用于生成树突细胞的方法

专利名称：用于生成树突细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于生成和遗传工程化改造树突细胞(DC)的方法及其用途。
背景技术：
在过去多年期间，已经认可树突细胞(DC)为免疫的中心调节物。人DC是通过在 存在生长因子(通常为白介素(IL)4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))的情况 中从造血干细胞或外周血单核细胞进行的体外分化生成的。最近的证据提示，DC具有柔性 地(flexibly)响应微生物、外伤、或代谢应激遭遇的能力。如此，DC不仅分化成能履行特 定功能(例如活化或耐受性，1型或2型T辅助淋巴细胞(Thl，Th2)极化)的一种亚型，而 且还以适合于给定环境中遭遇的考验的时间-动力学方式呈现独特的功能状态(

图1)。单核细胞离开血流而进入各种组织，并变为通常称为未成熟DC(iDC)的细胞。这 些iDC是通过从细胞外液以及来自生理学濒死细胞的凋亡体吸收材料来对其环境取样，进 行加工，并在不进行共刺激的情况中以耐受性诱导形式将此材料呈递给T淋巴细胞的哨兵 (sentinel)。可以认为耐受性诱导iDC表型是DC的缺省状态。此状态得到维持，直至iDC遭 遇危险信号，该危险信号可以是由toll样受体(TLR)传送的病原体相关分子样式(PAMP)、 炎性细胞因子、或T淋巴细胞衍生的信号传导(最主要由⑶40/⑶40L相互作用介导)。此 过程称为DC成熟，其与功能改变的顺序一致。这些功能改变在一段约2天的时间里发生， 之后DC达到称为成熟DC (mDC)的状态。最显著地，DC开始上调共刺激分子诸如B7家族成 员⑶80和⑶86。这使DC能够向携带能与抗原性肽相互作用的T细胞受体的T淋巴细胞投 递活化性而非抑制性信号，所述抗原性肽与DC膜上的主要组织相容性复合体(MHC)分子复 合。在此阶段，还发生刺激物依赖性极化，其中DC分泌IL-12以及IL-12家族细胞因子，其 有利于1型免疫应答，随后支持由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的细胞免疫。IL-12分泌 一般由TLR与其配体结合(例如TLR4与LPS结合)触发，但是也通过可溶性或细胞膜结合 的⑶40L分子与DC上的⑶40的相互作用触发。比较而言，IL-12释放的缺乏触发2型极 化，其通过支持B淋巴细胞来启动体液免疫应答。在没有IL-12分泌的情况中启动DC成熟 是通过iDC与细胞因子混合物(通常含有TNF- α和PG-E2以及多种炎性细胞因子，包括但 不限于I型和II型干扰素、IL-1、或IL-6)的暴露实现的。IL-12释放在约24小时后停止，指明DC与T淋巴细胞之间的相遇需要在该时间窗 内发生以容许有效的1型极化和CTL活化。比较而言，共刺激分子的表达在2天后达到其 最大值。因为按照定义，成熟的DC仅在表型方面而不在功能方面以共刺激分子的最大限度 表达表征，所以释放IL-12的1型极化DC称为半成熟的(sm)DC。约2天后，DC达到所谓成熟的阶段。它分化的第二天期间，DC免除其免疫刺激能 力，并通过上调介导负调节反馈环的分子来获得免疫抑制特性(图1)。此分化阶段的生物 学意义是在严格控制下保持免疫应答的必然性。活化的免疫细胞(特别是实现杀死其它细 胞的CTL)对生物体形成相当大的威胁。这以避开其控制的免疫应答的病理学后果自身免 疫性疾病诸如I型糖尿病或多发性硬化例示。因此，遇到成熟信号后第1天期间引发免疫 应答的同一 DC会在其分化过程的第2天期间使此相同的免疫应答衰减。因此，成熟的DC实际上并不是如最初认为的免疫刺激细胞而是免疫抑制细胞，因此不足以进行目的在于免 疫刺激的治疗性干预，诸如其在癌症免疫疗法或治疗微生物疾病中的用途。辨别未成熟的(耐受性维持)、半成熟的DC(免疫刺激性)、和成熟的(免疫抑制 性)DC是重要的(图1)。如上文所概述的iDC维持针对自身抗原的耐受性。smDC已经遇 到上文所述成熟刺激物之一，而且已经不可逆地在约2天内分化成mDC。重要的是，仅在那 2天的第一天期间，其实现IL-12释放，启动I型免疫极化，和随后支持CTL介导的免疫应 答。一旦成熟的DC在一天后进入分化的第二阶段，它便获得免疫抑制特性。免疫学家能常 规地通过膜分子诸如⑶80、⑶83、或⑶86的表达来表征mDC。然而，与在几小时内达到最大 限度表达，并在24小时后丧失的IL-12相比，这些膜分子仅在48小时后达到其最大限度表 达。为了清楚地辨别本文中所描述的IL-12分泌DC与以名称成熟DC常规了解的细胞，选 择术语半成熟的DC。非常重要的是，这不应暗示一些种类的功能缺陷，而仅仅是图1中按时 间动力学比例的某个分化阶段。smDC在功能上与iDC以及mDC有所不同。WO 2007/117682涉及用编码⑶40L的mRNA分子转染的成熟树突细胞。Koya R. C.等(J Immunoth. 26 (2003) :451_460)描述了用编码 CD40L 的病毒转染 未成熟的树突细胞。需要CD40L来使这些树突细胞成熟。在Liu Y.等(Cancer Gene Therapy 9(2002) :202_208)中，披露了用编码 CD40L 的病毒转染未成熟的树突细胞。本发明的目的在于提供一种基于遗传工程来生成树突细胞的方法。可以使用这些 树突细胞来制备药物制剂。本发明涉及一种包含部分成熟的树突细胞的药物制剂，其通过包括下列步骤的方
法可获得a)提供未成熟的树突细胞或其前体细胞或部分成熟的树突细胞，所述部分成熟的 树突细胞如下可获得，即使未成熟的树突细胞与至少一种树突细胞成熟剂接触来生成部分 成熟的树突细胞(半成熟的DC，smDC)，如以其分泌IL-12的能力所定义的b)操作步骤a)的所述细胞，特别是步骤a)的释放IL_12的所述部分成熟的树突 细胞(半成熟的DC，smDC)，以便(i)过表达能够使以连续的IL-12分泌表征的树突细胞的T淋巴细胞刺激能力，并 且选自⑶40L的至少一种免疫分子维持至少24小时，优选至少48小时，其通过导入编码所 述至少一种分子的核酸分子来实现；和/或(ii)抑制或阻止在暴露于初级成熟剂诸如LPS/IFN-γ的树突细胞内起作用或自 暴露于初级成熟剂诸如LPS/IFN-γ的树突细胞释放，并选自白介素10 (IL-10)和吲哚胺2， 3_加双氧酶(IDO)的至少一种T-淋巴细胞抑制分子，诸如表3、4和/或5中给出的至少一 种基因的表达，其如下实现，即敲除表达所述至少一种T-淋巴细胞抑制分子的基因或其片 段或导入用以抑制或阻止在所述树突细胞内有活性或从所述树突细胞投递至T细胞的至 少一种T-淋巴细胞抑制分子的表达的核酸分子，优选核糖核酸分子，并c)任选地，添加物质来将树突细胞的前体细胞转化成树突细胞。依照本发明的药物制剂包含通过本文中所公开的方法可获得的树突细胞。进行目 的在于过表达促成免疫刺激的分子诸如CD40L的遗传工程，或目的在于敲除免疫抑制分子 诸如IL-10或ID0，和下文表3、4和5中所列新鉴定分子(其在DC中显示与IL-10和IDO类似的表达动力学)表达的遗传工程的树突细胞。可以对任何DC或前体细胞(如造血干 细胞)实施遗传工程，不管这些树突细胞是暴露于成熟剂诸如TLR配体、炎性细胞因子的混 合物、或T细胞衍生的信号诸如CD40L介导的信号，还是进行目的在于触发从未成熟的向成 熟的DC进行表型转换的另一种规程，或者它们可以处于未成熟阶段。可以在暴露于成熟刺 激物前或后实施(基因)操作。优选地，应用成熟刺激物(或成熟刺激物的组合)仅持续 一段短暂的时间，例如不长于24小时，12小时，但是特别优选6小时，而且小于6小时。短 暂的(至少2小时)成熟刺激物向DC的有利应用确保接种入患者中后的DC免疫药物保留 了高效率启动T细胞刺激的能力。对DC的遗传工程化改造目的在于改善该基本免疫刺激 能力，而并不意图替换它。必须将用于生成本发明药物制剂的树突细胞的树突细胞前体细胞转化成树突细 胞。其实现手段和方法是本领域已知的。“树突细胞前体细胞”包括单核细胞、造血细胞等。本发明的另一方面涉及一种用于生成树突细胞的方法，包括下列步骤a)提供未成熟的树突细胞，b)使所述未成熟的树突细胞与至少一种树突细胞成熟剂接触来生成部分成熟的 树突细胞(半成熟的DC，smDC)，如以其分泌IL-12的能力所定义的，并c)操作步骤b)的释放IL-12的所述部分成熟的树突细胞(半成熟的DC，smDC)， 以便(i)过表达能够使以连续的IL-12分泌表征的树突细胞的T淋巴细胞刺激能力维 持至少24小时，优选至少48小时或更长的至少一种免疫分子，并且所述至少一种免疫分子 选自CD40L，其通过导入编码所述至少一种分子的核酸分子来实现；和/或(ii)抑制或阻止在暴露于初级成熟剂诸如LPS/IFN- γ的所述树突细胞内起作用 或自暴露于初级成熟剂诸如LPS/IFN-γ的树突细胞释放，并且选自白介素10 (IL-10)和吲 哚胺2，3-加双氧酶(IDO)的至少一种T-淋巴细胞抑制分子，诸如表3和4中给出的至少 一种基因的表达，其如下实现，即敲除表达所述至少一种T-淋巴细胞抑制分子的基因或其 片段或导入用以抑制或阻止在所述树突细胞内有活性或从所述树突细胞投递至T细胞的 至少一种T-淋巴细胞抑制分子的表达的核酸分子，优选核糖核酸分子。上文所述方法的步骤b)的经遗传工程化改造的IL-12释放DC过表达能够延长T 淋巴细胞刺激时间窗和/或完全阻止其在24小时后关闭的至少一种分子，其特征在于使分 泌维持得长于24小时，这通过导入编码所述至少一种免疫刺激分子的核酸分子来实现；或 者显示暴露于任何有效的成熟刺激物后从T淋巴细胞刺激时间窗进入成熟后24小时开始 打开的T淋巴细胞抑制时间窗的DC正常发育过程中所牵涉的至少一种分子的表达受到抑 制或下调；和/或抑制或阻止已经发育成呈现免疫抑制表型的DC表达在介导T淋巴细胞抑 制方面履行功能的至少一种分子。