专利名称：一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法。
背景技术：
诸多研究表明干细胞不仅可以自我更新，在条件合适的情况下能分化成其他功能细胞，因此干细胞有望成为治疗人类疑难疾病的有效手段。然而，干细胞在正常成体组织中含量甚微，在体外如何快速扩增与培养干细胞培养是研究干细胞的作用机制及探索其在治疗人类疾病治疗方法的重要技术。干细胞尽量含量甚微，但广泛分布于哺乳动物的各个组织器官，这些组织或器官包括但不局限于骨髓、脐带、脂肪组织、脑组织、视网膜、心脏、肝脏、肺以及皮肤等。大量研究表明，这些低含量的干细胞可在体外通过适当的方法进行进一步扩增，最常规的一种培养干细胞的培养基就是添加有胎牛血 清的培养基。然而，采用这种培养基培养的干细胞，不仅生长比较缓慢，而且传递次数超过5代之后其分化成功能细胞的潜能大大降低，牛血清批次存在潜在的不重复性也大大影响了其规模化；另一方面，牛血清相对于人是异源性的东西，从而限制了其在临床上的应用。因此，探索快速扩增干细胞而又不影响其潜能的培养条件及其培养基组成的优化组合是非常重要的研究内容。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法，旨在解决采用现有添加有牛血清的培养基培养干细胞存在生长缓慢且细胞潜能会传代次数的增加而大大降低的问题。本发明的技术方案如下
一种干细胞培养基，其中，所述干细胞培养基中不含血清，所述干细胞培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、细胞因子和蛋白多肽；
其中，所述氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及谷氨酰胺；
所述细胞因子和蛋白多肽包括成纤维细胞生长因子1、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素、胰岛素样生长因子1、血管内皮细胞生长因子、胎盘生长因子、白血病抑制因子、干细胞因子、转铁蛋白和人血清白蛋白；
所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫氨、辅酶Q10、维生素B12、腐胺二盐酸盐、维生素C和维生素E ；
所述脂类包括地塞米松、油酸、胆固醇、乙醇胺、亚油酸、硫辛酸和脂质混合物；
所述盐类包括碳酸氢钠、氯化钙、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠、一水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和丙酮酸钠；所述干细胞培养基还包括抗氧化剂、D-葡萄糖、牛磺酸、肝素钠。所述的干细胞培养基，其中，所述干细胞培养基以I升计算，包括以下组分 丙氨酸O. ΟΓΟ. 25mM
精氨酸O. ΓΙΟ mM
天冬酰胺 O. 11 2. 75 mM 天冬氨酸 O. 03 O. 75 mM 半胱氨酸 O. 03 O. 75 mM 谷氨酸O. 03 O. 75 mM
甘氨酸O. 05 1. 25 mM
组氨酸O. 03 O. 75 mM
异亮氨酸 O. 5 12. 5 mM 亮氨酸O. 24 6 mM
赖氨酸O. 2^5 mM
甲硫氨酸 O. 12^3 mM 苯丙氨酸 O. 2Γ5. 25 mM 脯氨酸O. 004^0.1 mM
丝氛酸O. 15 3. 5 mM
苏氛酸O. 06 1. 5 mM
色氨酸O. 02 O. 5 mM
酪氨酸O. 03 O. 75 mM
缬氨酸O. 28 7 mM
谷氨酰胺 O. 8 20 mM 表皮生长因子1-10 mg/L
纤维细胞生长因子I1-10 mg/L
纤维细胞生长因子21-10 mg/L
胰岛素样生长因子I1-10 mg/L
白细胞因子1-10 mg/L
血小板衍生生长因子1_10 mg/L
胎盘生长因子1-10 mg/L
干细胞因子1-10 mg/L
血管内皮细胞生长因子 1-10 mg/L 胰岛素I 25 mg/L
转铁蛋白4"100 mg/L
人血清白蛋白 0.02、. 5 g/L 生物素6 150mM
氯化胆碱12 300mM
