专利名称：一种免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞体外诱导培养和保存方法，具体地说，是一种外周血来源的耐受性树突状细胞体外诱导培养和保存方法。
背景技术：
自身免疫病主要特征是缺乏对自身抗原的耐受从而诱导了损伤性的免疫反应导致组织损伤。自身免疫病主要的治疗方法是应用免疫抑制剂，采用免疫抑制剂会增加感染和肿瘤的风险。而细胞治疗是一种新颖的治疗手段。通过自体或异体的体细胞体外培养诱导,产生具有某种免疫耐受功能的细胞,输注到免疫病患者体内，抑制免疫系统对自身抗原的过度活化。细胞治疗安全性高，可以有针对地发挥作用，已经成为了一门新兴的热门学科。受体对MHC不匹配的移植物发生排斥反应是组织和细胞移植失败的主要原因。在目前临床实践中，传统免疫抑制药物的使用，虽能有效防止移植排斥，缓解由供者T细胞介导的急、慢性移植物抗宿主病，但常伴有受者整体免疫功能下降，感染机会增加和诱发肿瘤等副作用。因此，以诱导供受者之间移植免疫耐受为目的的细胞治疗方法日益受到重视。研究者发现，在体外IL-10、TGF-β条件下培养的树突状细胞与正常的未成熟树突状细胞(DC)相比表达更低的共刺激分子且不能被LPS等促成熟，在体外能诱导同种异体T细胞产生抗原特异性低免疫反应。将经体外调节培养后产生的显示未成熟DC表型且在体内外能诱导T细胞低反应性及耐受的DC统称为耐受性DC，耐受性DC可以分泌负向调节性因子。耐受性DC也被用于小鼠实验研究移植耐受和自身免疫病的治疗，如在小鼠移植物抗宿主病模型中IL-lOJGF-β诱导的耐受性DC可以延缓GVHD的发生；IL_10诱导的耐受性DC IFN-Y分泌减少，下调机体免疫反应，阻止了实验性滋生免疫性重症肌无力的进一步发展。IL-10诱导的耐受性DC对小鼠的自身免疫糖尿病有抑制作用。但是无论是IL-10、TGF-β或两者诱导得到的耐受性DC易受微环境影响，抑制同种异基因反应弱，所以对耐受性DC免疫抑制功能的 优化是当前需解决的主要问题。另一方面，免疫抑制剂除影响机体免疫系统外已显示出可以干扰更早期的免疫反应，如在DC分化成熟过程中干预其功能。研究发现用一些免疫抑制剂如地塞米松、雷帕霉素等能增强和稳固DC的耐受性能，促进DC的耐受活性。综上所述，在体外联合免疫抑制剂与细胞因子诱导DC，建立培养人外周血来源的耐受性DC的一种新方法，将极大地推动DC细胞临床防治自身免疫性疾病、移植物抗宿主病和同种异基因器官移植排斥的开展。目前，关于IL-10和TGF- β诱导耐受性DC的方法较多以及免疫抑制剂如地塞米松、雷帕霉素等作用于DC的研究也有报道，但将免疫抑制剂他克莫司用于体外诱导培养临床可用的耐受性DC的方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法。
本发明的再一的目的是，提供一种免疫抑制剂体外诱导培养得到的耐受性树突状细胞。本发明的另一的目的是，提供一种免疫抑制剂体外诱导培养得到的耐受性树突状细胞的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:一种免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，所述的免疫抑制剂为他克莫司。所述的免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，包括以下步骤:
a、用密度梯度离心法分离得到的人外周血单个核细胞用含ACD-A抗凝剂的PBS缓冲液洗涤细胞，培养皿中贴壁DC前体细胞，进一步在细胞因子作用下诱导DC细胞；
b、在细胞因子诱导DC前体细胞向DC分化的过程中，培养皿中添加免疫抑制剂他克莫司诱导其分化为耐受性DC;
C、将所述他克莫司诱导培养的耐受性DC做功能鉴定并保存于液氮中。所述的步骤a中洗涤细胞的缓冲液为含体积百分数为1.6%的ACD-A抗凝剂的PBS。所述的步骤a中得到的外周血单个核细胞用含自体灭活血浆的1640培养液培养，所述的自体灭活血浆为和培养诱导的细胞同源的血浆。所述的步骤a中采用 CellGro无血清培养基培养前体细胞7天，分别在第0、3、5天添加细胞因子IL-4、GM-CSF。所述的步骤b中，在诱导DC前体细胞向DC分化的过程中，于第3、5天添加免疫抑制剂他克莫司，终浓度为ixio_8m。所述的步骤c中他克莫司诱导培养的耐受性DC与冷冻保护剂预处理后，分装入冻存管或冷冻袋中液氮-196 °C保存。所述的培养诱导7天的耐受性DC纯度在85%以上，存活率80_92%，表达DC标志⑶209以及低表达共刺激分子⑶80、⑶83、⑶86和HLA-DR。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:以上任一所述的方法制备得到的耐受性树突状细胞。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:所述的耐受性树突状细胞在制备具有免疫耐受功能的树关状细胞制品中的应用，所述的树关状细胞制品是用于预防和治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥的树突状细胞制品。本发明优点在于:
本发明的利用免疫抑制药物他克莫司体外诱导培养耐受性DC的方法，可以从外周血中获得高纯度免疫抑制功能强的耐受性DC，在液氮中长期保存，能够满足临床对耐受性DC细胞制品的需求，用于预防和治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥。
图1是诱导培养7天流式细胞仪检测耐受性DC的表型及存活率。他克莫司诱导培养的耐受性DC (TAC-DC)表达DC标志CD209，与成熟DC (mDC)相比表达较低的共刺激分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR，并且比细胞因子IL-lO/TGF-β诱导的耐受性DC (DCIL_10/TGF-e )以及其他免疫抑制剂地塞米松、环孢霉素A诱导的耐受性DC (DX-DC, CsA-DC)表达更低的共刺激分子。他克莫司诱导培养的耐受性DC存活率在80-92%。图中，成熟树突状细胞(mDC) ;IL-10/TGF-13诱导的耐受性树突状细胞);地塞米松诱导的耐受性树突状细胞(DX-DC);环孢霉素诱导的耐受性树突状细胞(CsA-DC);他克莫司诱导的耐受性树突状细胞(TAC-DC)。图2是他克莫司诱导的耐受性DC对异源效应T细胞的低反应性。从外周血磁珠分离得到⑶4+⑶25-T细胞作为效应T细胞(Tste),经CFSE染色后与DC共孵育后检测T效应细胞的增殖率，他克莫司诱导培养的耐受性DC几乎不引起异源Tste细胞的扩增。图中，成熟树突状细胞(mDC) ;IL-10/TGF-13诱导的耐受性树突状细胞(DCLTCF_e );地塞米松诱导的耐受性树突状细胞(DX-DC);环孢霉素诱导的耐受性树突状细胞(CsA-DC);他克莫司诱导的耐受性树突状细胞(TAC-DC )。图3是他克莫司诱导培养的无关第三方耐受性DC抑制混合淋巴细胞反应。外周血来源的mDC与异源的CFSE染色的Tste进行混合淋巴细胞反应，分别加入不同方法诱导的耐受性DC，耐受性DC与Tste比例为1:5。培养5天后收集细胞并用流式细胞仪进行结果分析。他克莫司诱导培养的耐受性DC具有更强的抑制混合淋巴细胞反应。图中，IL-lO/TGF-β诱导的耐受性DC (DClxtcf^ );地塞米松联合IL-lO/TGF-β诱导的耐受性DC (DX-DCIL_10/TGF-@ ^ ;环抱每素A联合IL_10/TGF_β诱导的耐受性DC (CsA-DC IL-1O/TGF-0 );他克莫司联合
IL-10/TGF- β诱导的耐受性DC (TAC-DCil_1o/tgf_0 );地塞米松联合TGF- β诱导的耐受性DC(DX-DCtgf_0 );环孢霉素A联合TGF-β诱导的耐受性DC (CsA-DCtgf_0 );他克莫司联合TGF-β诱导的耐受性DC (TAC-DCtgf_0 );地塞米松联合IL-1O诱导的耐受性DC (DX-DCIL_10);环孢霉素A联合IL-1O诱导的耐受性DC (DC CsA-DCil_10);他克莫司联合IL-1O诱导的耐受性DC (TAC-DCIL_1(I);他克莫司诱导的耐受性DC (TAC-DC)。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。本发明提供一种免疫抑制剂体外诱导耐受性DC方法，包括以下步骤:
a、用密度梯度离心法分离得到的人外周血单个核细胞用含ACD-A抗凝剂的PBS缓冲液洗涤细胞，培养皿中贴壁DC前体细胞，进一步在细胞因子作用下诱导DC细胞；
b、在细胞因子诱导DC前体细胞向DC分化的过程中，培养皿中添加免疫抑制剂他克莫司诱导其分化为耐受性DC;
C、将所述他克莫司诱导培养的耐受性DC做功能鉴定并保存于液氮中。需要说明的是，所述的步骤a中洗涤细胞的缓冲液为含体积百分数为1.6%的ACD-A抗凝剂的PBS。所述的ACD-A抗凝剂为现有的临床可用的试剂，采用临床可用的试剂，便于诱导培养出的细胞将来的临床应用。得到的外周血单个核细胞用含体积百分数为1%自体灭活血浆的1640培养液以1.2X107/2ml/皿的密度接种于60mm培养皿中，培养箱中贴壁I小时后洗去悬浮细胞得到DC前体细胞。培养时不使用胎牛血清，而是选用自体灭活血浆(和培养诱导的细胞同源的血衆)培养，不会在培养时引入异源物质。采用CellGro无血清培养基培养前体细胞7天，分别在第0、3、5天添加细胞因子I L-4, GM-CSF0培养时采用临床级CellGro无血清培养基，便于诱导培养出的细胞将来的临床应用。同时，本方法中诱导培养的天数、添加细胞因子的时间，经摸索和试验证明诱导DC效率更高、DC状态更好。