这是如下实现的，即敲除编码所述至少一种分子的基因 或其片段和/或导入用以抑制或阻止干扰暴露于成熟刺激物后从免疫刺激性向免疫抑制 性表型的DC正常发育的至少一种分子的表达的核酸分子，优选核糖核酸分子；和/或干扰 从DC向T细胞投递的信号，引起抑制此T细胞的活性，如此抑制免疫应答。本发明的树突 细胞使T淋巴细胞刺激(特别是CTL活化)最大化，其通过使用遗传工程来加宽约24小时 的刺激时间窗或完全阻止24小时后此刺激时间窗的关闭。作为IL-10或IDO的备选，可以使用暴露于任何成熟刺激物后约24小时开始的DC免疫抑制功能中所牵涉的其它分子(表 3、4、和5)。在制备经遗传工程化改造的免疫刺激性DC中优先靶向的会正是这些分子。特 别优选的是，使用在所呈现的DNA微阵列数据中显示两倍过表达(表3和4)，更优选至少六 倍过表达的分子。表3和4中给出的数目显示了倍数过表达，如各自栏的标题中所标示的。 特别优选的是，敲除表现出牵涉免疫抑制的分子在DC免疫药物中的表达，如图9中所描绘 的例子所表明的。通过反转上文所概述的策略，有可能设计经遗传工程化改造的T淋巴细胞抑制性 DC免疫药物，用于在例如变态反应或自身免疫性疾病，以及干细胞和器官移植中治疗免疫 系统的病理学反应过度。免疫抑制在生理学上是由在暴露于任何成熟刺激物后已经分化超 过24小时的DC介导的。如下增强此类DC的免疫抑制能力，即干扰DC分化的前24小时期 间的T淋巴细胞刺激分子的表达；和/或过表达赋予T淋巴细胞抑制的分子，其通过依照上 文所概述的策略遗传工程化改造DC来实现。smDC作为基因操作靶物的用途是本发明中心的且至关重要的部分。过去发表的 mDC的免疫刺激性效果主要由于实施许多这些实验的高度人为的实验背景，例如使用本质 上不存在的合成肽替换DC的真实靶物天然的蛋白质抗原分子或者甚至全细胞，这两者都 需要完全不同的DC摄取和加工的机制。许多其他调查人员使用鼠系统来进行他们的研究， 而且人与小鼠之间有引起大量混淆的至关重要的差异。然而，现在普遍接受的是，mDC具有 免疫抑制特性。令人惊讶的是，证明了用依照本发明的方法获得的树突细胞展现出更宽的 刺激窗(即IL-12表达的升高和延长)。发现将半成熟(sm)DC-即如下的DC，其中生理学 分化过程通过暴露于能够触发自DC进行IL-12分泌，但是不过优选在2至12小时后，更优 选在6小时后消除的任何成熟刺激物启动_遗传工程化改造成过表达CD40L分子具有将其 T淋巴细胞刺激能力维持至少24小时，优选48小时，而且甚至达5天或甚至10天的能力。 此外，优选的是，在含有IFN-Y的培养基中培养此类经遗传工程化改造的DC。此类DC通过 通常6小时暴露于Toll样受体(TLR)配体，优选但不排他的是脂多糖(LPS)，再次优选在存 在IFN- γ的情况中-参见表1-并遗传工程化改造成过表达⑶40L来给予smDC，呈现如下 表型，其特征在于连续的IL-12分泌持续至少1天，优选3天，且甚至达5天，而且在异基因 混合白细胞反应(alloMLR)中的免疫刺激能力维持至少24小时，优选48小时，但是多至5 天。应用于DC免疫药物设计，这确认DC分化的早期免疫刺激窗和较晚的免疫抑制窗的存 在及相关功能。因此，开发刺激性DC免疫药物的一般原则可以加宽早期免疫刺激窗，以便 更有效地触发免疫活化，并降低或关闭较晚的免疫抑制窗，或者对于设计抑制性DC免疫药 物反之亦然(图1)。一般而言，为了生成免疫刺激性DC药物(“DC免疫药物”;“免疫药物”)来治疗例 如癌症或传染病，初始的成熟刺激物诸如LPS/IFN- γ需要被应用于DC，以便启动从iDC成 为smDC的生理学分化。其它TLR配体(表1)可以达到与LPS相同的目的；TLR配体的组 合可以给予更强的但没有性质差异的信号。若T淋巴细胞刺激性DC免疫药物的刺激潜力 仅基于基因转移的人工操作而没有初始暴露于TLR配体介导的成熟刺激物(例如通过对未 成熟DC的直接遗传工程化改造)，则会丧失对DC功能的重要作用，并且T淋巴细胞刺激性 DC免疫药物不能达到其完全的潜力。依照本发明的经遗传工程化改造的DC免疫药物与通 过仅暴露于成熟剂或其组合(例如LPS/IFN-γ (smDC))制备的DC免疫药物的重要差异在
8于对于后一种，在DC分化相应的短暂窗期间应用smDC免疫药物是至关重要的。因此，此类 刺激性DC免疫药物不得不在暴露于成熟刺激物后不久便进行应用，而遗传工程(例如通过 过表达CD40L)目的在于加宽DC分化的免疫刺激时间，这容许应用时间的重要程度降低，但 是最重要的是，阻止DC从免疫刺激性向免疫抑制性表型的发育(图1)。可以如下实现对 DC的免疫刺激能力的相当大的改善，即敲除怀疑为免疫抑制中有重要牵涉的分子，如通过 与已知的免疫抑制分子IL-10或IDO表达类似的表达谱(expression profile)所指明的 (图3、4和5中所列的)；或者已经显示为牵涉免疫抑制的分子，因为在DC中将它们敲除导 致工程化改造DC的T细胞刺激能力改善(图9)。还有，较旧的smDC免疫药物的免疫刺激 时间窗在24小时后关闭，而新型的经遗传工程化改造的DC免疫药物会使其T淋巴细胞刺 激潜力再维持至少1天，优选3天，但多至5天。相当的思想适用于T淋巴细胞抑制性DC 免疫药物。未成熟的DC首先需要被暴露于常规的成熟刺激物，诸如LPS/IFN- γ，以便启动 朝向与DC分化的T淋巴细胞抑制窗对应的mDC表型的分化。可以在未成熟的DC成熟前通 过成熟刺激物诸如LPS/IFN- γ，而且在靶向DC前体细胞诸如来自外周血的单核细胞，或造 血干细胞和前体细胞时，特别但不排他的是在使用导致稳定整合入基因组中的基因转移方 法诸如逆转录病毒基因转移时完成从DC免疫药物遗传工程化改造成过表达T-淋巴细胞抑 制分子。在暴露于成熟刺激物前进行的遗传工程外，可以在通过例如LPS/IFN-γ启动成熟 后6小时和多至48小时完成遗传工程。在未成熟的DC被工程化改造成过表达免疫抑制分 子时，暴露于成熟刺激物后长于24小时的DC的生理学T淋巴细胞抑制活性的重要作用会 丧失，关于其原因，我们提出对DC的遗传工程化改造仅与这些DC在遗传工程前(甚至处于 前体细胞水平)或之后暴露于成熟刺激物诸如LPS/IFN-γ组合。在不对T淋巴细胞抑制 性DC免疫药物进行遗传工程化改造的情况中，此类抑制性DC免疫药物的应用不得不在DC 分化的所述抑制窗期间完成，而遗传工程化改造成过表达介导抑制T淋巴细胞活性的分子 的T淋巴细胞抑制性DC免疫药物容许对患者的施用有多得多的灵活性。表1:TLR 配体 通过遗传工程化改造在遗传工程前或之后还接受LPS/IFN- γ或类似成熟刺激物 的DC以过表达T淋巴细胞刺激分子和阻止免疫刺激窗关闭的分子，DC分化会有可能加宽 DC分化的免疫刺激时间窗。它被选择用于通过使用CD40L基因转移来证明本发明的可行 性，因为自DC表达的⑶40与自活化T淋巴细胞表达的⑶40L的相互作用向DC投递有力的 活化和成熟信号。优选地，在存在IFN-Y (其在DC成熟中是至关重要的辅因子)的情况中 实施此类实验，并且在存在IFN- γ的情况中完成实施例中报告的用CD40L转基因细胞进行 的所有实验。可以将与CD40L基因转移相同的原则应用于向DC赋予改善的刺激能力的其它 分子。或者，可以如下设计T淋巴细胞抑制性DC免疫药物，即敲除分子诸如CD40或IL-12 或类似分子的表达，或自DC免疫药物过表达赋予T淋巴细胞抑制的分子。通过干扰T-淋巴细胞抑制分子的表达和/或功能，可以使DC分化的免疫抑制 窗关闭或者变窄或者移动至较晚的时间点。如下证明此方法的可行性，即敲除干扰DC进 行T淋巴细胞活化的分子的表达。实施例部分中显示了 T淋巴细胞功能的改善，其通过敲 除DC衍生的T淋巴细胞抑制信号(如例如酶ID0，其将活化的T淋巴细胞重度依赖的色氨 酸代谢成对活化T淋巴细胞具有促凋亡效果的犬尿氨酸)来实现。作为第二个例子，靶向 IL-10 (其被认为原型免疫抑制分子，并且它在免疫抑制分化时间窗期间由DC表达)的表达。为了敲除靶分子的表达，优选使用RNA干扰，但是其他技术诸如单链单克隆抗体或反义 RNA的胞内表达可以达到相同的目的。或者，所述分子(例如IDO或IL-10)或类似分子的 过表达可以用来基于早熟的smDC设计T淋巴细胞抑制性DC免疫药物。实施例部分中的结 果(图9)显示了，敲除与IL-10和/或IDO具有相当表达动力学的分子的表达也导致遗传 工程化改造的DC的T细胞刺激能力改善。DC的结构和特性需要以考虑DC发育阶段的动力学方式进行描述。这些中每个阶 段可以以某些标志分子的存在与否来表征。这还指明，DC的分子特征依赖于此DC分化的 特定阶段和引起DC采用某种分化途径的条件。DC的发育可塑性还解释使用所谓半成熟1 型DC(smDCl)(“以释放白介素12表征的T细胞活化性树突细胞”)有利的原因。为了启 动从耐受性维持功能向免疫刺激阶段的转换，DC需要被暴露于成熟刺激物(树突细胞成熟 剂)。这打开免疫刺激时间窗，在此期间最重要的是，DC释放IL-12作为对向DC制备培养 基添加的LPS和IFN-Y或类似试剂的组合的响应。IL-12经由辅助T淋巴细胞上的特定受 体起作用，并引起它们呈现Thl表型，从而支持溶细胞性免疫。为了容许此DC/T淋巴细胞 相互作用和溶细胞性免疫的形成，优选地，在免疫刺激窗期间的早期时间点时将DC接种入 生物体(例如人)中。特别优选的是，在成熟刺激物后6小时注射所述DC。明显地，接种 与除去含有树突细胞成熟剂(例如刺激分子LPS和IFN-γ)的DC培养物有关。如下将充 分可持续的信号传送入DC中，即2小时，优选4小时，更优选6小时暴露于所述成熟剂(例 如LPS和IFN- γ )，从而在所述暴露后，DC不可逆地完成成熟过程，而且不再依赖于配体，即 DC成熟剂的存在。