叶酸1. 2 30mM
辅酶 QlOO. 2"5mM
地塞米松2 50 nMD-泛酸钠I 25mM
肌醇14 350mM
烟酰胺ΓI OOmM
吡哆醇盐酸盐O. 03、. 75mM
核黄素0.11 2.75mM
盐酸硫氨O. 11 2. 75mM
维生素 B12O. Γ2. 5mM
腐胺二盐酸盐O. Γ2. 5mM
维生素C2 50 mg/L
维生素EO. 05 L 25 mg/L
肝素钠0.08 2 g/L
D-葡萄糖3. 6 90 mM 还原性谷胱甘肽 O. 0002、· 005 mg/L
牛磺酸O. 00144 O. 36 g/L
β-巯基乙醇O. 01 O. 25mg/L
酚红1. 62 40. 5 mg/L
油酸O. 5 12. 5 mg/L
亚油酸O. 5 7. 5 mg/L
硫辛酸O. 02^0. 5 mg/L
脂质混合物O. 2^5 ml/L
胆固醇I 25 mg/L
乙醇胺12 300ml/L
碳酸氢钠2. 32 58 mM
氯化钙O. 0168 O. 42 mM
氯化钾O. 832 20. 8 mM
氯化镁O. 06 1. 5 mM
硫酸镁O. 0814^2. 035 mM
氯化钠24. 122 603. 55 mM
磷酸二氢钠O. 0906 2. 265 mM
磷酸氢二钠O. Γ2. 5 mM
丙酮酸钠O. Γ2. 5 mM。所述的干细胞培养基，其中，所述干细胞培养基以I升计算，包括以下组分
丙氨酸O. 05 mM
精氨酸2. 00 mM
天冬酰胺O. 55 mM
天冬氨酸O. 4 mM
半胱氨酸O. 15 mM
谷氨酸O. 15 mM
甘氨酸O. 25 mM组氨酸O. 15 mM
异亮氨酸2. 50 mM
亮氨酸1. 20 mM
赖氨酸1. 00 mM
甲硫氨酸O. 60 mM
苯丙氨酸1. 05 mM
脯氨酸O. 02 mM
丝氨酸O. 70 mM
苏氨酸O. 30 mM
色氨酸O. 10 mM
酪氨酸O. 15 mM
缬氨酸1. 4 mM
谷氨酰胺4 mM表皮生长因子1-10 mg/L
纤维细胞生长因子I1-10 mg/L
纤维细胞生长因子21-10 mg/L
胰岛素样生长因子I1-10 mg/L
白细胞因子1-10 mg/L血小板衍生生长因子 1_10 mg/L
胎盘生长因子1-10 mg/L
干细胞因子1-10 mg/L血管内皮细胞生长因子1-10 mg/L
胰岛素5 mg/L
转铁蛋白20 mg/L
人血清白蛋白O.1 g/L
生物素30 mM
氯化胆碱60 mM
叶酸6 mM
辅酶QlOI mM
地塞米松10 nM
D-泛酸钠5 mM
肌醇70 mM
烟酰胺20 mM
吡哆醇盐酸盐O. 15 mM
核黄素O. 55 mM
盐酸硫氨O. 55 mM
维生素B12O. 5 mM
腐胺二盐酸盐O. 5 mM
维生素C10 mg/L维生素EO. 25 mg/L
肝素钠0.4g/L
D-葡萄糖18 mM
还原性谷胱甘肽0.001 mg/L
牛磺酸0.0072 g/L
巯基乙醇0.05 mg/L
酌■红8. lmg/L
油酸2. 50 mg/L
亚油酸1. 5 mg/L
硫辛酸O.1 mg/L
脂质混合物I ml/L
胆固醇5 mg/L
乙醇胺60 ml/L
碳酸氢钠11. 6 mM
氯化钙O. 084 mM
氯化钾4. 16 mM
氯化镁O. 3 mM
硫酸镁O. 407 mM
氯化钠120.61 mM
一水磷酸二氢钠O. 453 mM 磷酸氢二钠O. 5 mM
丙酮酸钠O. 5 mM。一种如上所述的干细胞培养基的应用，其中，将所述干细胞培养基用于培养干细胞。所述的干细胞培养基的应用，其中，所述干细胞包括但不局限于人与哺乳动物来源的干细胞。所述的干细胞培养基的应用，其中，所述干细胞从各种组织或器官里分离得到；所述组织与器官包括但不局限于骨髓、脐带、脂肪组织、脑组织、视网膜、心脏、肝脏、肺以及皮肤。一种采用如上所述的干细胞培养基的培养干细胞的方法，其中，在进行培养干细胞前将用于促使干细胞贴壁的材料包被培养皿，依次所述加入所述干细胞培养基和干细胞。所述的培养干细胞的方法，其中，所述用于促使干细胞贴壁的材料为胶原蛋白、明胶、多聚赖氨酸、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、玻表粘连蛋白的一种或多种混合物。有益效果本发明所提供的干细胞培养基，不含血清，适合于快速培养人及哺乳动物组织来源的干细胞，包括但不局限于脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血干细胞。该培养基能让细胞的扩增速度提高3-5倍，但又不影响其分化的潜能。采用该干细胞培养基与普通培养基相比，不仅能更快速扩增不同来源的干细胞，延长了传代次数，而且又能很好的保持干细胞的潜能性。
