突变分析的制作方法
【专利摘要】本发明描述了一种用于分析遗传突变、特别是单核苷酸多态性(SNPs)和／或体细胞突变的方法，以及与另一种形式相比优先扩增一种等位基因形式的方法。所述方法使用寡核苷酸探针和扩增引物，其中所述寡核苷酸探针与第一等位基因杂交的解链温度(Tm)低于其与第二等位基因杂交的解链温度，所述扩增引物在所述寡核苷酸探针结合位点侧翼并且以比所述探针与所述第一等位基因的Tm高的Tm与样品结合。扩增反应可以在所述探针优先与第二等位基因杂交的温度进行，由此扩增所述第一等位基因。扩增的序列可以使用与扩增过程中作为阻断探针相同的探针进行检测。
【专利说明】突变分析
发明领域
[0001]本发明涉及一种用于分析遗传突变、特别是单核苷酸多态性(SNPs)和/或体细胞突变的方法。本发明的方面还涉及用于与另一种形式相比优先扩增一种等位基因形式的方法。本发明的另一些方面涉及用于分析遗传突变的核酸探针。
[0002]发明背景
[0003]据信单核苷酸多态性(SNPs)对于个人化的医药具有显著潜在的重要性；可能的是，导致单个氨基酸变化的特定的SNPs可能在患者对特定的治疗方案的响应性方面引起变化。SNPs还可能在癌症和其他同样具有激活特定的癌基因的体细胞突变的癌症和其它细胞增殖性病症的发生中是重要的。
[0004]能够确定患者中存在哪些SNPs是重要的。双链DNA的解链温度(Tm)取决于碱基对杂交的程度；在探针和靶序列存在错配的情形中(例如，由于存在SNP)，那么，与不存在错配时相比，Tm将不同。涉及检测存在SNP时特定寡核苷酸探针与基因靶标之间的DNA杂交的解链温度(Tm)的变化的方法是已知的。然而，体细胞突变存在这样的问题，即，突变序列可能仅存在于特定样品中非常少的拷贝中，野生型序列占优势。能够选择性扩增突变序列，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)类型的技术，将是有用的。
[0005]美国专利5，849，497描述了使用寡核苷酸阻断探针特异性抑制PCR扩增，所述寡核苷酸阻断探针与目的区域杂交，但是其也包含不杂交的3’错配碱基。在PCR过程中，这种错配防止链延伸。据说该方法有效用于防止特定的已知序列的扩增。该专利提示通过设计针对插入的区域的阻断探针防止包含所述插入的序列的等位基因的扩增的方法的应用。然而，该专利没有教导与另一种SNP变化相比选择性扩增一种SNP变化的方法。此外，其必须知晓目的靶序列。
[0006]Bender 等，Biotechniques (生物技术)2007, νο142ηο5, ρρ609~614,描述了在原核生物RT-PCR中使用PNA (肽核酸)阻断探针防止DNA-介导的PCR产物形成。设计该探针与基因组DNA中的区域结合，该区域在由mRNA产生的cDNA中不存在；因此，只有cDNA得到扩增，基因组DNA不被扩增。
[0007]Vestheim 和 Jarman, Frontiers in Zoology (动物学前沿)2008, 5:12,描述了使用阻断引物来防止磷虾DNA序列的PCR扩增并且允许来自磷虾胃内容物样品的猎物DNA的扩增。针对磷虾rDNA序列设计该引物。
[0008]本发明的目的是提供可以从包含变体和野生型序列二者的样品中选择性扩增变体SNP序列的方法。本发明方面的其他目的之一是提供可以分析扩增的序列的SNP含量的方法。
[0009]发明概述
[0010]按照本发明的第一方面，提供一种优先扩增和检测具有至少第一和第二等位基因的基因座的第一等位基因的方法，所述方法包括:
[0011]a)提供反应混合物，所述反应混合物包含:
[0012]i)样品，其包含代表至少待扩增的基因座的核酸；[0013]?)寡核苷酸探针，其与第一等位基因杂交的解链温度(Tm)低于其与第二等位基因杂交的解链温度；
[0014]iii)用于核酸扩增的寡核苷酸引物对，所述引物在寡核苷酸探针结合位点侧翼的第一和第二位点与样品中的核酸杂交；其中所述引物:样品的Tm高于所述探针:第一等位基因的Tm;