然而，在形式上，在应用的时候，DC尚没有完成其成熟过程，其花费1-2 天。smDCl设计最佳地利用启动成熟后和免疫抑制时间窗打开并开始下调免疫响应前的前 24小时期间的免疫刺激时间窗。在暴露于成熟刺激物诸如LPS/IFN- γ后的早期阶段，DC拥有强烈的免疫活化特 性(活化窗，图1)，而在其发育的较迟阶段，它们进入免疫抑制阶段(抑制窗，图1)。T细胞 活化的分子机制是充分研究和了解的。启动负调节反馈环的事件的分子性质被研究得少得 多。如此，依照本发明的DC免疫药物的设计目的在于加宽免疫刺激窗以增强免疫活化，并 按比例缩减或关闭免疫抑制窗，如此在DC中阻断负调节反馈环。这是通过如下遗传工程化 改造DC实现的，即在遗传工程前或之后将它们暴露于DC成熟剂(诸如LPS/IFN- γ )外过 表达免疫刺激基因，或者使用RNA干扰来敲除免疫抑制基因。可以遵循相同的基本原则来 调节众多免疫刺激或免疫抑制基因的表达。在实施例部分中显示了此办法的可行性，其通 过过表达免疫刺激性CD40L分子或者通过敲除免疫抑制性分子IL-10和IDO来进行。过表 达和敲除的组合能增强DC免疫药物的潜力，但是遵循相同的基本逻辑。可以与T淋巴细胞 刺激性DC免疫药物类似地设计用于治疗免疫系统的病理学反应过度的T淋巴细胞抑制性 DC免疫药物，其如下实现，即遗传工程化改造最初暴露于成熟刺激物(诸如LPS/IFN-γ)的 DC,将所得smDC遗传工程化改造成过表达免疫抑制性分子和/或在DC中敲除免疫刺激分 子。依照基于本发明中所描述的遗传工程得到的新型T淋巴细胞刺激性或抑制性DC 免疫药物，如下操作部分成熟的smDC，即将编码至少一种免疫刺激性或免疫抑制性分子的 核酸分子和/或用以抑制或阻止至少一种免疫抑制性或免疫刺激分子表达的核酸分子，优 选核糖核酸分子(例如siRNA)导入所述DC中。
可以通过多种方法来影响或诱导免疫刺激性以及免疫抑制性分子在DC中的表 达，由此优选的是，通过导入核酸分子来调控所述表达，如上文所概述的。例如，可以用慢病 毒基因转移载体以及脂质体介导的转染实现核酸分子转移。然而，相同的原则在采用其它 病毒载体诸如逆转录病毒或腺病毒，或非病毒载体诸如基因枪或聚阳离子技术时或者在采 用任何其它基因转移时可适用。已经开发了数种策略来将外来基因导入细胞中，包括直接注射质粒或DNA脂质体 复合物和用经修饰的病毒进行感染。然而，安全和功效是开发使用此类基因转移方法的治 疗方案的重要考虑因素。例如，在一种组织的背景中治疗性的蛋白质在另一种中可能是有 害的。因而，能限制治疗性序列向合适的细胞进行表达的转录靶向载体是特别想要的。此 外，在一些情况中，某些蛋白质可以有治疗窗，从而某些阈值下或上的表达水平分别可以是 无效的或毒性的。因此，还会想要创建构建体和设计容许外源控制表达的方法，使得治疗性 蛋白质的水平可以随着治疗需要而提高或降低。可以使用常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法来将编码各自分子的核 酸或者，备选地，抑制所述分子转录或翻译的核酸(诸如siRNA或反义RNA)导入本 发明的DC中。非病毒载体投递系统包括DNA质粒、裸核酸、和与投递载体诸如脂质 体复合的核酸。病毒载体投递系统包括DNA和RNA病毒，它们在投递至细胞后具有 附加型或整合的基因组。关于基因投递规程的综述，参见Anderson，Science 256 808-813(1992) ；Nabel 和 Feigner, TIBTECH 11 211-217(1993) ；Mitani 和 Caskey， TIBTECH 11 162-166(1993) ；Dillon, TIBTECH 11 :167_175(1993) ；Miller, Nature 357 455-460(1992) ；VanBrunt, Biotechnology 6(10) 1149-1154(1988) ；Vigne, Restorative Neurologyand Neuroscience 8:35-36(1995) ；Kremer 禾口 Perricaudet, British Medical Bulletin51 (1) 31-44(1995) ；Haddada 等，ψ Current Topics in Microbiology andlmmunology Doerfler and Bohm(编)(1995)；及Yu等，Gene Therapy 1 :13_26 (1994)。也可以使用小干扰RNA分子。在哺乳动物细胞中，长dsRNA( > 30nt)的导入常常 启动有力的抗病毒响应，其以对蛋白质合成和RNA降解的非特异性抑制所例示。RNA干扰 现象在例如 Bass，Nature 411 :428_29 (2001) ；Elbahir 等，Nature 411 494-98 (2001)；及 Fire等，Nature 391 806-11 (1998)中进行描述和讨论，其中还讨论了制备干扰RNA的方 法。优选地，本发明中使用的siRNA序列小于100个碱基对，通常为30bp或更短，并且通过 本领域中已知的方法来制备。依照本发明的例示性siRNA可以具有多至29bp、25bp、22bp、 2 Ibp、20bp、19bp、15bp、IObp、5bp或在其上下或其间的任何整数。依照本发明的一个优选的实施方案，用于制备未成熟DC的前体获自皮肤、脾、骨 髓、胸腺、淋巴结、脐带血或，最优选获自外周血。依照本发明的方法中使用的DC可以直 接分离自各自的来源或者衍生自祖细胞。本领域技术人员已知各种方法。例如，可以通 过收集抗凝固外周血、造血干细胞，通过白细胞单采血液成分术、或者通过制备暗黄覆盖 层、玫瑰花结(resetting)、离心、密度梯度离心(例如使用Ficoll (诸如FIC0LLPAQUE)、 PERC0L0(用非可透析聚乙烯吡咯烷酮(PVP)包被的胶体二氧化硅颗粒(15-30nm直径)、蔗 糖等)、差别溶解细胞、过滤等来分离DC前体和未成熟DC。在某些实施方案中，可以如下制 备白细胞群体，诸如例如自受试者收集血液，使其脱纤维蛋白，除去血小板，并使红细胞溶 胞。可以使用DC前体、单核细胞、或髓样祖细胞或干细胞来区分iDC。任选地，可以如下自外周血富集单核细胞，即例如利用其附着至塑料表面的能力，经由密度梯度进行离心，单克 隆抗体淘选、逆流离心等。若使用通过依照本发明的方法可获得的DC来治疗个体，则iDC 可以获自要治疗的个体或者获自与要治疗的个体HLA匹配的健康个体。可以将DC祖先在合适的培养基中培养和分化。合适的组织培养基包括例如RPMI 1640和DMEM。组织培养基可以补充有人自身或合并的供体血清但不是任何牛来源的血清、 氨基酸、维生素、细胞因子诸如GM-CSF和IL-4或IL-13，或IFN- γ，和二价阳离子以促进细 胞分化。优选地，也可以将祖细胞在无血清的临床级培养基中培养。与树突细胞培养基一 起使用的典型细胞因子组合包含GM-CSF和IL-4或IL-13，或IFN-γ。为了将成熟刺激物应用于DC，使有效量的至少一种DC成熟剂与iDC接触，所述成 熟刺激剂驱动它们进入smDC分化状态(遗传工程前或后或者处于DC前体细胞诸如单核细 胞或造血干细胞或前体细胞的状态)，其是本发明DC免疫药物的优选状态。优选地，至少 一种DC成熟剂选自下组热灭活的或福尔马林处理的卡介苗(BCG)，优选BCG的细胞壁成 分、BCG衍生的脂阿拉伯甘露聚糖或BCG成分，自大肠杆菌衍生的脂多糖(LPS)、或灭活的革 兰氏阳性或革兰氏阴性微生物、咪唑喹啉化合物，优选咪唑喹啉-4-胺化合物，特别是4-氨 基-2-乙氧基甲基-χ-二甲基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇或1-(2-甲基丙基)-IH-咪 唑[4，5-c]喹啉-4-胺，或其衍生物(参见例如W000/47719)、合成的双链多核糖核苷酸， 优选多聚I :C、天然的双链RNA或RNA病毒或RNA片段、或合成的类似物、或包含未甲基化 的CpG基序的合成的或天然的核酸分子。大多数这些化合物是TLR激动剂(参见表1进行 比较)。在本发明中，特别优选使用LPS作为树突细胞成熟剂。然而，原则上，单独地或与 IFN-Y组合地使用任何TLR激动剂也是可行的。原则上，也有可能将iDC暴露于供成熟用 的细胞因子混合物(其通常包括但不限于肿瘤坏死因子α (TNF-a)、IL-l、IL-6、和前列腺 素E6)或该组合的部分。此外，有可能触发CD40/CD40L信号传导途径。这可以是如下完成 的，即使iDC与处于可溶形式或固定化在表面(例如培养皿或纳米颗粒)上的重组CD40L 分子或由CD40L域与另一种蛋白质组成的融合蛋白质诸如IgG-Fc，或者与遗传工程化改造 成表达⑶40L的原代细胞或细胞系，或者与生理学上上调⑶40L表达的活化T淋巴细胞接 触。可以与TLR激动剂、炎性细胞因子任意组合地应用⑶40/⑶40L信号。当然，可以依照 本发明使用至少两种所述成熟剂的任意组合。优选地，在存在IFN-Y的情况中使至少一种 (优选至少2、3、5、10种)树突细胞成熟剂与树突细胞接触。依照本发明的另一个优选的实施方案，使遗传工程步骤c)前的iDC与有效量的至 少一种树突细胞成熟剂接触至少2小时，优选至少6小时，特别是至少12小时，且最大达 24小时。成熟时间取决于多个参数(例如DC成熟剂)。必须选择使得iDC仅部分成熟为 smDC的接触时间和其它参数，其使用本领域已知的方法来进行。可以在本领域熟悉的测定 法诸如流式细胞术和免疫组织化学中检测细胞表面标志。还可以对细胞监测细胞因子生成 (例如通过ELISA，即一种免疫测定法，或通过利用寡核苷酸阵列或蛋白质阵列)。