图1a为本发明实施例1中采用本发明干细胞培养基与常规培养基培养ADSC的干细胞扩增速度的检测结果示意图。图1b为本发明实施例1中采用本发明干细胞培养基与常规培养基培养BMSC的干细胞扩增速度的检测结果示意图。图1c为本发明实施例1中采用本发明干细胞培养基与常规培养基培养UMBSC的干细胞扩增速度的检测结果示意图。图2为本发明实施例2中经过本发明干细胞培养基与常规培养基培养的ADSC、BMSC和UMBSC体外分化成软骨细胞潜能的检测结果示意图。图3为本发明实施例3中经过本发明干细胞培养基与常规培养基培养的ADSC、BMSC和UMBSC体外分化成脂肪细胞潜能的检测结果示意图。图4为本发明实施例4中经过本发明干细胞培养基与常规培养基培养的ADSC、BMSC和UMBSC体外分化成神经细胞潜能的检测结果示意图。图5为本发明实施例5中经过本发明干细胞培养基与常规培养基培养的ADSC、BMSC和UMBSC体外分化成视网膜上皮细胞潜能的检测结果示意图。图6为本发明实施例6中经过本发明干细胞培养基培养的ADSC、BMSC和UMBSC移植之后对感光细胞退行性视网膜模型的保护作用的检测结果示意图。
具体实施例方式本发明提供一种 干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明所提供的干细胞培养基中不含血清，其配方涉及到添加氨基酸、维生素、盐类、脂类、细胞因子和蛋白多肽，细胞培养方法涉及到促进细胞贴壁材料的使用。该方法与普通培养基相比，不仅能更快速扩增不同来源的干细胞，延长了传代次数，而且又能很好的保持干细胞的潜能性。所述干细胞培养基适合用于快速培养人及哺乳动物组织来源的干细胞，包括但不局限于脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血干细胞。具体地，所述干细胞培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、细胞因子和蛋白多肽；
其中，所述氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及谷氨酰胺；
所述细胞因子和蛋白多肽包括成纤维细胞生长因子I (FGF1)、成纤维细胞生长因子2 (FGF2)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素(insulin)、胰岛素样生长因子I (IGF1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PGF)、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、转铁蛋白(transferrin)和人血清白蛋白(HSA)；
所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫氨、辅酶Q10、维生素B12、腐胺二盐酸盐、维生素C和维生素E ；所述脂类包括地塞米松、油酸、胆固醇、乙醇胺、亚油酸、硫辛酸和脂质混合物(Lipidmixture) (Sigma,L5416)；
所述微量元素包括绿化钴、亚硒酸钠、氯化镍、氯化锰、乙二胺四乙酸钠盐、七钥酸铵、氯化铝、硫酸铬钾、硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁或硫酸锌；
其他小分子物质包括抗氧化剂(b-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽)、D-葡萄糖、牛磺酸、肝素钠。进一步地，所述干细胞培养基以I升计算，包括以下组分
权利要求