[0015]b)将所述反应混合物保持在所述探针:第一等位基因的Tm与所述探针:第二等位基因的Tm之间的温度，以使所述探针优先与所述第二等位基因杂交；
[0016]c)对所述反应混合物进行热循环扩增，所述扩增包括解链阶段，退火阶段，和延伸阶段，其中延伸和退火阶段的温度在所述探针:第一等位基因的Tm与所述探针:第二等位基因的Tm之间，以使在这些阶段过程中所述探针与所述第二等位基因杂交；由此扩增所述第一等位基因；和
[0017]d)在等于或低于所述探针:第一等位基因的Tm的温度检测所述探针与所述样品的杂交；在更高的温度在等于或低于所述探针:第二等位基因的Tm的温度检测所述探针与所述样品的杂交；并且比较二者；由此检测所扩增的第一等位基因。
[0018]因此，本发明允许第一等位基因，例如突变等位基因，较第二等位基因，例如野生型等位基因，被优先扩增。此外，所扩增的序列可以使用与在扩增过程中用作阻断探针(blocking probe)相同的探针检测。这显著简化了程序。
[0019]延伸和退火阶段的温度可以相同，但是优选是不同的。解链阶段`的温度可以高于引物:样品的Tm和探针:第二等位基因的Tm的温度。然而，这不是必要的；例如，引物:样品的Tm可以低于探针:第二等位基因的Tm，在这种情形中，解链阶段可以在这两个值之间的温度，以使在整个扩增反应过程中所述探针有效地保持与第二等位基因杂交。
[0020]在延伸阶段中，所述寡核苷酸探针保持与第二等位基因杂交。这防止与相同的核酸杂交的引物的链延伸，而与第一等位基因杂交的引物由于所述探针不与该等位基因杂交而自由进行链延伸。以这种方式，第一等位基因将优先被扩增。如下文所示，在特定的实施方案中，引物中的一种或两种可以与探针结合位点重叠，以使所述探针与所述引物竞争结合；这可以防止引物的结合，并且因此防止链延伸。在其他实施方案中，所述引物与探针不重叠，但是所述引物防止进一步的链延伸。
[0021]基因座可以是多等位基因座；即，可能在所述基因座存在多于两种等位基因。在这样的情形中，一个等位基因可以指定为野生型等位基因，其他等位基因为突变等位基因。优选选择这样的探针，以使探针:野生型等位基因的Tm低于任一探针:突变等位基因的Tm。所述方法可以用于优先扩增存在的突变等位基因中的任一种。当所述方法用于研究体细胞突变时(其中可能具有存在于不同细胞系中的数种不同的突变)，这是特别有益的。在优选的实施方案中，每种可能的探针:等位基因组合的Tm是不同的。优选地，Tm差别至少
0.25°C，更优选至少0.5°C，最优选至少0.75°C。这允许在每种等位基因之间进行精细的区分。例如，如果存在四种等位基因，并且仅有两种要被扩增，那么延伸温度可以设定在适当的水平，以使所述探针与所述等位基因中的另外两种杂交。
[0022]所述探针优选基本上与靶等位基因的一条链互补，更优选完全与靶等位基因的一条链互补。所述探针可以与第二等位基因的一条链完全互补。第一等位基因可以与第二等位基因的序列不同在于一个或多个点突变(单核苷酸多态性，SNPs)。可能的是，第一等位基因包含多于一个SNP，例如，在不同的密码子。所述方法的一个优点在于其可以优先扩增潜在地包括超过一个SNP的突变等位基因。备选地，第一等位基因可以与第二等位基因的序列不同在于一个或多个缺失。
[0023]优选地，所述探针是DNA。
[0024]第一与第二等位基因之间序列的不同优选在探针结合的区域内部；即，在所述探针与第一等位基因之间的任何错配都不在所述探针的末端。
[0025]所述探针长度可以至多10、20、30、40或50个核苷酸。更长或更短的探针也是可以的，尽管可能难以获得不同的等位基因Tm之间的适当的区分或引物与较短探针Tm的适当的区分。
