40 次95°C变性 5s，65°C退火 30s，72°C延伸 35s。应用实施例I :L. casei Zhang (CGMCC 1697)的定性检测(注)I.发酵乳制品(或者粪便)样品中宏基因组DNA的提取米集Lactobacillus casei Zhang (CGMCC 1697)发酵的酸奶样品作为样品I,米集服用Lactobacillus casei Zhang (CGMCC 1697)发酵酸奶样品的志愿者粪便作为样品
2。采用液氮冻融-CTAB法取I. Og样品洗涤处理，将洗脱的菌体于I. 5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65°C水浴中融化(约5min)，反复冻融3次，加0. ImL 10%SDS和10. O i! L 10mg/mL蛋白酶K，于37°C恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下10303g离心IOmin,收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于10303g离心IOmin(为了使沉淀、水相和有机相分层)，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经
0.I倍体积的醋酸钠，I倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。将提取的基因组DNA的一部分进行电泳，电泳图见图2。图2中泳道I为发酵乳制品样品，泳道2为粪便样品2，电泳条带清晰。2. L. casei Zhang (CGMCC 1697)的特异性片段的 PCR 扩增扩增体系反应体系50 ii L : 10 XPCR Buffer 5u L,25mmol/L Mg2+ I. 0 y L，2. 5mmol/L dNTPs4 y L, 5mmol/L 上下游引物各 2 y L, DNA 模板 IOOng 左右，5U/y L Taq 酶(Promega) 0. 5uL,dd H2O 补足至 50 u L0
扩增条件95°C 变性 5min ;循环 30 次95°C 变性 lmin，65 °C 退火 45s，72 °C 延伸 lmin，然后72°C 延伸 7min，4°C 保存。扩增引物序列为LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ;LcZ R:ccgacgtaccagctcact。3.琼脂糖凝胶电泳将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20_30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果。其中设置以含有目的扩增片段的质粒DNA作为模板的阳性对照，以灭菌水作为模板的阴性对照，根据在336bp处是否出现预期性特征条带，确定样品中是否含有L. casei ZhangCCGMCC 1697)。扩增效果见图3。样品I为检测的未知样品，样品2为含有目的扩增片段的质粒DNA作为模板的阳性对照，样品3为以灭菌水作为模板的阴性对照，样品4为检测的未知样品。从图中可以看出，阳性对照可以扩增出条带清晰明亮的目的条带，而阴性对照无相应扩增产物。样品I和样品2均扩增出与阳性对照大小相同的目的片段，但是我们可以看出，样品I的扩增条带较样品2明显清晰明亮。由此可以推断样品I中含有的 Lactobacillus casei Zhang (CGMCC 1697)菌数要多于样品 2。应用实施例2 :L. casei Zhang (CGMCC 1697)的定量检测通过Q-PCR 检测样品中 L. casei Zhang (CGMCC I697)的数量。I.发酵乳制品(或者粪便)样品中宏基因组DNA的提取米集本实验室用Lactobacillus casei Zhang (CGMCC 1697)发酵的酸奶样品作为样品I,采集服用Lactobacillus casei Zhang (CGMCC 1697)发酵酸奶样品的志愿者粪便作为样品2。此实施例的两个样品与实施例I的两个样品相同。都是采用液氮冻融-CTAB法制备的取I. Og样品洗涤处理，将洗脱的菌体于I. 5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65°C水浴中融化(约5min)，反复冻融3次，加0. ImL 10%SDS和10. 0 y L10mg/mL蛋白酶K,于37°C恒温摇床中200r/min摇动2h,室温下10303g离心IOmin,收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于10303g离心IOmin (为了使沉淀、水相和有机相分层)，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0. I倍体积的醋酸钠，I倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。将提取的基因组DNA的一部分进行电泳，电泳图见图2。图2中泳道I为发酵乳制品样品，泳道2为粪便样品2，电泳条带清晰。
应用已知数量的L. casei Zhang (CGMCC 1697)通过Q-PCR扩增制作标准曲线(见图4)。由图4可见，L. casei Zhang (CGMCC 1697)标准品的Ct值和拷贝数呈较好的线性关系，以模板初始拷贝数的对数为横坐标、Ct值为纵坐标绘制出的荧光定量PCR标准曲线方程为Y=-2. 914X+40. 211 (其中Y代表Ct值，X代表模板初始拷贝数的对数)，模板初始拷贝数与Ct值之间的线性相关系数为0. 994，斜率为-2. 914，所建立的标准曲线符合荧光定量PCR的要求。用上述特异性引物通过Q-PCR扩增样品I和2的基因组DNA，测定待测样品的Ct值。然后以标准曲线为依据，将所获得的待测样品的Ct值代入标准曲线方程，可以确定待测样品中L. casei ZhangCCGMCC 1697)菌株的量。结果与分析误差结果显示在下表I中。Q-PCR扩增体系反应体系20 ii L :10 XPCR mix 10 y L，10mmol/L 上下游引物各 0. 4 y L，DNA 模板IOOng 左右，dd H2O 补足至 20 u L。Q-PCR扩增条件95°C变性 20s ;循环 40 次95°C变性 5s，65°C退火 30s，72°C延伸 35s。样品中L. casei Zhang (CGMCC 1697)的定量结果见表 I 表I 2 个样品内 Lactobacillus casei Zhang (CGMCC 1697)的数量。