1.一种干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基中不含血清，所述干细胞培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、细胞因子和蛋白多肽； 其中，所述氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及谷氨酰胺； 所述细胞因子和蛋白多肽包括成纤维细胞生长因子1、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素、胰岛素样生长因子1、血管内皮细胞生长因子、胎盘生长因子、白血病抑制因子、干细胞因子、转铁蛋白和人血清白蛋白； 所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫氨、辅酶Q10、维生素B12、腐胺二盐酸盐、维生素C和维生素E ； 所述脂类包括地塞米松、油酸、胆固醇、乙醇胺、亚油酸、硫辛酸和脂质混合物； 所述盐类包括碳酸氢钠、氯化钙、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠、一水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和丙酮酸钠； 所述干细胞培养基还包括抗氧化剂、D-葡萄糖、牛磺酸、肝素钠。
2.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基以I升计算，包括以下组分 丙氨酸O. ΟΓΟ. 25mM 精氨酸O. ΓΙΟ mM 天冬酰胺 O. 11 2. 75 mM 天冬氨酸 O. 03 O. 75 mM 半胱氨酸 O. 03 O. 75 mM 谷氨酸O. 03 O. 75 mM 甘氨酸O. 05 1. 25 mM 组氨酸O. 03 O. 75 mM 异亮氨酸 O. 5 12. 5 mM 亮氨酸O. 24 6 mM 赖氨酸O. 2^5 mM 甲硫氨酸 O. 12^3 mM 苯丙氨酸 O. 2Γ5. 25 mM 脯氨酸O. 004^0.1 mM 丝氛酸O. 15 3. 5 mM 苏氛酸O. 06 1. 5 mM 色氨酸O. 02 O. 5 mM 酪氨酸O. 03 O. 75 mM 缬氨酸O. 28 7 mM 谷氨酰胺 O. 8 20 mM 表皮生长因子1-10 mg/L 纤维细胞生长因子I1-10 mg/L 纤维细胞生长因子21-10 mg/L胰岛素样生长因子I1-10 mg/L白细胞因子1-10 mg/L血小板衍生生长因子1_10 mg/L胎盘生长因子1-10 mg/L干细胞因子1-10 mg/L血管内皮细胞生长因子1-10 mg/L胰岛素I 25 mg/L转铁蛋白4"100 mg/L人血清白蛋白0.02、. 5 g/L生物素6 150mM氯化胆碱12 300mM叶酸1. 2 30mM辅酶 QlOO. 2"5mM地塞米松2 50 nMD-泛酸钠I 25mM肌醇14 350mM烟酰胺ΓI OOmM吡哆醇盐酸盐O. 03、. 75mM核黄素0.11 2.75mM盐酸硫氨O. 11 2. 75mM维生素 B12O. Γ2. 5mM腐胺二盐酸盐O. Γ2. 5mM维生素C2 50 mg/L维生素EO. 05 L 25 mg/L肝素钠0.08 2 g/LD-葡萄糖3. 6 90 mM还原性谷胱甘肽 O. 0002、· 005 mg/L牛磺酸O. 00144 O. 36 g/Lβ-巯基乙醇O. 01 O. 25mg/L酚红1. 62 40. 5 mg/L油酸O. 5 12. 5 mg/L`亚油酸O. 5 7. 5 mg/L硫辛酸O. 02^0. 5 mg/L脂质混合物O. 2^5 ml/L胆固醇I 25 mg/L乙醇胺12 300ml/L碳酸氢钠2. 32 58 mM氯化钙O. 0168 O. 42 mM氯化钾O. 832 20. 8 mM氯化镁O. 06 1. 5 mM 硫酸镁O. 0814^2. 035 mM 氯化钠24. 122 603. 55 mM 一水磷酸二氢钠 O. 0906 2. 265 mM 磷酸氢二钠 O. Γ2. 5 mM 丙酮酸钠O. Γ2. 5 mM。