优选地，能够介导iDC成熟为IL-12释放smDC的至少一种分子选自在存在IFN- γ 的情况中的LPS，以便为遗传工程步骤准备好DC以制备具有改善特征的新型T淋巴细胞刺 激性或抑制性DC免疫药物。能够使DC能维持其免疫刺激性表型(其特征在于例如IL-12 分泌超过约24小时的生理学免疫刺激窗)，如此与smDC相比赋予它们卓越的特征的至少一 种分子是⑶40L，通常但不必需在存在IFN-γ的情况中。本文我们选择使用基于使smDC能够人工表达CD40L (在正常情况下它们并不表达)的办法，其使用上文所概述的遗传工程来 进行。然而，不从DC自身而是从辅助原代细胞或细胞系，即活化T淋巴细胞表达CD40L，或 者使用可溶性或固定化重组CD40L分子或融合蛋白是可想象的。依照本发明的另一个优选 的实施方案，干扰介导T淋巴细胞抑制活性的DC分子表达的至少一种分子选自下组白介 素IO(IL-IO)和吲哚胺2，3_加双氧酶(ID0)。介导T淋巴细胞抑制活性的分子还可以选自 实施例部分的表2和表3中所列的分子，由此在DNA微阵列表达谱分析(profiling)数据 方面显示两倍过表达的分子是优选的，但是显示六倍或更高过表达的分子是特别优选的。依照本发明的一个优选的实施方案，至少一种抗原选自下组a)肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、或任何其它人微生物或寄生物病原体；或b)引起变态反应的环境抗原、免疫应答启动所针对的且引起疾病的自身抗原、或 移植抗原。为了生成基于smDC的具有改善特征的新型T淋巴细胞刺激性或抑制性DC免疫 药物(其能够针对个体中的抗原诱导特异性增强型免疫应答或增强型免疫抑制)，优选地， 用至少一种抗原加载iDC，之后使它们与优选的LPS/IFN-γ刺激物接触以制备smDC，接着 进行遗传工程。抗原加载对于指示T淋巴细胞针对什么抗原(正是它们必须变为活性的) 或者哪种抗原(正是认为它们耐受的)是必需的。供DC装载的抗原可以衍生自患病组织， 诸如肿瘤抗原或来自病毒感染细胞的病毒抗原。它们可以是整个死的或活的微生物或者死 的或活的原核人或动物细胞，例如人或动物肿瘤细胞或其片段。抗原可以是重组蛋白、或合 成肽、编码抗原的基于DNA的病毒或非病毒重组表达载体或者天然的或合成的RNA。或者， 抗原可以是已经触发免疫功能障碍诸如变态反应的环境抗原、已经引起疾病的生理性自身 免疫应答所针对的自身抗原、或决定器官或干细胞移植排斥的抗原诸如MHC分子。值得注 意的是，在供针对异基因移植的耐受性诱导用的T淋巴细胞抑制性DC免疫药物的情况中， 加载不可能是必要的，因为器官或干细胞供体DC携带与移植物相同的MHC分子。明显地， 在这些后者的情况中，会以如下方式设计DC免疫药物，所述方式使其抑制针对变态反应、 移植抗原、或自身抗原的免疫。为了将抗原投递至DC，可以使用多种方法，诸如容许DC吞 噬蛋白质或肽抗原的被动暴露，抗原性蛋白质复合物、表达抗原或抗原性肽的细胞或细胞 膜、肿瘤细胞胞外体(texosome)、含有抗原或抗原性肽的脂质体、编码抗原或抗原性肽的核 酸(可能整合在质粒或病毒载体中)、或来自肿瘤细胞的总RNA。这些方法已经披露于例如 W099/03499中。此类载体可以是病毒或非病毒起源的或者可以是纳米颗粒。抗原可以肿 瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原等，更一般地，寻求的免疫应答或反应所针对的任何肽或多肽。 在这方面，可以依照本领域已知的多种技术来使DC对一种或数种抗原致敏。术语“致敏” 指明抗原或其部分被暴露在DC (优选与主要组织相容性复合体(MHC)的分子复合)的表面 上。原则上，可以在没有用抗原进行在先加载的情况中将DC接种入患者中，并且实现体内 摄取抗原，例如通过直接注射入肿瘤中或进入其周围中，进入转移中，或者进入引流淋巴系 统(包括淋巴结和一级和/或二级淋巴组织)中。实质上，仅抗原的存在及其向T淋巴细胞 的呈递决定DC免疫药物，而不是抗原到达DC的方式。DC加载技术的综述参见RM Steinman 和JBanchereau (Nature，卷449/2007年9月27日，第419页-第426页)及其中的参考文 献。可以在多种免疫学功能障碍中使用本发明的抗原加载的且经过遗传改造的DC来
14治疗性调控免疫应答，这取决于向所述细胞中加载的抗原以及DC所处的生理学功能状态， 其通过使用多种信号传导分子诸如DC成熟剂，或通过对DC进行遗传功能化改造来实现。此 类功能障碍可以包括但不限于癌症，其可以描述为免疫系统不能排斥经转化的和突变的细 胞；传染病，例如在严重和在其它方面不可治疗的微生物感染的语境中或者在免疫受损的 个体中，特别在器官或干细胞移植过程中。可以由此类DC免疫药物治疗的其它免疫功能障 碍可以源自于免疫学活性过强(例如针对环境抗原)，导致变态反应，或者在免疫系统攻击 其宿主的情况中，引起自身免疫性疾病。最后，可以基于本发明的方法来设计DC免疫药物， 其干扰器官或干细胞/前体细胞移植物(包括通过遗传工程化改造其它细胞所生成的诱导 祖细胞(iPS))的排斥，如此促进其宿主对移植物的接受。依照本发明的一个优选的实施方 案，至少一种抗原选自下组肿瘤抗原、病毒抗原、和细菌抗原。可以用个体中应当诱导、抑 制、或预防的免疫应答所针对的任何抗原加载依照本发明的经过遗传工程化改造的DC。特 别优选肿瘤抗原。可以如下保藏依照本发明的具有改善的T淋巴细胞刺激性或抑制能力的新型遗 传工程化改造DC免疫药物，例如在对患者施用前在成熟为iDC前，部分成熟为smDC后， 遗传工程化改造为改善的DC前或后进行深低温保藏。可以使用的深低温保藏剂包括但不 限于二甲亚砜(DMSO)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、清蛋白、右旋糖苷、蔗糖、乙二醇、 i-赤藻糖醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨糖醇、i-肌醇、D-乳糖、氯化胆碱、氨基酸、甲 醇、乙酰胺、甘油单乙酸酯和无机盐。本发明的别的方面涉及一种药物组合物，其包含依照本发明的具有改善的T淋巴 细胞刺激或抑制能力的新型遗传工程化改造DC免疫药物。可以使用熟练技术人员公知的 方法和组成来将本发明的DC与生理学可接受载体、赋形剂、缓冲剂、和/或稀释剂一起配 制。可以直接对需要免疫调控的受试者施用具有改善的T淋巴细胞刺激或抑制能力 的新型遗传工程化改造DC免疫药物。典型地，将约IO2至约IOltl个细胞在生理学可接受载 体中悬浮。若治疗患有癌症的个体，优选地，将细胞注射入没有疾病的淋巴结中，优选地，进 入腹股沟区中，但是任何没有肿瘤或携带肿瘤(转移性)的淋巴结会达到该目的，直接进入 肿瘤中或者进入与肿瘤或肿瘤床接近、邻近、或循环或淋巴接触的区域中，或者进入转移性 疾病中。可以将DC免疫药物皮下或真皮内应用于皮肤中以容许迁移入淋巴结中。原则上， 还有可能将DC免疫药物注射入血流中，作为单一注射或者作为在较长的一段时间里的输 注，进入外周血中或者经由导管进入供给患病器官或身体区域的血管(动脉或静脉)，或门 静脉或肺静脉或动脉等中。可以使用如下的植入释放装置，其将DC药物的连续流投递入肿 瘤或转移、淋巴结、血流、或皮肤中。可以通过适合于施用配方和模式的任何手段来施用本发明的具有改善的T淋巴 细胞刺激或抑制能力的新型遗传工程化改造DC免疫药物。例如，可以将细胞与药学可接受 载体组合，并用注射器、导管、插管等来施用。如上述的，可以在缓慢释放基质中配制细胞。 在以此方式施用时，可以通过适合于所使用的基质的手段来施用配制剂。对本发明可适用 的其它施用方法和模式是熟练技术人员公知的。可以在治疗个体中单独使用本发明的组合物，或者可以与任何其它用于治疗肿瘤 的方法组合地使用该组合物。例如，在放射疗法和/或化学疗法(细胞毒性药物、凋亡剂、抗体等)；冷冻疗法；近程放射治疗；其它形式的免疫疗法(离体扩充的肿瘤抗原特异性T 淋巴细胞、NK细胞、细胞因子和生长因子、肿瘤抗原特异性抗体、或靶向对肿瘤细胞存活至 关重要的肿瘤组织的结构诸如血管等)；使用病毒或非病毒载体进行的基因疗法等之前、 同时、或之后与肿瘤的手术切割术组合使用本发明的方法。此外，本发明的DC免疫药物可 以与另一种药剂共施用，所述药剂充当佐剂来使树突细胞成熟和/或加工肿瘤或肿瘤附近 或邻近区域内的抗原。还可以以任意组合使用任何和所有这些方法。联合治疗可以是同时 的或序贯的，而且可以以任何次序施用，如由治疗医生所确定的。本发明的另一方面涉及使用依照本发明的树突细胞来制备药物以治疗和/或预 防癌症和/或微生物或寄生物感染；或者以治疗和/或预防变态反应、自身免疫性疾病、或 干细胞或器官移植排斥。优选地，可以在癌症预防和/或癌症治疗中采用依照本发明的部 分成熟的树突细胞。在此类情况中，用至少一种肿瘤抗原加载树突细胞。例如，但不限于， 可以将细胞直接施用入肿瘤中，手术除去或切除肿瘤后以肿瘤旁进入肿瘤床中，进入与肿 瘤直接接触的引流淋巴结中，进入引起或喂养肿瘤或受肿瘤所累的器官的血管或淋巴导管 (例如门静脉或肺静脉或动脉等)中。可以在肿瘤的其它治疗诸如化学疗法或放射疗法同时或之后应用本发明的部分 成熟的树突细胞的施用。此外，本发明的部分成熟的树突细胞可以与另一种药剂共施用，所 述药剂充当佐剂来使树突细胞成熟和/或加工肿瘤或肿瘤附近或邻近区域内的抗原。还可 以以任意组合使用任何和所有这些方法。联合治疗可以是同时的或序贯的，而且可以以任 何次序施用，如由治疗医生所确定的。另外，还可以将树突细胞配制或混合入缓慢释放基质 中以植入肿瘤或肿瘤床中或周围的区域中，使得细胞被缓慢释放入肿瘤或肿瘤床中，以便 与肿瘤抗原接触。依照本发明的一个优选的实施方案，在放射疗法和/或抗肿瘤或抗微生物化学疗 法、或目的在于治疗变态反应、自身免疫性疾病、或干细胞或器官移植排斥的任何疗法前、 同时、或之后对个体施用所述药物。可以与其它癌症疗法组合采用依照本发明的树突细胞 以便实现甚至更有益的效果。本发明的另一方面涉及依照本发明的树突细胞用于制备药物的用途，所述药物用 于治疗和/或预防由免疫系统针对环境抗原(诸如变态反应)，或针对自身免疫性疾病过程 中的自身抗原的生理性反应过度引起的免疫学疾病。优选地，在目的在于治疗或预防变态反应或自身免疫性疾病的其它药征前、同时、 或之后对个体施用所述药物。本发明的别的方面涉及依照本发明的树突细胞用于制备药物的用途，所述药物用 于治疗和/或预防异基因干细胞移植的免疫学排斥(优选地，在治疗血液学恶性肿瘤中使 用)，或者用于治疗和/或预防异基因器官移植的排斥。优选地，在目的在于治疗或预防异基因干细胞或器官移植排斥的其它药征 (modality)前、同时、或之后对个体施用所述药物。本发明通过以下各图和实施例进一步例示，然而，不限于此。图1在DC分化过程的动力学图示中显示了 DC的发育可塑性。图2显示了 smDCl基础设计的质量对照。图3显示了⑶40L基因转移的结果。