[0026]所述探针可以被标记。例如，探针可以包括荧光或放射性的标记，或者可以用二级探针可以结合的配体来标记。优选地，探针用荧光标记进行标记，并且优选地，根据所述探针已经与靶标链杂交(即，所述探针是双链核酸的一部分)还是没有杂交(所述探针是单链的)，所述标记还产生不同的信号。优选的探针是HyBeacon?探针(参见，例如，Mol Cell Probes (分子细胞探针).20020ct ; 16 (5):319-26,“Ultra-rapid DNA analysisusing HyBeacon Probes and direct PCR amplification from saliva(使用 HyBeacon探针和来自唾液的直接PCR扩增的超快DNA分析)”，French DJ, Archard CL, AndersenMT, McDowell DG)。不同信号的产生允许容易且快速地分析所述探针是否已经与靶标结合。
[0027]检测杂交的探针分子的步骤可以进一步包括定量扩增混合物中第一和第二等位基因的相对量。在本发明的特定实施方案中，检测步骤可以在扩增步骤之前以及之后进行。在优选的实施方案中，第一与第二等位基因的比例可以通过下述测量:将所述反应混合物保持在等于或低于所述探针:第一等位基因的Tm的第一温度；检测杂交的探针分子；将所述反应混合物的温度增加至高于所述探针:第一等位基因的Tm但是等于或低于所述探针:第二等位基因的Tm的第二温度；并且检测所杂交的探针分子。在所述第一较低的温度，探针将与第一和第二等位基因杂交，而在第二较高的温度，探针将仅与第二等位基因杂交。
[0028]当基因座为多等位基因时，那么，检测步骤可能还包括将反应混合物升温至一个或多个中间温度，并且检测在每个中间温度所杂交的探针分子。当每种探针:等位基因组合具有不同的Tm时，这是特别优选的。本发明的这一实施方案允许在单次实验中扩增和定量多种不同的突变等位基因。
[0029]所述引物优选结合在所述探针结合的区域之外的区域；即，第一引物结合探针靶标的3’ -方向，而第二引物结合探针靶标的5’ -方向(应该注意所述引物将与双链体DNA的不同链结合)。当引物进行链延伸时，这被所结合的探针阻断，以使该链不能被扩增。在特定实施方案中，引物可以结合在探针结合的区域附近，或者甚至可以与探针重叠一个、两个、三个或更多个核苷酸，尽管这不是优选的。当然，两条引物可以与探针靶标不同程度的重叠，或者可以是一条引物重叠而另一条引物可以不重叠。当所述探针与所述引物重叠时，那么，所述探针可以与所述引物竞争结合 ，优选在所述引物的3’端，并且以这种方式防止延伸。
[0030]在本发明的优选的实施方案中，扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)。在特定的实施方案中，引物可以以不同浓度提供；优选地，引物中的一种以限速的量提供，并且所述扩增反应是不对称PCR。在不对称PCR中，两条靶DNA链中的一条优先被扩增，原因在于限速引物被用尽，因此仅另一条引物可用于开始链延伸。有义链或反义链可以是被靶向进行优先扩增的那条链；优选地，所述优先扩增的链是与所述探针互补的链。
[0031]靶基因座可以是任意被认为包含多态性(例如，SNPs)的适当的基因座。优选的靶基因座是KRAS、EGFR或BRAF人基因。在优选的实施方案中，靶基因座选自KRAS的密码子12和13，KRAS的密码子61，和KRAS的密码子146。备选地，靶基因座可以是EGFR的外显子18、19、20或21中的任一种或全部。另一个备选方案是BRAF的氨基酸残基600和相对应的核苷酸残基。
[0032]优选的探针序列包括:
[0033]5’AGTTGGAGCTGGTGGCGTAG3’ (HYB_KRAS_CD12 / 13，SEQ ID N01)，其靶向 KRAS 的密码子12和13，
[0034]5’AGGTCAAGAGGAGTACAGTG3’ (HYB_KRAS_CD61, SEQ ID N02)，其靶向 KRAS 的密码子61，
[0035]5’ TGTAGTCGTTTCTGTTCTGT3’ (HYB_KRAS_CD146, SEQ ID N03)，其靶向 KRAS 的密码子 146，
[0036]5’GCTGGGCTCCGGTGCGTTCG3’ (EGFRX18_HYB, SEQ ID N04)，其靶向 EGFR 的外显子18，
[0037]5， CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAA CATCTCCGAAAGCC3，
