专利名称：乌贼精氨酸激酶基因及其原核表达载体和工程菌的制作方法
乌贼精氨酸激酶基因及其原核表达载体和工程菌技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及到一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶-精氨酸激酶(Arginine Kinase, AK)及其原核表达载体。
背景技术：
精氨酸激酶属于磷酸原激酶家族中的重要一员，广泛的存在于无脊椎动物如昆虫、奸、蟹及软体动物中,起着类似于脊椎动物中肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)的作用， 是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。磷酸原激酶家族可逆催化肌酸或精氨酸与ATP之间的转磷酰基反应，形成高磷酸化的肌酸或磷酸精氨酸。高能磷酸原在能量储备方面起关键作用，因为当需要ATP再生时，可以在磷酸原激酶的催化下由磷酸原转化而来。磷酸原不仅是一个能量储备库，而且在不断耗能的体系中它是一个能量传送体。近年来，磷酸原激酶的抑制作用研究越来越受到关注，不同来源的磷酸原激酶家族成员因其在能量代谢中的重要地位而成为研究酶抑制作用的靶目标。例如，针对有害昆虫体内AK进行有效抑制剂的筛选，可以为开发环境友好的杀虫剂提供新的方向。
虽然磷酸原激酶家族(包括CK和AK)在功能上有很多相似之处，但CK和AK在催化机制上有很大的差异。肌酸激酶是脊椎动物中唯一的磷酸原激酶，而精氨酸激酶是节肢动物和软体动物中的唯一磷酸原激酶。CK通常存在于动物的骨骼肌、心肌以及脑部等组织的细胞浆和线粒体中。它不仅在脊椎动物能量代谢中起了重要作用，而且还参与了脊椎动物生命过程中的其他的一些生理活动肌浆内质网和细胞表面的离子跨膜运输，巨噬细胞的吞噬作用，糖酵解的调控，脑神经突触中依赖ATP的神经递质的释放，非肌肉细胞中有丝分裂的供能等。除此之外，CK在临床诊断上也具有十分重要的意义。Wyss等已发现CK系统的调控紊乱与一系列的疾病相关，在肌肉、脑、心脏和肾脏相关疾病以及癌症的发生过程中均发现了 CK系统的紊乱。当肌肉萎缩和心肌梗塞等病变发生时，人血清中CK水平迅速升高，目前认为CK的活性测定在心肌梗塞的诊断中比做心电图更为可靠。CK重要的生理功能和临床应用价值引起了人们的广泛重视和深入研究。
相对于CK，目前对AK的研究还比较少。作为磷酸家族中的重要一员，AK在无脊椎动物的细胞能量代谢中起重要的作用，其广泛分布于各种需能组织中。因此对该基因的克隆与原核表达，可以直接应用于研究该酶的结构及功能，并为其在其它方面的应用奠定基础。发明内容
本发明的任务是提供一种乌贼精氨酸激酶基因及其原核表达载体和工程菌。
实现本发明任务的方案是
本发明提供的 乌贼精氨酸激酶基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示， 该精氨酸激酶基因编码的精氨酸激酶蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。
本发明还提供了含有上述精氨酸激酶基因的原核表达载体，所述的原核表达载体是含有组氨酸标签(His标签)的原核表达载体pET30a，精氨酸激酶基因位于pET30a之T7 启动子的下游。
本发明还提供了表达上述精氨酸激酶的工程菌，它是将以上所述的重组表达载体导入到宿主菌后得到的重组菌，所述的宿主菌可以是肠杆菌BL21菌株。
本发明提供的精氨酸激酶(AK)基因来源于曼氏无针乌贼(sepiella maindroni)。本发明提供了表达乌贼AK基因的原核表达载体pET30a_AK，该载体含有AK基因，AK基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG 诱导的操作子序列，AK基因的N端和C端均带有6XHis标签。
本发明实验资料
AK全长基因的克隆
(I)AK基因3’端和5’端序列的获得
对Genbank中的一段乌贼EST序列(GT618444.1)进行生物信息学分析，结果表明该序列与其他无脊椎动物的精氨酸激酶基因同源性较高，属于磷酸原激酶家族成员，因此命名为AK。根据该序列设计扩增所需的特异引物。其中
AK-Fl 5/ -GCGGTGTTGGTATCTATGCTTG-3'和
AK-F2 5/ -ATGGCTTCCCTCCAGTCCTCAC-3'用来扩增 AK 基因的 3'端；
AK-Rl 5/ -GTCTTGTCCTGGTTGAAGTAAAT-3'和