权利要求
1.一种定性定量检测L. casei ZhangCCGMCC 1697)的方法，包括如下步骤(I)从检测样品中提取DNA，制备用于进一步扩增的模板DNA ；(2)PCR扩增，以L. casei Zhang (CGMCC1697)的全基因组序列为依据，设计如下引物序列LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ；LcZR:ccgacgtaccagctcact,利用设计的引物通过PCR扩增模板DNA ； (3)通过琼脂糖凝胶电泳来检测PCR扩增产物，定性检测样品中的L. casei Zhang (CGMCC 1697)； (4)通过q-PCR检测样品中 L. casei Zhang (CGMCC 1697)的数量。
2.权利要求I所述的一种定性定量检测L.casei ZhangCCGMCC 1697)的方法，其特征在于，包括如下步骤 (O从检测样品中提取DNA，制备用于进一步扩增的模板DNA 采用液氮冻融-CTAB法取I. Og样品洗涤处理，将洗脱的菌体于I. 5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65°C水浴中融化5min，反复冻融3次，加O. ImL 10%SDS和10. O μ L 10mg/mL蛋白酶K，于37°C恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心IOmin,收集上清液转移至另一离心管中，上清液与等体积的氯仿于12000g离心IOmin,吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经O. I倍体积的醋酸钠，I倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用； (2)PCR 扩增 L. casei Zhang (CGMCC 1697)的特异性片段 扩增引物具体序列为；LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ;LcZ R:ccgacgtaccagctcact; 扩增体系 反应体系 50μ L :10XPCR Buffer 5μ L,25mmol/L Mg2+ I. O μ L，2· 5mmol/L dNTPs4 μ L，5mmol/L 上下游引物各 2 μ L，DNA 模板 IOOng 左右，5U/ μ L Taq 酶 O. 5uL, dd H2O 补足至 50 μ L ; 扩增条件 95°C变性5min ;循环30次95°C变性lmin，65°C退火45s，72°C延伸lmin，然后72°C延伸7min，4°C保存。
(3)琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测 将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20_30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果；其中设置以含有目的扩增片段的质粒DNA作为模板的阳性对照，以灭菌水作为模板的阴性对照，根据在336bp处是否出现预期性特征条带，定性确定样品中是否含有L.casei Zhang (CGMCC 1697)； (4)Q-PCR 检测样品中 L. casei Zhang (CGMCC 1697)的数量 首先应用已知数量的L. casei Zhang (CGMCC 1697)通过Q-PCR扩增制作标准曲线，然后以标准曲线为依据，用上述特异性引物定量检测样品中L. casei Zhang (CGMCC 1697)的数量； Q-PCR扩增体系 反应体系 20μ L :10XPCR mix 10 μ L，10mmol/L 上下游引物各 O. 4 μ L，DNA 模板 IOOng左右，dd H2O补足至20μ L ； Q-PCR扩增条件 95°C变性20s ;循环40次:95°〇变性58，651退火30s，72。。延伸35s。
3.权利要求I或2所述的一种定性定量检测L.casei ZhangCCGMCC 1697)的方法，其特征在于检测样品是发酵的酸奶样品，或服用Lactobacillus casei Zhang (CGMCC 1697)发酵酸奶样品的志愿者粪便。
4.一种用于权利要求I所述的检测方法的特异性引物，引物序列如下LcZF:tgagccgctatctgatagtctt ；LcZ R:ccgacgtaccagctcact。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测Lactobacillus casei Zhang(CGMCC 1697)的检测方法的设计，应用该方法可以对样品中的Lactobacillus casei Zhang(CGMCC 1697)进行检测，可准确，快速的完成发酵乳制品，发酵食品以及人体肠道中益生菌Lactobacillus casei Zhang(CGMCC 1697)定性和定量测定。
文档编号C12Q1/68GK102978290SQ20121055915
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者张和平, 张家超, 陈永福 申请人:内蒙古农业大学