[0038](EGFRX19HYB_DEL, SEQ ID N05)，其靶向 EGFR 的外显子 19，
[0039]5，CTACCGGTCGCACGGTCGCACCCTGTTGGGGGTGCACAC3’ (EGFRX20_HYB, SEQ ID N06)，其靶向EGFR的外显子20，
[0040]5，TGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCG3，(EGFRX21_HYB, SEQ ID N07)，其靶向 EGFR 的外显子21，
[0041 ] 5 ’ CTACAGTGAAATCTCGATGG3 ’ (BRAF V600，SEQ ID N08)，其靶向 BRAF 的氨基酸 600。
[0042]本发明还提供包括选自SEQ ID NOl至SED ID N08的核苷酸序列或由选自SEQ IDNOl至SED ID N08的核苷酸序列组成的寡核苷酸探针。所述探针优选是DNA。所述探针还可以包含一个或多个与该探针缔合的标记；优选是与所述序列的一个或多个核苷酸缔合的荧光标记。可以选择所述标记从而根据所述探针是以与靶序列形成的双链的双链体存在还是以单链存在而产生差异性的信号。
[0043]还提供引物序列，选择所述引物序列以允许扩增上文提及的SEQ ID NOl至SEQ IDN08的探针识别的靶序列。
[0044]本发明的另一个方面提供用于检测来自受试者的样品中的体细胞突变的方法，所述样品包含来自具有至少第一和第二等位基因的基因座的核酸，所述第一等位基因是突变等位基因，所述第二等位基因是野生型等位基因能，所述方法包括:
[0045]a)提供反应混合物，所述反应混合物包含:
[0046]i)样品；
[0047]ii)寡核苷酸探针，其与第一等位基因杂交的解链温度(Tm)低于其与第二等位基因杂交的解链温度；
[0048]iii)用于核酸扩增的寡核苷酸引物对，所述引物在所述寡核苷酸探针结合位点侧翼的第一和第二位点与样品中的核酸杂交；其中所述引物:样品的Tm高于所述探针:第一等位基因的Tm;
[0049]b)将所述反应混合物保持在所述探针:第一等位基因的Tm与所述探针:第二等位基因的Tm之间的温度，以使所述探针优先与第二等位基因杂交；
[0050]c)对所述反应混合物进行热循环扩增，所述扩增包括解链阶段、退火阶段和延伸阶段，其中所述延伸和退火阶段的温度在所述探针:第一等位基因的Tm与所述探针:第二等位基因的Tm之间，以使所述探针在所述延伸和退火阶段与第二等位基因杂交；由此扩增
第一等位基因；
[0051]d)保持所述反应混合物的温度等于或低于所述探针:突变等位基因的Tm ；
[0052]e)保持所述反应混合物的温度高于步骤d)的温度，但是等于或低于所述探针:野生型等位基因的Tm ;和
[0053]f)检测步骤d)和e)中杂交的探针，由此确定所述样品中存在或不存在所述突变等位基因。
[0054]发明详述
[0055]本发明提供这样一种方法，通过该方法可以优先扩增并检测低拷贝数的突变(例如，体细胞突变)，所述方法使用单个探针，所述探针作用为阻断剂以防止扩增不需要的等位基因，还作用为报道子以报告突变等位基因的存在。此外，所述探针可以用来在单次实验中检测同一基因座中的多种不同的等位基因(例如，备选SNPs (alternate SNPs))。所述方法可以用来检测突变如SNPs以及插入或缺失。
[0056]我们在本文中描述多个实施例，显示所述方法对不同基因座的适用性；然而，清楚的是，所述方法有更通用的适用性。
[0057]对于定义临床样品从而确定靶向治疗的方向，例如，出于个体化医药的目的，存在需求。这要求快速且可靠地筛查体细胞突变。我们在本文中表明所述方法可以应用于基因K-RAS, EGFR和BRAF中的三种关键的体细胞突变。本文所述的方法利用hyBeacon?探针(其根据所述探针是单链的还是双链的而提供差异性的报告信号)和不对称PCR(以优先扩增靶序列的一条链)。所述方法的典型的灵敏性是1-5个拷贝的突变等位基因，和大于5%的SNP:野生型比例。使用单一引物组和探针的单次测定可以检测在同一探针序列内的多个SNPs，例如，单一探针HYB_KRAS_CD12 / 13检测K-RAS密码子12和13中的所有12种突变。实施例1 =K-RAS