AK-R2 5/ -ATTGTCCACTCAGTTCACCCTC-3'用来扩增 AK 基因的 5'端。提取乌贼肝脏的总RNA，并以该RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后，使用上述引物和半巢氏 PCR技术分别扩增AK基因的3'和5'端序列。扩增产物分别经I %琼脂糖凝胶检测及回收后连入PMDlS-Tsimple，转入大肠杆菌中，鉴定出阳性克隆并测序，从而分离出该基因的端和:V端序列并拼接出其全长序列。
(2) AK基因ORF序列的获得
根据拼接的AK全长序列设计两对引物
AK-F3 5/ -AGACGAACAGCTACGCCATGTC-3'；
AK-R3 5/ -AGCAGAGTGACGCCAGTGAG-3'；
AK-F4 5/ -CGGGATCCATGTCTGACGCCGATGAACTC-3;
(划线处为BamHI酶切位点)；
AK-R4 5/ -CCCAAGCTTGGCAGACTTCTCCAAACGGATG-3;
(划线处为HindIII酶切位点)。
以乌贼的cDNA为模板，然后进行巢氏PCR扩增AK基因开放阅读框序列，经1%琼脂糖凝胶检测，胶回收，并将其连接到PMD18-T simple，转入 大肠杆菌中。获得的阳性克隆经PCR、酶切鉴定和测序。最终获得该基因的开放阅读框，并构建到pMD18-T simple载体中。全长1050bp，编码349个氨基酸。
1、AK基因原核表达载体的构建
分别提取连在pMD18-T simple载体上的AK基因质粒和pET30a空载体的质粒，使用BamHI和HindIII对这两种质粒进行双酶切，分别获得5^和:V末端分别带有BamHI和 HindIII酶切位点的AK基因和pET30a空载体，琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收，然后16°C 连接16h后转化，再经菌落PCR、酶切和测序鉴定后，最终获得原核表达载体pET30a-AK。
2、AK基因原核表达、纯化及酶活的鉴定
原核表达载体pET32a_AK用热刺激法导入大肠杆菌蛋白表达专用受体菌株BL21 中，获得阳性转化子菌落。然后用IPTG进行诱导表达AK重组蛋白，并对其表达时间、IPTG 浓度和温度条件进行优化，确定重组蛋白的最优表达条件，同时并对其进行了酶活及其反应条件的初步鉴定。实验结果显示该蛋白的最优表达条件为ImM IPTG于37°C诱导4h，酶活的最适反应温度和PH值分别为30°C与8. 3。
本发明的技术优点及效果本发明中克隆的AK基因是在头足类动物乌贼中首次扩增得到的，并对其进行了原核表达和蛋白纯化，获得了 AK的重组蛋白。这不仅将解决目前因缺乏该蛋白而无法在体外研究其分子结构和功能的问题，并为在体外研究无脊椎动物体内的能量代谢、储存和利用奠定了基础；而且该纯化的蛋白还可以直接用作抗原来生产抗体。AK蛋白特异性抗体是检测无脊椎动物中AK蛋白表达水平的有效工具。目前尚未有头足类动物乌贼AK基因原核表达及制备AK抗体的报道。
图1为本发明中乌贼总RNA的电泳检测示意图。
图2为本发明用5' RACE获得的AK基因的5'端PCR产物的1%琼脂糖电泳图 (A)和用3' RACE获得的AK基因的3'端PCR产物的I %琼脂糖电泳图(B)，其中M是DNA Marker II ; I是AK基因相应片段的PCR产物。
图3为本发明中AK基因全长开放阅读框PCR产物的1%琼脂糖电泳图(电泳条带1-5)。
图4为本发明中AK蛋白与其它同源AK蛋白的系统发育分析图。
图5为本发明中pET30a_AK双酶切鉴定结果(电泳条带1_4)。
图6重组质粒pET30a_AK结构示意图。
图7是本发明BL21的菌液PCR检测电泳图。其中M是DNA Marker III，1-13为挑取的单菌落菌液PCR的结果，14为空白对照，15-16为阳性质粒对照。
图8粗提和纯化后AK蛋白SDS-PAGE分离结果。其中1:蛋白质marker_MP204，2-3转 pET-30a 的 BL21 (37 °C，ImM IPTG 诱导 4h)，4-5 :转 pET30a_AK 的 BL21 (37 °C，ImM IPTG 诱导 4h)，6 -M pET30a-AK 的 BL21 (37°C，ImM IPTG 诱导 4h)全蛋白经 N1-NTA 纯化树脂层析和透析后的目标条带。
图9不同温度(a)和不同pH(b)对精氨酸激酶酶活的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
本实施例中采用的试剂主要为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP等，各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯，仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。