图4显示了 IL-12和IL-10分泌的数量和质量。图5显示了溶细胞活性的潜力(正方形，⑶40L转基因DC ；菱形，GFP转基因DC ； 三角形，对照DC)。图6显示了敲除IL-10表达的LPS活化DC的免疫刺激能力。图7显示了具有沉默的IDO表达的LPS活化DC的免疫刺激能力。图8显示了 DC表达谱分析实验的实验设计。图9a显示了使用RNA干扰敲除DC中在表达谱分析实验中鉴定的靶分子的表达后 的增殖响应改善的例子。图9b显示了如下基因的别的例子，所述基因在用siRNA敲除其在 DC中的表达后导致此类经遗传工程化改造的DC对异基因淋巴细胞的刺激能力改善，如与 对照siRNA转染或未转染的DC相比所指明的，如所标示的。实施例通过遗传工程制备T淋巴细胞刺激性或抑制性DC免疫药物的方法。白细胞单采血液成分术使用Amicus白细胞单采血液成分术装置(Baxter，Deerfield, IL)从健康志愿者 和在得到负责的机构审查委员会批准的临床试验背景中治疗的患有各种瘤形成的患者收 集白细胞。依照世界医学协会(World Medical Association)赫尔辛基宣言，所有个体均 对这些研究给予他们的知情同意。在Sysmex细胞计数器(Sysmex，Bornbarch，德国)上和 /或通过流式细胞术测定细胞数目和子集。单核细胞富集使用补充有1 %人合并AB血浆(Octaplas, Octapharma, Vienna,奥地利)的 AIM-V(Invitrogen, Carlsbad, CA)或 CellGro 培养基(CellGenix，Freiburg，德国)通过塑 料粘着来富集单核细胞，如先前所描述的。对于线内规程，我们遵循制造商提供的指令。使 用Elutra细胞分离器(Gambro BCT，Lakewood，C0)，通过在维持2400rpm的离心速度时加载 入淘析室中来从白细胞单采血液成分术产物富集单核细胞。此后，离心速度和淘析培养基 (PBS/HSA Baxter, NewJersey, NJ)流动保持不变以进行细胞分级。或者，用CliniMACS细胞 选择系统(Miltenyi，Bergisch Gladbach，德国)完成对单核细胞的选择，所述CliniMACS 细胞选择系统使用经CD14包被的磁珠在磁性柱中保留单核细胞。用于单核细胞富集的另 一种选项是使用Isolex 300 磁性细胞选择器(Nexel 1, Irvine, CA)来完成T和B淋巴细 胞的消减以富集单核细胞。如下在磁性柱中保留淋巴细胞，即使它们与经CD2和CD19包被 的磁珠接触，并收集流过液。通过流式细胞术表征所有富集规程的最终产物。流式细胞术使用 Trucount 系统(Becton Dickinson, New Jersey, NJ)分另Ij 通过用抗 CD45-FITC、抗 CD3-PerCP、抗 CD19-APC、抗 CD14-APC、和抗 CD15_FITC(BD Pharmingen San Diego, CA)标记的抗体对白细胞单采血液成分术和单核细胞富集产物分析总体淋巴细 胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、和粒细胞。在FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson,Mountain View,CA)上分析经标记的细胞。合适的同种型对照抗体包括在分析 中。DC 制备以IxlO6个单核细胞/cm2的密度在补充有2%合并人AB血浆的AIM-V培养基中或 者在CellGro培养基中于37°C在湿润培养箱中培养通过上文所述的各种富集规程分离的单核细胞达6天。培养基补充有1000U/ml人GM-CSF和300U/ml人IL-4 (均来自CellGenix， Freiburg，德国)，并在第3天用相同体积的AIM-V/^2% OP或CellGro加上GM-CSF和IL-4 替换。在第 6 天时如下实施成熟，即将 50ng/ml IFN- y (Boehringer Ingelheim, Vienna, 奥地利)和脂多糖(LPS，大肠杆菌菌株0111 :B4, Calbiochem, San Diego, CA, USA)(范围 为1-lOOOng/ml)添加至培养物达6小时以生成半成熟(sm)DC，随后将其冷冻；用临床级 LPS (US药典，Bethesda, MD)制备患者的DC疫苗。DC免疫表型分析使用下列抗体来测定DC的成熟状态抗CD86_APC(BD Pharmingen, SanDiego, CA)、抗 CD80-PE(Immunotech, Beckman Coulter, Fullerton, CA)、抗 CD83-APC(三种都 来自 BD Pharmingen，San Diego，CA)、抗 MHC I-PE、抗 MHC II-FITC(两者都来自 Dako 〇7切1118“011，〇8犷？土1^61~土8，。八)、禾口抗〇045- 61^ (80 Pharmingen，San Diego，CA)。通过鹏 化丙啶染色(Sigma，St. Louis，M0)来测量DC的成活力。使用FACS Calibur流式细胞仪来 分析细胞。合适的同种型对照抗体包括在分析中。通过ELISA进行的IL-12检测如先前所描述的那样测量DC培养物的上清液中的IL-12浓度。异基因混合的白细胞反应通过梯度离心自外周血分离异基因应答PBMC。一式三份将刺激性DC(10000个、 2000个、或400个)与IO5个应答细胞在96孔圆底平板上在200 μ 1补充有2%合并人血 浆的AIM-V培养基中放置在一起。对于阳性参照，用lOOng/ml葡萄球菌肠毒素A/B(SEA/ SEB, Toxin Technologies Inc.，Sarasota，FL)刺激 IO5 个应答细胞。在第 4 天，将共培养 物与1 μ Ci氚胸苷溶液(NEN LifeScience Products,Boston,MA) 一起再温育18小时。最 后，用 Skatron(Lier，Norway)收集器收获细胞。使用 Trilux 读板仪(Wallac 0y, Turku, 芬兰)来计算掺入的氚胸苷。或者，用CFSE(Molecular Probes, Eugene, OR)标记异基因 PBMC，并以Ι/δ,Ι/ΚΚΙΛ ΚΙΛΟ、和1/80的比率与DC混合。对于对照，没有添加DC或SEA/ SEB0最后，用抗⑶3-PerCP标记PBMC，并使用FACSCalibur流式细胞仪来分析。测定⑶3 阳性CFSE阴性T淋巴细胞的百分比。向smDC中进行慢病毒基因转移使用ViraPower 慢病毒表达系统(来自Invitrogen)，通过与编码病毒结构蛋白、 聚合酶和逆转录酶的PLP质粒(pLP/VSVG、pLP-1、pLP-2)和含有GFP或⑶40L的质粒共转 染293FT生产细胞系来生成慢病毒颗粒。共转染后72小时，收获所有上清液，并通过超离 心浓缩ΙΟΟχ。在上文所概述的条件下培养DC，并使其成熟。分别在启动成熟后48小时或6 小时收获DC。然后用与6μ g/mlPolybrene (来自Sigma-Aldrich)加上标准浓度的IL-4、 GM-CSFJP IFN-Y组合的慢病毒颗粒(250 μ 1 IOOx浓缩的慢病毒上清液/IxlO6个DC)转 导早熟的smDC。对于IL-12质量对照，在24小时后采集上清液，并在48小时后遵循标准规 程来测量GFP/⑶40L的表达。DC中的RNA干扰依照上文所概述的标准规程来制备DC。在第6天，使用转染试剂(Dharmacon)依照 制造商的指令用IOOpmol基因特异性siRNA转染IO6个DC。转染后12小时，用LPS/IFN-γ 刺激DC达6小时。所有应用均与上文所概述的方法类似。