[0058]图1给出野生型K-RAS基因的部分序列。密码子12 / 13、16和146中的靶标区域以粗体突出显示。
[0059]K-RAS的密码子12和13易于产生大量的SNPs，导致Glyl2和/或Glyl3突变为Ser, Arg, Cys, Asp, Ala, Val。这些可能的突变和相对应的DNA序列显示在图2中。图2还显示用于检测这些SNPs的探针的序列，即HYB_KRAS_CD12 / 13。明显的是，探针序列与相关的野生型靶序列完全互补，并且与每种可能的突变序列相比具有一个错配碱基。所述错配在所述探针内部，而不是在任一末端。所述探针为hyBeacon?探针，具有一对荧光团，
当所述探针以双链的双链体存在时，与单链形式相比，所述荧光团改变其发射。荧光团的位置被标记。
[0060]图3 提供用于密码子 61 (KRAS_Gln61Leu 突变；HYB_KRAS_CD61 探针)和 146 (KRAS_Alal46Thr突变；HYB_KRAS_CD146探针)附近区域的探针、野生型和突变序列。在这些实例中，仅有单个突变等位基因和单个错配碱基。同样使用hyBeacon?探针。
[0061]图4显示HYB_KRAS_CD12 / 13探针相对于野生型DNA的解链曲线。图5显示表示与野生型和突变等位基因中的每一种杂交的CD12 / 13探针的Tm的表格。应该注意到每种Tm明显地区别于至少大部分的其他Tms，并且特别地在0.1°C的容差内，唯一可能重叠的是Glyl2Ser和Glyl3Ser，分别具有56.7和56.5°C的Tm。图6给出与野生型解链曲线相比每种⑶12 / 13等位基因的解链曲线。这些实验显示HYB_KRAS_CD12 / 13探针可以用来区分密码子12和13中每种可能的等位基因。
[0062]图7给出比较两种样品的解链曲线——一种为野生型纯合子，一种为Glyl3Arg /野生型杂合子。所述杂合子可以清楚地与纯合子区分，并且Glyl3Arg峰的温度与图6所示的温度一致。
[0063]图8和9分别显示关于KRAS密码子61和146突变体的解链曲线。
[0064]总之，这些实验证实低至单拷贝(1-5个拷贝)的测定灵敏性。解链曲线提供在密码子12，13，61和146中的突变的分析。密码子12和13中的所有12种突变均可与野生型和与彼此区分。
[0065]实施例2-EGFR
[0066]图10显示用于EGFR外显子18区域的EGFR探针序列(EGFRX18_HYB)。所述探针序列与野生型区域完全互补，而存在三个可能的SNP突变(2155G>A，2155G>T和2156G>C)，每个突变与所述探针序列不同在于单个错配的碱基。同样地，EGFRX18_HYB探针为具有两个荧光结构部分的hyBeacon?探针。
[0067]图11显示用于EGFR外显子19的EGFR探针序列(EGFRX19_HYB)。与外显子18不同，其中突变形式为SNP，外显子1`9可以携带多种缺失突变体。可能的缺失区域在图11中以粗体显示，而图12显示于多种不同长度的缺失突变体杂交的外显子19探针。该探针的下划线显示的区域不与靶标杂交，并且因此形成环。这以与在SNP中存在碱基错配大致相同的方式改变了探针:靶标双链体的Tm。Tm的改变取决于未杂交区域的尺寸，并且因此，该探针可以用于鉴定特定的突变体。
[0068]图13显示另一种EGFR探针序列，这次设计为检测外显子20中的插入和SNP突变。SNP是2303G>T，而存在三种可能的插入，在碱基2307处的9bp插入，在碱基2310和2319处的两个3bp插入。设计该探针具有与9bp的插入突变完全互补的序列；因此，当与另一些突变体杂交时，存在在所述探针中形成的9bp的环，当与3bp插入突变体中的任一种杂交时，存在在靶标中形成的3bp的环。与SNP突变体的杂交给出单个碱基错配以及9bp的探针环。选择这种排列目的是为每次可能的杂交提供清楚可区分的Tm。