所用引物序列均在上海生工合成，本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1 :曼氏无针乌贼RNA的提取与检测
乌贼总RNA的提取使用TRIzoL Reagent (RNA提取试剂，Invitrogen)试剂,对说明书方法稍做修改后进行。取乌贼肝脏O. lg，加入Iml的TRIzoLRNA提取液，混匀室温静置 5min,加入O. 2ml氯仿,振荡混勻，4°C, 12000rpm/min离心15min。转移上清液,加入O. 5ml 异丙醇，混勻室温放置IOmin后12000rpm/min离心lOmin。弃上清,75%的乙醇Iml清洗沉淀两次，4°C，7500rpm/min离心5min，干燥后用20 μ I焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解 RNA。取Iul RNA用1. 2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果(见图1)说明提取到的RNA质量符合要求。
实施例2乌贼cDNA第一条链的合成
以乌贼总RNA 为模板，使用 RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase Kit (反转录试剂盒，Fermentas)进行 cDNA 的合成。取植物总 RNA O. 1-0. 5 μ g, Oligo (dT) 50ng, oligo (dT) I μ 1，用DEPC处理水补足至12 μ 1，混匀后，短暂离心将其收集于管底，置于65°C 水浴锅中水浴5min，然后迅速在冰上冷却，再加入反应混合物8μ I (5 X Reaction Buffer 4 μ I, IOmM dNTP 2 μ I, RNA 酶抑制剂 I μ I, RevertAid M-MuLV Reverse TranscriptaseIμ I)，混匀，短暂离心将其收集于管底，42°C保温60min，然后70°C保温5min以终止反应，-70°C保存备用。
实施例3AK cDNA全长序列的克隆
首先对Genbank中的一段乌贼EST序列(GT618444.1)进行生物信息学分析， 结果表明该序列与其他无脊椎动物的AK基因同源性较高，但是位于AK序列的中间， 因此我们根据该中间序列设计了扩增其3'与5,端序列所需的两对特异引物。其中 AK-Fl 5 '
权利要求
1.一种来源于曼氏无针乌贼(sepiella maindroni)的精氨酸激酶基因,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。
2.由权利要求1所述的精氨酸激酶基因编码的精氨酸激酶蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。
3.—种重组表达载体，其特征在于，它是含有权利要求1所述的精氨酸激酶基因的原核表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的原核表达载体是含有组氨酸标签(His标签)的原核表达载体pET30a，精氨酸激酶基因位于pET30a之T7启动子的下游。
5.一种表达精氨酸激酶的工程菌，其特征在于，它是将权利要求3或4所述的重组表达载体导入到宿主菌后得到的重组菌。
6.根据权利要求5所述的表达精氨酸激酶的工程菌，其特征在于，所述的宿主菌是肠杆菌BL21菌株。
全文摘要
本发明公开了一种乌贼精氨酸激酶基因及其原核表达载体pET30a-AK，具体涉及到一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶——精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)及其原核表达载体。本发明是利用RACE PCR技术从乌贼肝脏中克隆了AK基因的全长cDNA，然后将其蛋白编码序列克隆到原核表达载体pET30a-AK上，并在大肠杆菌表达菌株BL21中进行了表达与纯化。分离得到的重组蛋白，不仅可作为抗原用于AK抗体的制备，并对研究无脊椎动物体内的能量代谢调节规律具有重大价值。
文档编号C12N15/70GK103060345SQ201210559059
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者何光源, 陈利红, 张扬, 李肖, 杨广笑, 汪越胜, 王敏, 吴常文 申请人:华中科技大学