结果目前使用中的DC免疫药物采用单核细胞衍生的DC，其加载有任何性质的抗原，如 介绍中所概述的，并暴露于具有触发IL-12从DC释放的能力的成熟刺激物。以IL-12分泌 表征的DC表型具有诱导支持溶细胞免疫的1型免疫系统极化的能力。这暗示刺激性DC免 疫药物需要在IL-12分泌的时间窗期间应用于患者以容许抗原在存在IL-12的情况中从DC 呈递至T淋巴细胞(图1)。具有改善的T淋巴细胞刺激或抑制能力的新型遗传工程化改 造DC免疫药物克服此限制，因为对DC的遗传操作容许免疫刺激窗保持开放达较长的时间 期限。在以下实施例中，已经制备和研究经遗传工程化改造的DC免疫药物。使用慢病毒 基因转基因或基于脂质体的转染来将DNA或RNA投递入DC中，但是可以假设，任何核酸投 递技术可以在所述能力中起作用。作为免疫刺激基因在DC免疫药物中过表达的例子，使用 慢病毒基因转移来工程化改造DC以表达⑶40L分子。功能研究确认，此类工程化改造DC 免疫药物具有增强的刺激免疫应答的潜力。此外，证明了敲除免疫抑制性分子IL-10和IDO 也增强刺激能力，其通过用设计用于RNA干扰IL-10和IDO的siRNA分子工程化改造DC来 实现。为了鉴定牵涉免疫抑制反馈环的别的DC分子，使用DNA微阵列进行全基因组DNA表 达谱分析。基于为与IL-10或IDO的基因表达谱具有类似表达谱的基因分组的簇分析，发 现基因列表具有负调节免疫应答的潜力。如此，在DC免疫药物中敲除这些基因会改善其免 疫刺激能力。因此，为了容许对规定的免疫系统成分进行特定调控而遗传工程化改造的DC 免疫药物实现相关免疫系统功能障碍的治疗。最后，显示了使用RNA干扰敲除DC表达谱分 析实验中以与IL-10或IDO类似的动力学表达的靶基因的功能后果的例子。在与异基因T 淋巴细胞的共培养物中，观察到此类经遗传工程化改造的DC触发增殖的能力改善，指明增 强的T淋巴细胞刺激。图2显示了用于遗传工程的smDCl基础设计的质量对照。DC免疫药物必须满足 规定的质量对照标准。小图A显示了自外周血单核细胞制备的DC的纯度、成活力、和产量。 通过白细胞单采血液成分术来收集此类单核细胞，并通过逆流离心(淘析)来富集单核细 胞。在存在IL-4和GM-CSF的情况中，单核细胞在6天内在体外分化成iDC。用抗原加载 iDC，随后暴露于由LPS和IFN-γ组成的成熟刺激物达6小时，并将其冷冻。在此阶段。它 们称作半成熟的，因为虽然它们不可逆地继续其成熟，但是它们尚未显示mDC的典型表型 和功能特征。最重要地，在所述阶段(免疫刺激窗，启动成熟后约0-24小时，图1)，DC触 发成熟，反之在较晚的阶段(免疫抑制窗，启动成熟后约24-48小时，图1)。然而，在临床 应用中，在此分化阶段将它们注射入患者中，在那里它们完成其成熟，并触发免疫应答(24 小时前)，但是随后(在约24小时时)也进入_依照其由成熟刺激物触发的生理学发育程 序_免疫抑制阶段(我们旨在通过遗传工程化改造DC免疫药物来阻止)。对于质量对照，将一等分试样的DC免疫药物融化，并再培养2天以便让DC完成其 成熟过程。这两天期间，它们分泌细胞因子，最重要的是IL-12(成熟后早期)和IL-10(成 熟后晚期)(小图B ；显示了来自三个个体的均值士SEM)。还有，它们显示了至关重要的DC 膜分子的表达样式的变化(小图C)。最后，通过以指定的比率与经CFSE标记的异基因PBMC 共培养(其触发与CFSE的稀释度和荧光降低有关的细胞分裂)来对DC进行alIoMLR潜力 测试(小图D)。柱形图显示了来自三个个体的增殖细胞的均值士SEM百分比。
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初始刺激物对于启动免疫抑制反馈环也是必要的。一般而言，响应特定刺激物的 活化越强，反馈信号传导会越强，以便将免疫活化下调至其基线水平，由此阻止免疫应答失 去控制和引起自身免疫性疾病。如此，发现成熟刺激物LPS/IFN-γ导致最高量的IL-12释 放，而且导致最高量的IL-10释放。表2 供癌症接种用的smDCl的基础设计的规格 经由过表达⑶40L分子增强的刺激性DC免疫药物的描述。为了加宽以分泌IL-12表征的DC的免疫刺激窗(图1)，将DC遗传工程化改造成 过表达⑶40L。此分子通常自活化T淋巴细胞表达，并与DC上的⑶40相互作用，将至关重 要的活化信号传送入DC中。将此实验设计为将活化分子转移入DC免疫药物中的一个例子。 然而，原则上，可以对其它刺激分子使用相同的规程或者，为了设计抑制性DC免疫药物，可 以自DC过表达免疫抑制性分子。具体地，⑶40L基因转移入DC中的基本原理是(i)容许DC变为与活化T淋巴细胞无关以将⑶40L信号投递至DC ；(ii)在本实验中假设并发现，由于在DC自身上通过从组成性活性启动子的表达 实现⑶40L的连续存在，使DC能够分泌IL-12达如下的时间期限，其比在DC受到常规成熟 刺激物诸如LPS/IFN-γ时长得多；(iii)与单独的LPS/IFN- γ或CD40L/IFN- γ刺激物相比自DC分泌的IL-12总量 是高得相当多，并且IL-12分泌的动力学在性质上已经有所不同，在应用刺激物后更早开 始，如此加宽DC分化的免疫刺激窗；(iv)暴露于LPS/IFN-γ后甚至48小时，此时DC已经耗尽其分泌IL-12的能力， ⑶40L基因转移使DC能够开始IL-12分泌的第二阶段(图3)。
图3显示了⑶40L基因转移。在小图A中，显示了慢病毒基因转移后在6小时smDC 和48小时mDC中的GFP或⑶40L表达。将早熟的DC暴露于慢病毒载体后48小时完成本 文显示的所有实验。与iDC、暴露于单独的LPS/IFN- γ的DC、或经GFP工程化改造的6小 时smDC和48小时mDC相比自DC表达CD40L引起IL-12的分泌增强(小图B)。GFP基因转 移后增强的IL-12释放可能是由病毒双链RNA引起的，所述病毒双链RNA经由6小时smDC 中但不再在48小时LPS/IFN-YmDC中表达的TLR(参见表1)发信号。通过向DC(黑色直 方图，未成熟的DC ；白色直方图，mDC)中进行慢病毒基因转移没有改变功能上重要的DC膜 分子的表达谱(小图C)。细胞因子IL-12和IL-10的分泌在暴露于LPS/IFN-γ、⑶40L/IFN-Y、或两者的组 合的DC中在质量和数量方面有所不同(图4)。与单独的CD40L/IFN-Y刺激物相比，IL-12 的分泌在应用组合刺激物时高几乎两倍，而且与单独的LPS/IFN-γ刺激物相比也是高得 相当多的。另外，来自暴露于LPS/IFN-γ/⑶40L组合刺激物的DC的IL-12分泌在12小时 后已经明显地以相当大的量可检出，而LPS/IFN-γ和⑶40L/IFN-Y仅在暴露于初始成熟 信号后12和24小时之间触发生物学相关水平的IL-12分泌。这种观察与加宽DC分化的 免疫刺激窗以便改善DC免疫药物的刺激能力的本发明目的一致。IL-10的最大限度表达在 DC暴露于LPS/IFN- γ /⑶40L或单独的⑶40L/IFN- γ时是相似的，但是在仅对DC成熟使用 LPS/IFN- γ时较低。然而，免疫抑制性细胞因子IL-10在⑶40L/IFN-Y信号传导后12小 时后已经以生物学相关水平可检测，而组合刺激物LPS/IFN- γ /⑶40L显示与那些仅LPS/ IFN-y成熟的DC的动力学类似的动力学。CD40L/IFN-Y刺激后的IL-10早期释放负干扰 DC分化的免疫刺激窗，并且应当(在设计免疫刺激性DC药物的情况中)避免。推断与应用 单独的LPS/IFN- γ或CD40L/IFN- γ相比，组合刺激物LPS/IFN- y /CD40L的免疫刺激能力 与免疫抑制能力间平衡的净效果(考虑IL-12和IL-10的分泌样式)明显朝向改善的免疫 刺激能力。与较早的出版物形成对照，本文所使用的DC会接受成熟刺激物的组合。在生理 学上，DC能活化T淋巴细胞的阶段(以IL-12分泌表征)和DC会抑制T淋巴细胞活性的 第二阶段(以IL-10分泌和由酶IDO活性引起的色氨酸消减表征)会通过使iDC与足够的 成熟刺激物诸如LPS/IFN- γ接触来触发(图1)。本文证明了初始暴露于LPS/IFN- γ (或 者在存在IFN- γ的情况中的另一种TLR激动剂)，接着将DC遗传工程化改造成过表达诸如 ⑶40L等分子维持能够T淋巴细胞活化的DC表型，并阻止DC呈现抑制表型(图4)。IL-12 的分泌在存在IFN- γ的情况中经由TLR信号传导途径实现的初始成熟后6小时或48小时 完成遗传工程时维持得长于20-24小时的生理学时间窗。图4显示了 IL-12和IL-10分泌的数量和质量。在存在IFN- γ的情况中将DC暴 露于指定的成熟刺激物。在指定的时间点测量IL-12和IL-10在培养物上清液中的浓度。在遗传工程化改造T淋巴细胞刺激性DC免疫药物的本设计中特别重要的是IL-12 分泌DC具有经由1型免疫应答极化触发溶细胞免疫的能力。如此，通过分析粒酶B在CD8 阳性CTL中的含量来进一步调查暴露于CD40L转基因DC的T淋巴细胞触发溶细胞免疫应 答的潜力(图5)。确实，发现与对照GFP转基因DC或未转导mDC相比，CTL与⑶40L转基 因DC的共培养导致粒酶B表达明显增强。这是此类CTL的溶细胞潜力改善的一项强烈指 标，如此提供来自DC免疫药物的CD40L表达具有改善的免疫刺激能力的证据。图5显示了溶细胞活性的潜力。与GFP转基因DC(菱形)和未转导的mDC(三角形)相比，CTL的总百分比在将PBMC与⑶40L转基因DC(左侧小图，正方形)共培养时仅略 微升高。在分析与CD40L转基因DC共培养的CTL中的粒酶B表达时，与GFP转基因DC (菱 形)和未转导mDC(三角形)相比，发现明显升高(右侧小图，正方形)。通过敲除免疫抑制性细胞因子IL-10的表达的工程化改造得到的具有改善的T淋 巴细胞刺激能力的DC免疫药物的描述基于其中敲除介导免疫抑制的分子表达的DC免疫药物的假设，设计实验来阻断 DC中的IL-10基因表达，其通过使用4种靶物特异性siRNA的集合进行RNA干扰来实现(图 6)。这导致LPS/IFN-γ活化DC中非常一致且可再现的IL-10表达敲除，与对照沉默的mDC 相比导致较高的IL-12分泌。此观察暗示自分泌途径，其基于自DC分泌的IL-10结合同一 DC上的IL-10受体，导致下调的IL-12生成。不同于发现经遗传工程化改造的与正常的DC 之间没有免疫表型差异，如通过⑶80、⑶86、MHC I类、和II类表达所评估的。