[0069]图14显示设计检测外显子21中的两种SNPs (即1573T>G和2182T>A)的EGFR探针序列 EGFRX21_HYB。
[0070]图15显示来自用EGFRX19_HYB探针检测的样品的解链曲线。样品A是插入突变体，显示在59°C的特有峰，而样品B是野生型，仅显示在73°C的野生型峰。该野生型峰也在样品A中出现。包含作为对照的基因组野生型DNA也显示73°C的峰。
[0071]来自用EGFRX20_HYB探针检测的样品的解链曲线显示在图16中。所有样品均为野生型，并且显示在约66.8°C的峰。
[0072]实施例-BRAF[0073]BRAF基因包含在氨基酸600的多个潜在的SNP突变:1799T>A，G或C，以及多种突变:1799TG>AT，1798GT>AA 或 AG 和 1797AGT>GAG。hyBeacon? 探针 BRAFV600_HYB 与野生
型序列的一部分完全互补。所述探针和多种靶序列显示在图17中。
[0074]图18显示用于扩增BRAFV600区的引物序列的位置；这些是在探针区域之外。弓丨物靶标用下划线表示，并且探针靶标以粗体显示。该图显示基因组序列；所述探针将是互补的，引物中的一条也是互补的。
[0075]这些引物用来扩增多种样品，并且利用实时PCR来监测所述探针与所扩增的序列的杂交。解链曲线显示在图19中。所有样品的主峰在大约52°C，表示野生型序列。突变序列簇集大约44°C的峰。一些样品显示在这两个温度的峰，表示杂合子样品。
[0076]实施例-优先扩增突变基因型
[0077]由于针对野生型序列背景，在任意给定的样品中有少量百分比的体细胞突变，通常需要用于测定设计的系统方法来提高突变检测的性能和灵敏性。通常，需要突变的知识来靶向来自特定突变位点的扩增，并且需要多种引物用于多种突变。然而，本文公开的方法避免对这样的知识的需求。如体细胞突变一样，所述方法可以找到其他的应用；例如，低丰度的HIV耐药性变体可以增加受试者的综合抗性负担，而通常不被常规的测基因型方法识别。
[0078]本文所述的扩增方法利用不对称PCR，其优先扩增靶DNA的一条链。与常规PCR —样进行标准的热循环，但是使用有限量的一种引物(限速引物)。当该限制引物被耗尽时，通过延伸过量的引物而算术增加复制。
[0079]典型地，所述探针与非引物限制(non-primer-limited)的链互补，以使优先扩增的链可以与所述探针杂交。然后，如果发生杂交——例如，如果序列是野生型序列而不是突变序列时，则所述探针可以阻断该链的扩增。
[0080]技术人员能够设计用于所述方法的适当的引物来扩增需要的靶序列。
[0081]所用的探针在与野生型结合时具有显著高于与突变体结合时的解链温度(Tm)。这允许使用该探针作为阻断剂以防止扩增和作为报道子以报告野生型或突变序列的存在。
[0082]使用设置高于探针:野生型双链体的Tm的保持/延伸温度，可以优先使所述探针与野生型结合，而没有与突变序列的显著的杂交。还选择扩增引物的退火高于探针:突变体双链体的Tm。扩增引物与野生型和突变等位基因均结合，但是由于阻断探针，野生型的扩增显著减少。这在后续几轮的扩增中优先增加突变体的群体。
[0083]显示该过程的解链曲线显示在图20中。第一退火步骤是在高温(在本情形中，是在66.5°C)。在该阻断步骤中，探针与野生型结合并且阻断正向引物杂交。由于Tm过高，因此不存在探针与突变体的杂交。在第二退火步骤中，在较低的温度(此处，为57°C)，正向引物竞争性结合突变体。由于Tm过高，存在很少的探针与突变体的结合。
[0084]扩增方法更详细地显示在图21-23中。在第一退火(阻断)阶段(图21)，在高温进行(例如，在66.5°C)，探针阻断剂与野生型匹配并且具有比正向引物高的Tm。碱基错配显著降低阻断剂的Tm。在第二退火(引物)阶段(图21)，在低温进行(例如，在63°C )，探针与正向引物竞争，然而，由于大部分探针已经结合到野生型上，剩余的正向引物更可能与突变体结合。温度仍然太高使得探针不能结合并阻断突变序列。