3.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基以I升计算，包括以下组分 丙氨酸O. 05 mM 精氨酸2. 00 mM 天冬酰胺 O. 55 mM 天冬氨酸 O. 4 mM 半胱氨酸 O. 15 mM 谷氨酸O. 15 mM 甘氨酸O. 25 mM 组氨酸O. 15 mM 异亮氨酸 2. 50 mM 亮氨酸1. 20 mM 赖氨酸1. 00 mM 甲硫氨酸 O. 60 mM 苯丙氨酸1. 05 mM 脯氨酸O. 02 mM 丝氨酸O. 70 mM 苏氨酸O. 30 mM 色氨酸O. 10 mM 酪氨酸O. 15 mM 缬氨酸1. 4 mM 谷氨酰胺 4 mM 表皮生长因子1-10 mg/L 纤维细胞生长因子I 1-10 mg/L 纤维细胞生长因子2 1-10 mg/L 胰岛素样生长因子I 1-10 mg/L 白细胞因子1-10 mg/L 血小板衍生生长因子 1_10 mg/L 胎盘生长因子1-10 mg/L 干细胞因子1-10 mg/L 血管内皮细胞生长因子1-10 mg/L 胰岛素5 mg/L 转铁蛋白20 mg/L人血清白蛋白O.1 g/L 生物素30 mM 氯化胆碱60 mM 叶酸6 mM 辅酶QlOI mM 地塞米松10 nM D-泛酸钠5 mM 肌醇70 mM 烟酰胺20 mM 吡哆醇盐酸盐O. 15 mM 核黄素O. 55 mM 盐酸硫氨O. 55 mM 维生素B12O. 5 mM 腐胺二盐酸盐O. 5 mM 维生素C10 mg/L 维生素EO. 25 mg/L 肝素钠0.4g/L D-葡萄糖18 mM 还原性谷胱甘肽0.001 mg/L 牛磺酸0.0072 g/L 巯基乙醇0.05 mg/L 酌■红8. lmg/L 油酸2. 50 mg/L 亚油酸1. 5 mg/L 硫辛酸O.1 mg/L 脂质混合物I ml/L 胆固醇5 mg/L 乙醇胺60 ml/L 碳酸氢钠11. 6 mM 氯化钙O. 084 mM 氯化钾4. 16 mM 氯化镁O. 3 mM 硫酸镁O. 407 mM 氯化钠120.61 mM 一水磷酸二氢钠O. 453 mM 磷酸氢二钠O. 5 mM 丙酮酸钠O. 5 mM。
4.一种如权利要求1所述的干细胞培养基的应用，其特征在于，将所述干细胞培养基用于培养干细胞。
5.根据权利要求4所述的干细胞培养基的应用，其特征在于，所述干细胞包括但不局限于人与哺乳动物来源的干细胞。
6.根据权利要求4所述的干细胞培养基的应用，其特征在于，所述干细胞从各种组织或器官里分离得到；所述组织与器官包括但不局限于骨髓、脐带、脂肪组织、脑组织、视网膜、心脏、肝脏、肺以及皮肤。
7.一种采用如权利要求1所述的干细胞培养基的培养干细胞的方法，其特征在于，在进行培养干细胞前将用于促使干细胞贴壁的材料包被培养皿，依次所述加入所述干细胞培养基和干细胞。
8.根据权利要求7所述的培养干细胞的方法，其特征在于，所述用于促使干细胞贴壁的材料为胶原蛋白、明胶、多聚赖氨酸、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、玻表粘连蛋白的一种或多种混合物。
全文摘要
本发明公开一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法，所述干细胞培养基中不含血清，所述干细胞培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、细胞因子和蛋白多肽。所述干细胞培养基适合于快速培养人及哺乳动物组织来源的干细胞，包括但不局限于脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血干细胞。该培养基能让细胞的扩增速度提高3-5倍，但又不影响其分化的潜能。采用该干细胞培养基与普通培养基相比，不仅能更快速扩增不同来源的干细胞，延长了传代次数，而且又能很好的保持干细胞的潜能性。
文档编号C12N5/0789GK103060264SQ20121055794
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者刘小青, 应明, 陈光风, 郑龙坡 申请人:上海市第十人民医院