最重要的是， 在alloMLR中，观察到与对照实验相比，为了抑制IL-10分泌以活化T淋巴细胞而工程化改 造的DC免疫药物的大得相当多的潜力。另外，⑶25+FoxP3+细胞在⑶4+T细胞群体(推测为抑制免疫应答的调节性T细 胞(Tregs)群体)中的百分比降低，可能是由于LPS/IFN-γ活化的DC中的IL-10沉默。图6显示了通过遗传工程阻断IL-10表达的LPS/IFN- γ活化DC的免疫刺激能力。 用LPS/IFN- γ活化前12小时，用4种IL-10特异性siRNA的集合或非特异性对照siRNA转 染DC。然后用6小时LPS成熟的DC (mDC)(或是IL-10 (黑色柱形)或是对照沉默的(白色 柱形))以1 3 = DC T细胞比率刺激分离的异基因⑶3+T细胞。使用Trucount系统和 FACS LSRII流式细胞仪在共培养的第6天分析CD4+、CD8+、(小图Α)和CD4+CD25+FoxP3+T 细胞(小图B)。LPS/IFN- γ活化后48小时分别通过流式细胞仪和ELISA来测量免疫表型 以及IL-10和IL-12分泌(小图C)。免疫表型分析在IL-10沉默的DC(小图D)或对照沉 默的DC(小图E)中比较LPS/IFN-γ活化的DC(白色直方图)与iDC(黑色直方图)。为了敲除免疫抑制性酶IDO的表达而工程化改造的T淋巴细胞刺激性DC免疫药 物的描述使用siRNA来敲除已知的免疫抑制性效应分子IDO的表达(图7)。为了优化siRNA 转染和IDO敲除的效率，首先使用用IFN-Y活化的HeLa细胞。随后，在经优化的条件下转 染DC。在HeLa细胞和DC两者中，可以沉默IDO的表达，如Western印迹实验中所表明的。 在alloMLR潜力测定法中使用IDO沉默的DC、用杂混的对照siRNA转染的DC、和iDC作为 刺激物。观察到与用混杂的siRNA转染的DC或iDC相比IDO沉默的DC的刺激潜力是大得 相当多的。这适用于⑶8+CTL以及⑶4+Th细胞。图7显示了具有沉默的IDO表达的LPS/IFN- γ活化DC的免疫刺激能力。首先， 使用Western印迹实验来证明在HeLa细胞(小图A)以及DC(小图B)中有效的IDO敲除。 为了调查IDO沉默的DC对⑶8+CTL(小图C)和⑶4+Th淋巴纽胞(小图D)的刺激潜力，将 PBMC与IDO沉默的DC (正方形)、对照沉默的DC (菱形，sera =序列混杂的)、或iDC (三角 形)共培养。在所有情况中，IDO沉默的DC的刺激能力优于对照。免疫抑制分子使用全基因组DNA微阵列来产生暴露于成熟刺激物LPS/IFN- γ、⑶40L/IFN- γ信 号传导、或LPS/IFN- y /CD40L信号传导的组合，以及合适的对照的DC的表达谱(图8)。
图8显示了 DC表达谱分析。将DC暴露于指定的成熟刺激物或者维持未成熟。在 指定的时间点提取RNA，并使用全基因组DNA微阵列来进行表达谱分析。使用CarmaWeb (基 于全面 R 的微阵列分析，Bioinformatics Graz and theTyrolean Cancer Research Institute，奥地利)来分析表达谱分析的结果。将所有数据分成20个簇，其使用CarmaWeb 软件平台的基本算法，并鉴定含有IDO和IL-IO的簇。在这些簇中的基因与两种已知免疫 抑制性DC分子具有类似的表达谱，这得出如下结论，即它们在DC的免疫调节中具有也是免 疫抑制性的功能(表3和表4)。表3 :ID0表达簇。依照CarmaWeb算法，所列基因具有的表达谱类似于IDO(基因 名称IND0)的表达谱，提示与IDO功能类似的功能(数目是相对于未成熟DC的log，其中底
数为2)。
6小时LPS 12 小吋 LPS 24小时LPS48小时 LPS
IFN- y 对6 小 CD40LIFN-y CD40LIFN-y CD40LIFN-y
独特的ID 名称时iDCM 对12/J、时iDC M对24小时iDC M对48小对iDC M
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218574__s_atLMCDl00，0043992160，0059916544, 832267
218975_atC0L5A301，84760333，250586343477015
219168__s_atPRR500，38023341，88337354903607
219181_atLIPG00，0340280871，76504584，60227
221731__x_atCSPG201，17400241， 119919843726726
224950_atPTGFRN00，27113822，54823140687737
225571_atLIFR01，23337072， 129243127829444
226621_atFGG00，916111352，209293431336222
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-0，00254589
231867_at0DZ203-9，53E-044, 766165
232739_atSPIB0-0，033940052，82789062，699333
235100—at0
237344—at0
239808—atPITPNCl0
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41469—atPI30
47069atPRR50
52255—s—atC0L5A30
223503—atDKFZP566N0340
在本DNA微阵列中，还鉴定出在LPS/:
1， 1068798 0， 14466353 -0，03585563 6
0，35803238 0，042725943 -0，00170695 6
0，08784416 -0，30954257 2，9138856 0，001206623
2，099443 0，72832346
0，69854295 1，2584826 2，1449049
2，8572736 3,8997574 1，9246503 3,5991492 0，010989565
3,164012 5，1735163
4， 18631 3,8403585 3,0019956
4，300132 2，944381 5，094549 5，075999 4，3298063
诱导，且牵涉调节基因IL-10、TSLP, IND0, IL2RA、CSF-2和CSF-3 (已知它们都具有免疫抑 制效果)的基因。为了鉴定免疫调节的潜在的主开关，用Pathway Studio软件使用Resnet 5 (第1. 2版，2007年1月)(自PubMed和44份开架阅览期刊获得的哺乳动物途径和分子 相互作用的数据库)产生那些基因的调节物的网络。通过将来自差别活化DC的微阵列数
据上载至调节网离1，然后可以选择使DC成熟中诱导的潜在主调节物
表5:免疫调节的主开关。
免疫调节Affymetrix 索弓|
STAT6ILlO201332_s_at
LITAFILlO200706_s_at
IL10, INDO, IL2RA,
STATlCSF3232375_at
IRF4IL10, CSF2204562_at
IRFlIL10, I NDO, IL2RA202531_at
IRF2未知203275_at
RELILlO206035_at
NFKBlIL10, IL2RA239876_at
STAT3IL2RA235680_at
RELAIL10, IL2RA209878_s_at
JUNBIL10, CSF2201473_at
CEBPBIL10, CSF3212501_at
TBX21IL10, IL2RA220684_at
JUNCSF2201465_s_at
STAT5BIL2RA205026_at
STAT5AIL2RA, CSF2203010_at
STAT4未知206118_at
ETV6CSF2205585_at
EGRlIL2RA227404 s at
NFATClILlO210162_s_at
CREBlCSF2214513_s_at
JAKlTSLJP，CSF3155261l_a_at
JAK3IL10, TSLP, CSF2227677_at
LYNILlO202626_s_at
MAPKA
PK2IL10201460_at
MAP21IL10, IL2RA, CSF2202670_at
CD274未知223834_at
PDL2ILlO224399_at
PTGR4IL10, IL2RA204896_s_at
ITGAXILlO210184_at
ADORA
2AILlO205013_s_at
SerpinAlILlO202833_s_at
SerpinElCSF2202627_s_at
AREGCSF2205239_at
OSMCSF3, CSF2230170_at
S0CS3未知206359_at
IFNGINDO, IL2RA210354_at
图9显示了使用RNA干扰敲除DC中在表达谱分析中