所述的步骤b中，在诱导DC前体细胞向DC分化的过程中，于第3、5天添加免疫抑制剂他克莫司，终浓度为ixio_8m。所述的步骤c中他克莫司诱导培养的耐受性DC与冷冻保护剂预处理后，分装入冻存管或冷冻袋中液氮-196 °C保存。所述的培养诱导7天的耐受性DC纯度在85%以上，存活率80_92%，表达DC标志⑶209以及低表达共刺激分子⑶80、⑶83、⑶86和HLA-DR。所述的方法诱导培养或低温保存后的耐受性DC作为第三方无关供者细胞在预防和治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥中的应用。实施例11.输血传播传染病检测合格的外周血离心浓缩白细胞层，用原血浆稀释重悬后用Ficoll淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞。用含体积百分比为1.6%ACD-A抗凝剂的PBS缓冲液洗涤细胞，培养皿中含体积百分 数为1%自体灭活血浆的1640培养液以1.2X107/2ml/皿的密度贴壁DC前体细胞。2.次日(即第O天)，加入细胞因子IL-4、GM-CSF诱导DC细胞，并于第3天和第5天补充全量IL-4、GM-CSF03.在培养过程中，于第3天和第5天培养皿中添加终浓度为I X IO-8M免疫抑制剂他克莫司诱导其分化为耐受性DC，第7天收集细胞。4.将第7天收集的他克莫司诱导的耐受性DC与冷冻保护剂预处理后，分装入冻存管或冷冻袋中液氮_196°C保存。5.诱导培养或低温保存后的耐受性DC作为第三方无关供者细胞在预防和治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥。上述全部过程均在无菌环境中进行。需要说明的是，所述的他克莫司诱导培养的耐受性DC纯度在85%以上，存活率80-92%，表达DC标志CD209以及低表达共刺激分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR。所述的他克莫司诱导培养的耐受性DC与细胞因子IL-10/TGF- β诱导的耐受性DC以及地塞米松、环孢霉素A诱导的耐受性DC相比，免疫抑制功能更强。实施例2
外周血离心浓缩白细胞层，用原血浆稀释重悬后用Ficoll淋巴细胞分离液离心(2000rpm，20min)，用含体积百分比为1.6%A⑶-A抗凝剂的PBS缓冲液洗涤细胞三次后，1640培养液洗涤一次洗去残留ACD-A抗凝剂，得到外周血单个核细胞。外周血单个核细胞用含体积百分数为1%自体灭活血浆的1640培养液以1.2X107/2ml/皿的密度加入60mm培养皿中，于37°C、5%C02及饱和湿度的条件下孵育lh，1640培养液轻轻洗去未贴壁细胞。培养皿重新加入3ml/皿临床级无血清培养基DC CellGro，37°C、5%C02及饱和湿度的条件下培养过夜。实施例3
用细胞因子重组人IL-4 (终浓度为500U/ml)、重组人GM-CSF (终浓度为1000U/ml)体外诱导培养DC，加入细胞因子于无血清培养基DC CellGro培养的DC前体细胞中，于37°C、5%C02及饱和湿度的条件下进行培养，并于第3天和第5天补充全量IL-4、GM-CSF。DC前体细胞分化为DC的过程中，于第3天和第5天在培养皿中添加终浓度为I X IO-8M免疫抑制剂他克莫司诱导其分化为耐受性DC。第7天收集得到纯度在85%以上，存活率80-92%耐受性DC,进行细胞表面标志检测和体外免疫耐受功能，并进行低温保存。实施例4
采用流式细胞术进行耐受性DC免疫表型分析。使用FITC标记的CD209抗体、CD80抗体、⑶83抗体、⑶86抗体、HLA-DR抗体进行细胞表面标记,根据试剂盒说明，用AnnexinV /PI凋亡试剂盒检测细胞存活率。如图1所示，他克莫司诱导培养的耐受性DC表达DC标志⑶209，与成熟DC相比表达较低的共刺激分子⑶80、⑶83、⑶86和HLA-DR，并且比细胞因子IL-lO/TGF-β诱导的耐受性DC以及其他免疫抑制剂地塞米松、环孢霉素A诱导的耐受性DC表达更低的共刺激分子。他克莫司诱导培养的耐受性DC存活率在80-92%。实施例5
从外周血中密度梯度离心分离外周血单个核细胞，根据厂家的说明，用标准分离试剂盒Dynal人⑶4T细胞免疫磁珠(invitrogen公司)去除外周血单个核细胞中的非⑶4T细胞，然后对外周血⑶4+T细胞用标准分离试剂盒CliniMACS人⑶25免疫磁珠(MiltenyiBiotec公司)筛选⑶4+⑶25+细胞，得到⑶4+⑶25-T细胞作为效应T细胞。效应T细胞经CFSE (1.2μΜ)染色后，以I X IO5/孔接种于96孔培养板中，以效应T细胞与耐受性DC的比例为1:5加入诱导培养的耐受性DC，于37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养，收集培养4、
5、6天的细胞并用流式细胞仪进行结果分析。如图2所示，他克莫司诱导培养的耐受性DC几乎不引起异源Tste细胞的扩增。实施例6
