单核苷酸多态性检测用的试样核酸、单核苷酸多态性检测试样制备用的pcr引物以及用于...的制作方法

单核苷酸多态性检测用的试样核酸、单核苷酸多态性检测试样制备用的pcr引物以及用于 ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法的单核苷酸多态性检测用的试样核酸、单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法。本发明为一种单核苷酸多态性检测用的试样核酸，其具有下述(a)～(c)的特性，(a)总链长为200bp以下；(b)在5’末端、3’末端中的任意一个末端具有与模板DNA不完全互补的序列(标识序列)；(c)与用于比较单核苷酸多态性的有无的试样核酸的链长差为10bp以下。
【专利说明】单核苷酸多态性检测用的试样核酸、单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法的单核苷酸多态性检测用的试样核酸。另外，本发明涉及单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来，开发了分析已经明确与各种疾病或药的副作用相关的单核苷酸多态性(SNP ；Single Nucleotide Polymorphism)的技术,在这些开发中，简便并且在短时间内精度良好地检测单核苷酸多态性成为重要的要素。
[0003]作为分析单核苷酸多态性的方法，已知有RFLP法(限制性片段长度多态性，Restriction Fragmet Length Polymorphism)。RFLP 法为如下方法:在存在识别 PCR(聚合酶链反应，Polymerase Chain React ion)扩增产物中的基因变异部的限制酶的情况下，在共有序列部位设定引物，使在其内侧即PCR扩增产物内具有多态性，并进行扩增，用限制酶切断所得到的PCR扩增产物，根据该片段的长度判定多态性的有无。但是，由于使用限制酶，因此，存在分析成本提高、或分析整体的时间延长等课题。另外，由于通过电泳检测链长差别，因此，也存在作业变烦杂、或分析整体的时间延长等课题。
[0004]另一方面，在生物化学领域或医学领域等中，在核酸、蛋白质、多糖类这样的生物体高分子的分析中，作为能够简便并且在短时间内精度良好地检测的方法，利用离子交换色谱法。使用离子交换色谱法时，缓和对于利用电泳的测定而言必须的烦杂的作业。非专利文献I中公开了通过高效液相色谱法分离核酸相关化合物的方法。但是，在非专利文献I中公开的方法中，存在难以充分地分离单核苷酸多态性这样的具有接近的链长差的核酸的问题。
[0005]现有技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献1:日本特开2005-027518号公报
[0008]专利文献2:日本特开2006-075126号公报
[0009]非专利文献
[0010]非专利文献高速液体夕π 7卜夕'' 9 7 4 —基礎 実験(用于生命科学的高效液相色谱法基础与实验)”、广川书店、P.323 (1988)
[0011]非专利文献2 =Nature,324, p.163-166、(1986)