的增殖响应的例子。显示了，展现出与IL-10、IDO类似的DC表达动力学，或者属于免疫调节的 主开关簇的基因牵涉负调节免疫抑制反馈环。设计与那些使用RNA干扰敲除IL-10或IDO表 达的实验类似的实验。用对来自表3、4、或5的基因特异性的siRNA转染DC。图9中显示了基 因 MAPKAPK2、IRF2、PHFlU IRF4、JAKU CEBPB、和 ETV6。通过用 LPS/IFN-g 暴露 6 小时来启动成 熟后，将经过工程化改造的DC与异基因T淋巴细胞共培养6天。用CFSE(即一种进入细胞、结 合蛋白质，并被保留在细胞内部的荧光染料)标记异基因T淋巴细胞；洗掉过量的CFSE。随着 每次细胞分裂，T淋巴细胞的荧光强度被平分，这容许在共培养第6天时评估T淋巴细胞增殖。 作为对照，使用未转染的DC或用对照siRNA转染的DC。经工程化改造的DC刺激异基因T淋巴 细胞的能力改善提供关于siRNA靶向的基因牵涉负调节反馈环的证据。此外，这指明与常规的 免疫治疗剂相比，为了敲除此类基因而遗传工程化改造的DC免疫药物会具有改善的治疗效果。结论本发明提供了如下证据，即DC免疫药物的特征可以通过遗传工程进行调控。证明 了免疫刺激分子在DC中的过表达以及阻断免疫抑制性分子导致增强的免疫刺激能力。这 可以获得作为DC癌症疫苗或抗感染DC免疫药物的应用，其中给DC加载肿瘤衍生的抗原或 自微生物衍生的抗原，将其暴露于成熟刺激物，并进行工程化改造，如所描述的。另外，本文 所呈现的数据暗示可以如下设计免疫抑制性DC药物，即敲除免疫刺激分子和过表达免疫 抑制性分子。此类抑制性DC免疫药物可以在变态反应或自身免疫中，而且在移植药物中具 有应用，以便使移植接收者的免疫系统对所移植的组织变成无反应性(tolerise)。
权利要求
包含部分成熟的树突细胞的药物制剂，其通过包括下列步骤的方法可获得a)提供未成熟的树突细胞或其前体细胞或部分成熟的树突细胞，所述部分成熟的树突细胞如下可获得，即使未成熟的树突细胞与至少一种树突细胞成熟剂接触来生成部分成熟的树突细胞(半成熟的DC，smDC)，如以其分泌IL 12的能力所定义的，b)操作步骤a)的所述细胞，特别是步骤a)的释放IL 12的所述部分成熟的树突细胞(半成熟的DC，smDC)，以便(i)过表达能够使以连续的IL 12分泌表征的树突细胞的T淋巴细胞刺激能力维持至少24小时，优选至少48小时，且选自CD40L的至少一种免疫分子，其通过导入编码所述至少一种分子的核酸分子来实现；和/或(ii)抑制或阻止在暴露于初级成熟剂诸如LPS/IFN γ的树突细胞内起作用或自暴露于初级成熟剂诸如LPS/IFN γ的树突细胞释放，并且选自白介素10(IL 10)和吲哚胺2，3 加双氧酶(IDO)的至少一种T 淋巴细胞抑制分子，诸如表3、4和/或5中给出的至少一种基因的表达，其如下实现，即敲除编码所述至少一种T 淋巴细胞抑制分子的基因或其片段或导入用以抑制或阻止在所述树突细胞内有活性或从所述树突细胞投递至T细胞的至少一种T 淋巴细胞抑制分子的表达的核酸分子，优选核糖核酸分子，并c)任选地，添加物质来将树突细胞的前体细胞转化成树突细胞。
2.依照权利要求1的制剂，其特征在于所述未成熟树突细胞的前体，特别是单核细胞 或造血干细胞，或所述未成熟的树突细胞获自皮肤、脾、骨髓、胸腺、淋巴结、脐带血、或外周 血。
3.依照权利要求1或2的制剂，其特征在于所述至少一种树突细胞成熟剂选自下组 TLR激动剂诸如热灭活的或经福尔马林处理的卡介苗(BCG)，优选BCG的细胞壁成分、BCG衍 生的脂阿拉伯甘露聚糖或BCG成分，自大肠杆菌衍生的脂多糖(LPS)、或灭活的革兰氏阳性 或革兰氏阴性微生物、咪唑喹啉化合物，优选咪唑喹啉-4-胺化合物，特别是4-氨基-2-乙 氧基甲基-χ-二甲基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇或1-(2-甲基丙基)-IH-咪唑[4， 5-c]喹啉-4-胺，或其衍生物，合成的双链多核糖核苷酸，优选多聚I:C、天然的双链RNA或 RNA病毒或RNA片段、或合成的类似物、或包含未甲基化的CpG基序的合成的或天然的核酸 分子、细胞因子组合，优选肿瘤坏死因子α (TNF- α )、IL-U IL_6或前列腺素E6、⑶40L，优 选重组⑶40L或包含⑶40L域的融合蛋白，或遗传工程化改造成表达⑶40L的原代细胞或 细胞系，或在生理学上上调⑶40L表达的活化T淋巴细胞诸如T淋巴细胞。
4.依照权利要求1至3任一项的制剂，其特征在于在所述操作步骤b)前，使所述未成 熟的树突细胞与所述至少一种树突细胞成熟剂接触至少2小时，优选至少4小时，更优选至 少6小时，特别是至少12小时，最多24小时，以便给出部分成熟的树突细胞。
5.依照权利要求1至4任一项的制剂，其特征在于所述未成熟的或所述部分成熟的树 突细胞加载有至少一种抗原。
6.依照权利要求5的制剂，其特征在于所述至少一种抗原选自下组a)肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、或任何其它人微生物或寄生物病原体；或b)引起变态反应的环境抗原、启动的免疫应答所针对的且引起疾病的自身抗原、或移 植抗原。
7.用于生成树突细胞的方法，包括下列步骤a)提供未成熟的树突细胞，b)使所述未成熟的树突细胞与至少一种树突细胞成熟剂接触来生成部分成熟的树突 细胞(半成熟的DC，smDC)，如以其分泌IL-12的能力所定义的，并c)操作步骤b)的释放IL-12的所述部分成熟的树突细胞(半成熟的DC，smDC)，以便(i)过表达能够使以连续的IL-12分泌表征的所述树突细胞的T淋巴细胞刺激能力维持至少24小时，优选至少48小时，且选自⑶40L的至少一种免疫分子，其通过导入编码所 述至少一种分子的核酸分子来实现；和/或( )抑制或阻止在暴露于初级成熟剂诸如LPS/IFN-γ的所述树突细胞内起作用或自 暴露于初级成熟剂诸如LPS/IFN- γ的树突细胞释放，并且选自白介素10 (IL-10)和吲哚胺 2，3_加双氧酶(IDO)的至少一种T-淋巴细胞抑制分子，诸如表3、4和/或5中给出的至少 一种基因的表达，其如下实现，即敲除表达所述至少一种T-淋巴细胞抑制分子的基因或其 片段或导入用以抑制或阻止在所述树突细胞内有活性或从所述树突细胞投递至T细胞的 至少一种T-淋巴细胞抑制分子的表达的核酸分子，优选核糖核酸分子。
8.依照权利要求7的方法，其特征在于所述未成熟树突细胞的前体或所述未成熟的树 突细胞或部分成熟的树突细胞获自皮肤、脾、骨髓、胸腺、淋巴结、脐带血、或外周血。
9.依照权利要求7或8的方法，其特征在于所述至少一种树突细胞成熟剂选自下组 TLR激动剂诸如热灭活的或经福尔马林处理的卡介苗(BCG)，优选BCG的细胞壁成分、BCG衍 生的脂阿拉伯甘露聚糖或BCG成分，自大肠杆菌衍生的脂多糖(LPS)、或灭活的革兰氏阳性 或革兰氏阴性微生物、咪唑喹啉化合物，优选咪唑喹啉-4-胺化合物，特别是4-氨基-2-乙 氧基甲基-χ-二甲基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇或1-(2-甲基丙基)-IH-咪唑[4， 5-c]喹啉-4-胺，或其衍生物，合成的双链多核糖核苷酸，优选多聚I:C、天然的双链RNA或 RNA病毒或RNA片段、或合成的类似物、或包含未甲基化的CpG基序的合成的或天然的核酸 分子、细胞因子组合，优选肿瘤坏死因子α (TNFa)UL-UIL-B或前列腺素Ε6、⑶40L，优选 重组⑶40L或包含⑶40L域的融合蛋白，或遗传工程化改造成表达⑶40L的原代细胞或细 胞系，或在生理学上上调⑶40L表达的活化T淋巴细胞诸如T淋巴细胞。
10.依照权利要求7至9任一项的方法，其特征在于在所述操作步骤C)前，使所述未成 熟的树突细胞与所述至少一种树突细胞成熟剂接触至少2小时，优选至少4小时，更优选至 少6小时，特别是至少12小时，最多24小时。
11.依照权利要求7至10任一项的方法，其特征在于所述未成熟的或所述部分成熟的 树突细胞加载有至少一种抗原。
12.依照权利要求11的方法，其特征在于所述至少一种抗原选自下组a)肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、或任何其它人微生物或寄生物病原体；或b)引起变态反应的环境抗原、启动的免疫应答所针对的且引起疾病的自身抗原、或移 植抗原。
13.通过依照权利要求7至12任一项的方法可获得的树突细胞。
14.包含依照权利要求13的树突细胞的药物组合物。
15.依照权利要求13的树突细胞或依照权利要求1至6任一项的制剂用于制备药物的 用途，所述药物用于治疗和/或预防癌症和/或微生物或寄生物感染；或用于治疗和/或预 防变态反应、自身免疫性疾病、或干细胞或器官移植排斥。
16.依照权利要求15的用途，其特征在于在放射疗法和/或抗肿瘤或抗微生物化学疗 法、或目的在于治疗变态反应、自身免疫性疾病、或干细胞或器官移植排斥的任何疗法前、 同时、或之后对个体施用所述药物。
17.依照权利要求13的树突细胞或依照权利要求1至6任一项的制剂用于制备药物的 用途，所述药物用于治疗和/或预防由免疫系统针对环境抗原诸如变应原，或针对自身免 疫性疾病过程中的自身抗原的病理学反应过度引起的免疫学疾病。
18.依照权利要求17的用途，其特征在于在目的在于治疗或预防变态反应或自身免疫 性疾病的其它药征前、同时、或之后对个体施用所述药物。
19.依照权利要求13的树突细胞或依照权利要求1至6任一项的制剂用于制备药物的 用途，所述药物用于治疗和/或预防异基因干细胞移植(优选在治疗血液学恶性肿瘤中使 用)的免疫学排斥，或者用于治疗和/或预防异基因器官移植的排斥。
20.依照权利要求19的用途，其特征在于在目的在于治疗或预防所述异基因干细胞或 器官移植排斥的其它药征前、同时、或之后对个体施用所述药物。
全文摘要
本发明涉及一种用于生成树突细胞的方法及其在药物中的用途，这通过目的在于在功能上改善其在治疗癌症、微生物感染、变态反应、自身免疫性疾病或器官和干细胞移植排斥中的治疗功效的遗传工程来实现。
文档编号C12N5/0784GK101896601SQ200880120431
公开日2010年11月24日 申请日期2008年12月12日 优先权日2007年12月12日
发明者亚历山大·M·多纳尔, 托马斯·菲尔兹曼 申请人:特里梅德生物有限责任公司