从外周血免疫磁珠分离纯化得到的⑶4+⑶25-T细胞作为效应T细胞，经CFSE(1.2 μ Μ)染色后，以IX IO5/孔接种于96孔培养板中，用经丝裂霉素处理后的同种异基因成熟树突状细胞刺激活化形成混合淋巴细胞反应体系。将诱导培养的第三方耐受性DC以效应T细胞与耐受性DC的比例为1:5加入反应体系中，于37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养5天，5天之后收集细胞并用流式细胞仪进行结果分析，检测耐受性DC抑制免疫反应的能力。如图3所示，他克莫司诱导培养的耐受性DC具有更强的抑制混合淋巴细胞反应。实施例7
他克莫司诱导培养的耐受性DC与冷冻保护剂预处理后，分装入冷冻管或冷冻袋中液氮_196°C保存。人外周血经过严格检测程序(梅毒抗体检测、HIV免疫检测、CMV抗体检测、乙型肝炎抗原抗体检测等)检测合格后进行体外诱导分化耐受性DC，获得的他克莫司诱导培养的耐受性DC经纯度和体内外抑制功能检测合格后冻存在液氮中，用于预防和治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，所述的免疫抑制剂为他克莫司。
2.根据权利要求1所述的免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤:a、用密度梯度离心法分离得到的人外周血单个核细胞用含ACD-A抗凝剂的PBS缓冲液洗涤细胞，培养皿中贴壁DC前体细胞，进一步在细胞因子作用下诱导DC细胞；b、在细胞因子诱导DC前体细胞向DC分化的过程中，培养皿中添加免疫抑制剂他克莫司诱导其分化为耐受性DC;C、将所述他克莫司诱导培养的耐受性DC做功能鉴定并保存于液氮中。
3.根据权利要求2所述的免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，所述的步骤a中洗涤细胞的缓冲液为含体积百分数为1.6%的ACD-A抗凝剂的PBS。
4.根据权利要求2所述的免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，所述的步骤a中得到的外周血单个核细胞用含自体灭活血浆的1640培养液培养，所述的自体灭活血浆为和培养诱导的细胞同源的 血浆。
5.根据权利要求2所述的免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，所述的步骤a中采用CellGro无血清培养基培养前体细胞7天，分别在第0、3、5天添加细胞因子IL-4、GM-CSF。
6.根据权利要求2所述的免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，所述的步骤b中，在诱导DC前体细胞向DC分化的过程中，于第3、5天添加免疫抑制剂他克莫司，终浓度为I X 10_8M。
7.根据权利要求2所述的免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，所述的步骤c中他克莫司诱导培养的耐受性DC与冷冻保护剂预处理后，分装入冻存管或冷冻袋中液氮-196 °C保存。
8.根据权利要求2所述的免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，所述的培养诱导7天的耐受性DC纯度在85%以上，存活率80-92%，表达DC标志⑶209以及低表达共刺激分子⑶80、⑶83、⑶86和HLA-DR。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法制备得到的耐受性树突状细胞。
10.根据权利要求9所述的耐受性树突状细胞在制备具有免疫耐受功能的树突状细胞制品中的应用，所述的树突状细胞制品是用于预防和治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥的树突状细胞制品。
全文摘要
本发明涉及一种免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法。本发明还提供一种免疫抑制剂体外诱导制备得到的耐受性树突状细胞及其应用。本发明优点在于本发明的一种免疫抑制剂体外诱导培养耐受性DC的方法，可以从外周血中获得高纯度免疫抑制功能强的耐受性DC，在液氮中长期保存，能够满足临床对耐受性DC细胞制品的需求，用于预防和治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥。
文档编号C12N5/0784GK103074299SQ201210559198
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者任亚娜, 范华骅, 谢如锋, 杨洁, 刘李栋, 杨懿铭 申请人:上海市血液中心