[0085]图22显示通过单循环扩增反应的温度。解链阶段在95°C发生，然后温度降低至66.5°C用于阻断退火阶段。然后，进一步降低至63°C用于引物退火和延伸阶段，之后循环恢复至95°C。如在图23中所示，突变序列被扩增，而野生型被阻断。可能仍然存在一些野生型序列的扩增，但是突变序列被优先扩增，因此增加了样品中的相对丰度。
[0086]一旦样品被扩增，可以通过进行上文关于KRAS、EGFR或BRAF所述的解链曲线分析
来确定突变序列的类型。使用hyBeacon?探针或类似的探针的益处在于同一种单个探针
既阻断野生型的扩增从而富集突变序列的扩增，还在测定结束时报告野生型:突变体的比例。所述方法允许在探针区域内的任意突变序列的扩增，并且完全不依赖于任何SNP知识；SP，可以报告探针序列内的未知的SNPs。单一探针可以富集在该单一探针内的多个密码子上的SNPs和/或沿区段的多个探针内的多个密码子上的SNPs。该技术还可以用于检测插入/缺失，并且与不对称扩增相容。`
【权利要求】
1.优先扩增并检测具有至少第一和第二等位基因的基因座的第一等位基因的方法，所述方法包括: a)提供反应混合物，所述反应混合物包含: i)样品，其包含代表至少待扩增基因座的核酸； ?)寡核苷酸探针，其与第一等位基因杂交的解链温度(Tm)低于其与第二等位基因杂交的解链温度； iii)用于核酸扩增的寡核苷酸引物对，所述引物在所述寡核苷酸探针结合位点侧翼的第一和第二位点与样品中的核酸杂交；其中引物:样品的Tm高于探针:第一等位基因的Tm ； b)将所述反应混合物保持在探针:第一等位基因的Tm与探针:第二等位基因的Tm之间的温度，以使所述探针优先与第二等位基因杂交； c)对所述反应混合物进行热循环扩增，所述扩增包括解链阶段、退火阶段和延伸阶段，其中所述延伸和退火阶段的温度在探针:第一等位基因的Tm与探针:第二等位基因的Tm之间，以使所述探针在这些阶段与第二等位基因杂交；由此扩增第一等位基因；和 d)在等于或低于探针:第一等位基因的Tm的温度检测所述探针与所述样品的杂交；在更高的温度在等于或低于探针:第二等位基因的Tm检测所述探针与所述样品的杂交；并且比较二者；由此检测所扩增的第一等位基因。
2.权利要求1的方法，其中所述第一等位基因是突变等位基因，并且所述第二等位基因是野生型等位基因。
3.权利要求1或2的方法，其中所述解链阶段的温度高于引物:样品的Tm和探针--第二等位基因的Tm的温度。
4.任意一项前述权利要求的方法，其中所述基因座是多等位基因基因座；即，在所述基因座可能存在野生型等位基因和多于两种突变等位基因。`
5.权利要求4的方法，其中选择所述探针以使探针:野生型等位基因的Tm低于探针:任一突变等位基因的Tm。
6.权利要求4或5的方法，其中每种可能的探针:等位基因组合的Tm不同。
7.权利要求6的方法，其中每种组合的Tm差别至少0.1°C，优选至少0.25°C，更优选至少0.5°C，最优选至少0.75 0C。
8.任意一项前述权利要求的方法，其中所述探针与第二等位基因的一条链完全互补。
9.任意一项前述权利要求的方法，其中第一等位基因与第二等位基因的序列的不同在于一个或多个点突变。
10.任意一项前述权利要求的方法，其中第一等位基因与第二等位基因序列的不同在于多个单核苷酸多态性(SNPs)。
11.任意一项前述权利要求的方法，其中第一等位基因与第二等位基因序列的不同在于一个或多个缺失和/或插入。
12.任意一项前述权利要求的方法，其中所述探针是DNA。
13.任意一项前述权利要求的方法，其中第一等位基因与第二等位基因之间序列上的差别在所述探针结合的区域内部。
14.任意一项前述权利要求的方法，其中所述探针被标记。
15.任意一项前述权利要求的方法，其中所述探针用荧光标记进行标记，所述荧光标记根据所述探针是否已经与靶标链杂交而产生不同的信号。
16.任意一项前述权利要求的方法，其中所述基因座是多等位基因的，并且检测步骤还包括将反应混合物升温至一个或多个中间温度，并且检测在每个中间温度杂交的探针分子。