【发明内容】

[0012]发明要解决的问题
[0013]本发明的目的在于，提供用于迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法的单核苷酸多态性检测用的试样核酸。另外，本发明的目的在于，提供单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法。
[0014]用于解决问题的方法
[0015]本发明为具有下述(a)?(C)的特性的单核苷酸多态性检测用的试样核酸。
[0016](a)总链长200bp以下；
[0017](b)在5’末端、3’末端中的任意一个末端具有与模板DNA不完全互补的序列(标识序列)；
[0018](c)与要比较单核苷酸多态性的有无的试样核酸的链长差为IObp以下。
[0019]以下，详细说明本发明。
[0020]本发明人发现，通过使用具有特定的特性的试样核酸，能够迅速并且简便地检测单核苷酸多态性，从而完成了本发明。
[0021]AS-PCR(等位基因特异性PCR，Allele Specific-PCR)法是检测利用序列特异性的扩增反应的基因多态性(特别是单核苷酸多态性)的方法。具体而言，使想要检测的单核苷酸多态性的碱基序列成为引物的3’末端，进行PCR。在目标核酸的序列与引物完全互补的情况下，通过DNA聚合酶引起延长反应 。另一方面，在目标核酸的序列与引物不完全互补的情况下，阻碍DNA聚合酶的延长反应。这样，是使用在3’末端具有单核苷酸多态性的野生型或变异型的碱基序列的2种引物，基于扩增反应的结果，进行单核苷酸多态性的判定的方法。作为AS-PCR法，可以使用非专利文献2中公开的方法。
[0022]本发明中的AS-PCR，所使用的引物具有以下的特征。
[0023](I)正向引物使用变异型用、野生型用的2种，变异型用在3’末端具有单核苷酸多态性的碱基序列，野生型用在3’末端(相当于单核苷酸多态性部位)具有野生型的碱基序列。
[0024](2)上述2种正向引物中的一种引物在5’末端具有与目标核酸的碱基序列不完全互补的序列(以下有时称为“标识序列”)。
[0025](3)上述标识序列的链长为IObp以下。
[0026](4)上述2种正向引物以扩增产物的链长达到200bp以下的方式进行设计。
[0027](5)反向引物使用在变异型用、野生型用中共同的引物。
[0028](6)上述反向引物，在通过变异型用正向引物复制在5’末端具有标识序列的PCR扩增产物的情况下，能够在PCR扩增的第2次循环以后复制在3’末端具有标识序列的扩增产物。
[0029]在上述的引物中，示意地说明变异型用引物具有标识序列的情况下的PCR扩增反应的特征。
[0030](A)PCR扩增的第I次循环的特征如下。变异型用、野生型用的2种引物对于变异型的模板DNA、野生型的模板DNA而言分别退火后，分别进行延长反应，分别复制变异型DNA、野生型DNA。此时，被复制的变异型DNA相对于被复制的野生型DNA，仅标识序列的链长部分总链长长。
[0031](B)PCR扩增的第2次循环以后的特征如下。反向引物在变异型DNA的复制产物(在5’末端具有标识序列)以及野生型DNA的复制产物分别退火后，进行延长反应，分别复制变异型DNA、野生型DNA。此时，通过反向引物复制的变异型DNA，也相对于被复制的野生型DNA，仅标识序列的链长部分总链长长。
[0032]这样得到的仅标识序列部分总链长不同的2种PCR扩增产物，通过后述的离子交换色谱法进行分离分析。
[0033]上述示意的说明中，以2种PCR扩增产物能够通过离子交换色谱法进行分离分析作为限度，可以在变异型用引物、野生型用引物二者上附加标识序列，除了通常使用的引物应该具备的特性之外，不限于标识序列，这对于本领域技术人员而言能够容易地理解。
[0034]需要说明的是，正向引物、反向引物的用词以本发明的【技术领域】中的通常的含义进行使用，正向引物使用在变异型用、野生型用中共同的引物，反向引物中变异型用的在5’末端附加标识序列这样的形态当然也包括在本发明的范围内。
[0035]以往，在引物上付加与本发明同样的标识序列的情况下，以非特异反应的避免(专利文献I)、利用标识探针的检测(专利文献2)为目的，没有作为离子交换色谱法用的试样、特别是单核苷酸多态性的检测用试样的例子。
[0036]如上所述，本发明中，提供单核苷酸多态性检测用的试样核酸、单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法。
[0037]本发明的单核苷酸多态性的检测方法中，使用离子交换色谱。
[0038]用于离子交换色谱法的洗脱液，优选含有由下述式(I)所示的胍衍生的胍盐。
[0039]
【权利要求】
1.一种单核苷酸多态性检测用的试样核酸，其具有下述(a)?(C)的特性，(a)总链长为200bp以下；(b)在5’末端、3’末端中的任意一个末端具有与模板DNA不完全互补的序列，该序列为标识序列；(c)与要比较单核苷酸多态性的有无的试样核酸的链长差为IObp以下。
2.根据权利要求1所述的试样核酸，其中，(d)标识序列的链长为IObp以下。
3.根据权利要求1或2所述的试样核酸，其用于离子交换色谱法分析。
4.一种单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物，其具有下述(a)?(c)的特性，(a)在用于AS-PCR法的情况下，复制总链长200bp以下的扩增产物；(b)在5’末端具有与模板DNA不完全互补的序列，该序列为标识序列；(c)标识序列的链长为 IObp以下。
5.一种用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法，其特征在于，使用权利要求4所述的PCR引物。
【文档编号】C12N15/09GK103443274SQ201280014783
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2012年3月30日 优先权日:2011年3月31日
【发明者】与谷卓也, 清远英司, 牛泽幸司 申请人:积水医疗株式会社