17.任意一项前述权利要求的方法，其中第一引物结合探针靶标的3’-方向，而第二引物结合探针靶标的5’ -方向。
18.任意一项前述权利要求的方法，其中引物之一以限速量提供，并且所述扩增反应是不对称PCR。
19.任意一项前述权利要求的方法，其中靶基因座选自KRAS、EGFR或BRAF人基因。
20.任意一项前述权利要求的方法，其中靶基因座选自KRAS的密码子12和13，KRAS的密码子61和KRAS的密码子146。
21.权利要求1-19中任一项的方法，其中靶基因座选自EGFR的外显子18，19，20或21。
22.权利要求1-19中任一项的方法，其中靶基因座是BRAF的氨基酸残基600以及相对应的核苷酸残基。
23.任意一项前述权利要求的方法，其中所述探针序列选自由下列各项组成的组: 5’AGTTGGAGCTGGTGGCGTAG3’ (HYB_KRAS_CD12 / 13，SEQ ID NOl)，其靶向 KRAS 的密码子12和13，` 5’AGGTCAAGAGGAGTACAGTG3’(HYB_KRAS_CD61，SEQ ID N02)，其靶向 KRAS 的密码子 61， 5’ TGTAGTCGTTTCTGTTCTGT3’ (HYB_KRAS_CD146, SEQ ID N03)，其靶向 KRAS 的密码子146,
5’ GCTGGGCTCCGGTGCGTTCG3’ (EGFRX18_HYB, SEC ID N04)，其靶向 EGFR 的外显子 18，5’ CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGGC3’ (EGFRX19HYB_DEL, SEQ IDN05)，其靶向EGFR的外显子19，
5’ CTACCGGTCGCACGGTCGCACCCTGTTGGGGGTGCACAC3，(EGFRX20_HYB, SEQ ID N06)，其靶向EGFR的外显子20， 5’TGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCG3’ (EGFRX21_HYB, SECI ID N07)，其靶向 EGFR 的外显子21，
5’ CTACAGTGAAATCTCGATGG3’ (BRAF_V600, SEQ ID N08)，其靶向 BRAF 的氨基酸 600。
24.一种寡核苷酸探针，其包括选自SEQ ID NOl至SED ID N08的核苷酸序列或由选自SEQ ID NOl至SED ID N08的核苷酸序列组成。
25.检测来自受试者的样品中体细胞突变的方法，所述样品包含来自具有至少第一和第二等位基因的基因座的核酸，所述第一等位基因是突变等位基因，所述第二等位基因是野生型等位基因，所述方法包括: a)提供反应混合物，所述反应混合物包含: i)样品； ?)寡核苷酸探针，其与第一等位基因杂交的解链温度(Tm)低于其与第二等位基因杂交的解链温度； iii)用于核酸扩增的寡核苷酸引物对，所述引物在所述寡核苷酸探针结合位点侧翼的第一和第二位点与样品中的核酸杂交；其中引物:样品的Tm高于探针:第一等位基因的Tm ； b)将所述反应混合物保持在探针:第一等位基因的Tm与探针:第二等位基因的Tm之间的温度，以使所述探针优先与第二等位基因杂交； c)对所述反应混合物进行热循环扩增，所述扩增包括解链阶段、退火阶段和延伸阶段，其中所述延伸和退火阶段的温度在探针:第一等位基因的Tm与探针:第二等位基因的Tm之间，以使所述探针在这些阶段与第二等位基因杂交；由此扩增第一等位基因； d)保持所述反应混合物的温度等于或低于探针:突变等位基因的Tm； e)保持所述反应混合物的温度高于步骤d)的温度，但是等于或低于探针:野生型等位基因的Tm;和 f)检测步骤d)和e)中杂交的探 针，由此确定所述样品中存在或不存在突变等位基因。
【文档编号】C12Q1/68GK103517992SQ201280012228
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年1月6日 优先权日:2011年1月6日
【发明者】本·科布 申请人:艾皮斯托姆有限公司